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Biology

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Abstract

Zanzare vettore infliggono sofferenze più umano di qualsiasi altro organismo - e uccidono più di un milione di persone ogni anno. I progetti genoma zanzara facilitato la ricerca in nuove sfaccettature della biologia della zanzara, inclusi studi genetici funzionali nel primario malaria vettore africano Anopheles gambiae e la dengue e la febbre gialla vettore Aedes aegypti. RNA interferenze (RNAi-) mediato silenziamento genico è stato utilizzato per colpire geni di interesse in entrambe le specie di zanzare vettori della malattia. Qui, descriviamo un procedimento per la preparazione di chitosano / interferenti nanoparticelle RNA che si combinano con il cibo e ingerite dalle larve. Questo tecnicamente semplice, ad alta velocità, e la metodologia relativamente poco costoso, che è compatibile con lunghi RNA a doppio filamento (dsRNA) o piccole interferenti RNA (siRNA) molecole, è stato utilizzato per il colpo di successo di diversi geni in A. gambiae e A. aegyptilarve. Dopo poppate larvali, atterramento, che viene verificata attraverso qRT-PCR o ibridazione in situ, possono persistere almeno fino alla fase avanzata di pupa. Questo metodo può essere applicabile ad un'ampia varietà di zanzare ed altri specie di insetti infestanti, compresi agricoli, nonché altri organismi non-modello. Oltre alla sua utilità nel laboratorio di ricerca, in futuro, chitosano, un polimero poco costoso, non tossico e biodegradabile, potrebbero essere utilizzati nel campo.

Introduction

Zanzare sanguigni che alimentano vettore dei generi anofele e Aedine trasmettere agenti patogeni responsabili di alcuni dei peggiori flagelli dell'umanità. Si stima che 3,4 miliardi di persone sono a rischio di contrarre la malaria, che è responsabile di oltre mezzo milione di morti ogni anno in tutto il mondo. Risultati malaria da infezione da Plasmodium sp. Parassiti, che sono trasmessi alle persone attraverso le punture di zanzare infette del genere Anopheles, tra cui il principale vettore africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti è la zanzara vettore primario per il virus dengue, che causa la febbre dengue, una malattia febbrile aspecifica che è la più diffusa e significativa malattia arbovirali nel mondo. Virus dengue è attualmente una minaccia per la> 2,5 miliardi di persone ai tropici, con un inciden annualece di circa 50 milioni di casi con conseguente ~ 24.000 decessi all'anno ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Nonostante l'impatto globale devastante di malattie trasmesse dalle zanzare sulla salute umana, mezzo efficace per prevenire e curare queste malattie sono carenti. Controllo delle zanzare è attualmente il miglior metodo di prevenzione delle malattie.

Il potenziale per il controllo delle malattie trasmesse da artropodi di manipolazione genetica degli insetti vettori è stato riconosciuto da più di quattro decenni 3. Ceppi transgenici di A. aegypti progettato per avere un reprimibile specifico femminile di volare fenotipo hanno recentemente fatto il potenziale per l'utilizzo di strategie di controllo vettoriale transgenici una realtà 4-6. Questi progressi hanno sfidato i ricercatori di individuare bersagli genetici nuovi per il controllo vettoriale e ulteriori mezzi di manipolare la funzione del gene in zanzare vettore. L'alterazione di espressione genica durante sviluppo, come è avvenuto in zanzare femmina-volare 4, può favorire il chiarimento delle nuove strategie di controllo vettoriale. Tuttavia, soprattutto a causa sfide tecniche, le funzioni di pochissimi geni sono stati caratterizzati durante lo sviluppo di A. gambiae, A. aegypti, o altre specie di zanzare.

Fin dalla sua scoperta nel C. elegans 7, interferenza RNA (RNAi), che viene conservata in animali, piante e microorganismi, è stato ampiamente utilizzato per studi genetici funzionali in un'ampia varietà di organismi, compresi gli insetti 8,9. Il percorso RNAi è iniziata da Dicer, che scinde lungo dsRNA in brevi 20-25 siRNA nucleotidi a lungo che funzionano come specifica sequenza RNA interferenti. geni silenzio siRNA complementari in sequenza attraverso la promozione di fatturato trascrizione, scissione, e la rottura di traduzione 9. Molecole dsRNA lunghi (in genere 300-600 bp) o siRNA targeting personalizzato una particulasequenza r può essere utilizzato in laboratorio ricerca di silenziamento qualsiasi gene di interesse. Gestendo quando interfering RNA viene consegnato, i ricercatori possono controllare il momento in cui silenziamento genico iniziati. Questo vantaggio è utile in quanto può essere utilizzato per superare sfide come letalità sviluppo o sterilità, che possono ostacolare la produzione e manutenzione di ceppi recanti mutazioni ereditarie, un processo costoso e laborioso che non è ancora disponibile in tutte le specie di insetti. Benché il grado di silenziamento genico da RNAi può variare da gene gene, tessuto a tessuto e animale all'altro, RNAi è ampiamente usato per analisi funzionale di geni in zanzare ed altri insetti 8,9.

Tre interferenti strategie consegna RNA sono state utilizzate in zanzare: microiniezione, ammollo / applicazione topica, e l'ingestione. Per una storia dettagliata e confronto tra l'utilizzo di queste tre tecniche di insetti, consultare Yu et al 8. We hanno utilizzato con successo la microiniezione 10 come un mezzo per trasmettere siRNA per indirizzare geni dello sviluppo in A. embrioni aegypti, larve, pupe e 11-14. Tuttavia, questa strategia consegna intensità di lavoro richiede sia una configurazione microiniezione e una mano esperta. Inoltre, microiniezione è stressante per l'organismo, un fattore di confusione, in particolare quando saranno valutati fenotipi comportamentali. Infine, la consegna microiniezione non può essere esteso al campo per il controllo vettoriale. In alternativa, l'organismo ammollo in soluzione RNA interferente è anche diventare un mezzo popolare di indurre silenziamento genico, come è conveniente e richiede attrezzature poco o di lavoro. Ammollo è stata applicata principalmente nella linea cellulare di insetto studia 8, ma in un recente studio, l'abbattimento è stato raggiunto in A. aegypti larve immerso in una soluzione di dsRNA 15, che gli animali sembravano ingestione. Tuttavia, per gli studi che coinvolgono l'analisi di molteplici experimentagruppi litri o fenotipi, immersione è piuttosto costoso. Lopez-Martinez et al. 16 descritto reidratazione guidato RNAi, un nuovo approccio per la consegna interferenza RNA che coinvolge la disidratazione in soluzione salina e reidratazione con una sola goccia di acqua contenente RNA interferenti. Questo approccio non tagliare i costi associati con tutto immersione animale, ma è più costoso di microiniezione e può essere limitata nella sua applicazione alle specie che possono tollerare alte pressioni osmotiche. Inoltre, è difficile immaginare come immersione o disidratazione / reidratazione metodologia immersione potrebbero essere adattati per il controllo vettoriale nel campo. Per queste ragioni, per studi post-embrionali, la consegna di RNA interferenti con il cibo ingerito è una strategia valida alternativa.

Benché le strategie basate ingestione-non funzionano in tutte le specie di insetti, forse in particolare Drosophila melanogaster, la consegna orale di RNA interferenti mescolato al cibo ha promosso gene silencing in una varietà di insetti 8,17, comprese A. adulti aegypti 18. Abbiamo descritto chitosano nanoparticelle mediata RNAi in A. gambiae larve 19 e hanno applicato con successo questo approccio per la riduzione dell'espressione genica in A. aegypti larve 20,21. Qui, metodologia per questa procedura RNAi, che comporta intrappolamento di interferire RNA dal chitosano polimero, è dettagliato. Chitosano / RNA interferenti nanoparticelle sono formate da auto-assemblaggio di policationi con interferenza RNA attraverso le forze elettrostatiche tra cariche positive dei gruppi amminici in chitosano e cariche negative portate dai gruppi fosfato sul backbone di interferire RNA 19. La procedura descritta è compatibile con entrambe le molecole dsRNA lunghi (di seguito denominati dsRNA) o doppio filamento siRNA (di seguito denominato siRNA). A seguito di sintesi, chitosano / interferenti nanoparticelle RNA sono mescolati con il cibo larvale e consegnatilarve per ingestione. Questa metodologia è relativamente poco costoso, richiede poca attrezzatura e del lavoro 19, e facilita l'analisi high-throughput di più fenotipi, compresa l'analisi dei comportamenti 20,21. Questa metodologia, che può essere adattato per studi silenziamento genico in altri insetti, compresi altri vettori di malattie e parassiti agricoli insetti, potrebbe essere utilizzato per il silenziamento genico in una varietà di altre specie animali. Inoltre, chitosano, un poco costoso, non tossico e biodegradabile polimero 22, potrebbe potenzialmente essere utilizzato nel campo del controllo della zanzara specie-specifico.

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Protocol

1. Mosquito Specie e allevamento

  1. Mantenere A. gambiae G3 e A. ceppi aegypti Liverpool IB12 (utilizzati negli studi rappresentativi sotto) o da altri ceppi di interesse secondo prassi di laboratorio standard o come descritto in precedenza 23,24.

2. dsRNA e siRNA Progettazione e Produzione

  1. Primer design per costruire modelli lunghi dsRNA specifiche per il gene di interesse. Utilizzare lo strumento E-RNAi 25. Produrre dsRNA secondo il metodo di scelta o come descritto in precedenza 19.
    1. Per un controllo negativo, sintetizzare dsRNA 19 corrispondente alla sequenza della proteina fluorescente verde (GFP), β-galattosidasi (β-gal), o qualche altro gene non espresso in zanzare. Se lo si desidera, dsRNA 19 utilizzato per generare i risultati rappresentativi riassunte di seguito può essere utilizzato come controllo positivo. Conservare dsRNA disciolto in acqua priva di RNAse a -80 °; C fino al momento dell'uso.
  2. In alternativa, il design siRNA specifici gene secondo la prassi di laboratorio standard o come descritto in precedenza 10. Rimescolare la sequenza di un knockdown siRNA progettare siRNA controllo negativo che non corrisponde a qualsiasi gene zanzara. Acquistare i siRNA personalizzati, disponibili attraverso una serie di fornitori affidabili.
    1. Se lo si desidera, siRNA 20,21 utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi riassunte di seguito possono essere utilizzati come controlli positivi. Conservare siRNA disciolto in acqua RNase-free a -80 ° C fino al momento.

3. Preparare chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

  1. Raccogliere RT 100 mM sodio solfato pre-made (100 mM Na 2 SO 4 in H 2 O deionizzata) e 0,1 M di acetato di sodio (0,1 M NaC 2 H 3 O 2 -0.1 M acido acetico, pH 4,5 in deionizzata H 2 O) buffer.
  2. Sciogliere chitosano (≥75%deacetilato) in tampone acetato 0,1 M di sodio per rendere 0,02% (w / v) Soluzione di lavoro e mantenere la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Sciogliere dsRNA o siRNA in 50 ml di acqua deionizzata H 2 O e aggiungere al buffer solfato di sodio 100 mM per ottenere una soluzione a 100 ml di 32 mg di dsRNA / siRNA per 100 ml di 50 mM solfato di sodio.
  4. Aggiungere 100 pl di soluzione di chitosano alla soluzione dsRNA / siRNA e poi riscaldare la miscela in un bagno di acqua a 55 ° C per 1 min. Impostare un controllo aggiungendo 100 ml di 50 mM sodio solfato a 100 ml di soluzione di chitosano e seguire la stessa procedura.
  5. Mescolare le soluzioni immediatamente per 30 sec nel vortex ad alta velocità a RT per facilitare la formazione di nanoparticelle.
  6. Centrifugare la miscela a 13.000 xg per 10 min a RT, dopo di che una pastiglia deve essere visibile. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Asciugare il pellet per ≈10 min a RT prima di utilizzarla per preparare il cibo zanzare.
  7. Misura la concentrazione di dsRNA / siRNA nel surnatante utilizzando il surnatante dal controllo (cfr 3,5) come uno spazio vuoto per calcolare la quantità totale di dsRNA / siRNA che è rimasto nel surnatante. Utilizzare la differenza tra gli importi di base delle dsRNA / siRNA e gli importi residui nei sopranatanti per calcolare la percentuale di dsRNA / siRNA intrappolato in nanoparticelle. Questa efficienza di caricamento è normalmente superiore al 90%.
  8. Ripetere la stessa procedura se sono necessari ulteriori nanoparticelle. Utilizzare immediatamente le nanoparticelle secche. L'impatto di conservazione frigorifera di particelle prima dell'uso non è stata valutata.

4. Preparazione Mosquito alimentare contenente chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

  1. Preparare 1 ml di una soluzione di agarosio al 2% (w / v) in acqua deionizzata, sciogliere l'agarosio, e conservare la soluzione di agarosio fuso in un bagno di acqua 55 C prima dell'uso.
  2. Mescolare fiocchi alimentari di pesce (47% di proteine ​​gregge, min. 10% grassi greggi, max. Fibra grezza 3%) e lievito secco in unrapporto di 2: 1 (w / w). Macinare il composto a piccole particelle con un mortaio e pestello (percorribile attraverso n ° 50 USA setaccio di prova standard). Utilizzare il cibo a terra, che dovrebbe essere di colore marrone, immediatamente o conservarla in un contenitore sigillato a 4 ° C per diverse settimane.
  3. In una provetta da 1,5 ml, mescolare 6 mg di cibo a terra con le nanoparticelle secche Sezione 3.7 con uno stuzzicadenti.
  4. Aggiungere 30 ml di soluzione di gel di agarosio 2% pre-fusa alla miscela alimentare nanoparticelle; mescolate immediatamente e accuratamente utilizzando una punta stuzzicadenti o pipetta.
  5. Utilizzare il gel contenente cibo e nanoparticelle per alimentare immediatamente le larve di zanzara. In alternativa, una volta che il gel è completamente solidificato a temperatura ambiente, memorizzare il gel a 4 ° C e utilizzare il giorno successivo, oa -80 ° C per un uso successivo.

5. Alimentazione Mosquito Larve con alimenti contenenti chitosano / RNA interferenti nanoparticelle

  1. Alimentazione A. gambiae larve di zanzara:
    1. Rimuovere un single gel pellet dal tubo di 1,5 ml con uno stuzzicadenti e tagliarlo a 6 fette uguali con una lama di rasoio pulito o stuzzicadenti.
    2. Trasferimento 20 larve al terzo stadio di una piastra di Petri da 500 ml contenente 100 ml di acqua deionizzata.
    3. Feed le larve della zanzara aggiungendo una fetta di pellet gel (tritato in pezzi più piccoli) a piatto Petri una volta al giorno per quattro giorni. Assicurarsi di osservare l'alimentazione delle larve sul pellet, che dovrebbe essere ridotto significativamente in dimensioni o del tutto assente dal giorno successivo. Dopo il tempo, le zanzare si svilupperà in fine del quarto larve instar.
    4. Registrare eventuali modifiche fenotipiche visibili durante l'esperimento. Esaminate i livelli di trascrizione e altre variazioni fenotipiche come discusso nella sezione 6 alla fine del periodo di quattro giorni.
  2. Alimentazione A. aegypti larve di zanzara:
    1. Tagliare il pellet di gel in 6 fette uguali con una lama di rasoio pulito o stuzzicadenti.
    2. Posizionare i 50 anni-sincronizzato 24 ore dopo la schiusa delle uova fiprima instar larve in una capsula di Petri in ≈40 ml di acqua deionizzata.
    3. Larve si nutrono una fetta per ogni capsula di Petri per 4 ore / giorno, quindi trasferire le larve di nuovo alla dieta larvale regolare di 2: 1 a terra fiocchi alimentari di pesce e di lievito secco per il resto della giornata. Ripetere quotidianamente nei quattro stadi larvali.
    4. Esaminare i livelli di trascrizione e di altri cambiamenti fenotipici come discusso nella sezione 6 nei punti di tempo di sviluppo desiderati.

6. Conferma di Gene Knockdown

  1. Relativa trascrizione quantificazione da qRT-PCR in A. aegypti e A. gambiae larve.
    1. Eseguire ed analizzare saggi qRT-PCR con tre repliche biologiche su almeno il 10 pool di controllo contro le larve sperimentale riportato 11,19,20, o secondo procedure di laboratorio standard. I risultati rappresentativi sono stati inseriti.
    2. Per l'analisi di una parte particolare tipo di tessuto / corpo (es., Il cervello o antenna), PERFOrm qRT-PCR come descritto nella seguente 6.1.1 dissezione per recuperare il tessuto di interesse (ad esempio, vedere Mysore et al. 21).
  2. Conferma della atterramento da ibridazione in situ
    1. Sintetizzare antisenso digossigenina marcato e percepire riboprobes controllo secondo le prassi di laboratorio standard o come descritto 26.
    2. Eseguire ibridazione in situ per il protocollo Haugen et al. 27 per la conferma di atterramento come descritto in precedenza 11,20 e discusso nella sezione risultati rappresentativi di seguito.
  3. La conferma di atterramento immunoistochimica
    1. Se sono disponibili anticorpi contro il prodotto proteico del gene targeting, eseguire immunoistochimica come descritto in precedenza 28, che facilita l'identificazione dei soggetti con i maggiori livelli di knockdown per l'analisi del fenotipo 20 come esemplificato nella representative la sezione risultati qui sotto.

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Representative Results

A. gambiae:

Nanoparticelle Chitosan / dsRNA si formano a causa della interazione elettrostatica tra i gruppi amminici del chitosano ei gruppi fosfato di dsRNA. L'efficienza di dsRNA incorporazione in nanoparticelle è generalmente superiore al 90% come misurato dalla deplezione del dsRNA dalla soluzione. Immagini microscopia a forza atomica mostrano che il chitosano-dsRNA medie dimensioni delle particelle 140 nm di diametro, che vanno 100-200 nm (Figura 1).

Figura 1
Figura 1. nanoparticelle formazione da chitosano e interfering RNA. A forza atomica immagine al microscopio di nanoparticelle chitosano / dsRNA (A) o soluzione di chitosano senza l'aggiunta di dsRNA (B). Le dimensioni delle immagini era 1.0 micron × 1,0 micron. Bar Scala = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Alimentazione di queste particelle che vengono combinati con il cibo larvale standard incorporati in agarosio supporta normale sviluppo larvale. È importante sottolineare che specifica knockdown di ectoderma derivato AgCHS1 trascritti nonché AgCHS2 specifico midgut (Figura 2) è possibile 19, dimostrando che dsRNA ripreso attraverso l'ingestione di nanoparticelle iniziati RNAi oltre la midgut. Efficienze Knockdown ≈40-60% sono stati osservati (ad es., Figura 2) e variano tra trascrizioni.

Figura 2
Figura 2. livelli di trascrizione di chitina sintasi 2 (AgCHS2) dopo l'ingestione in dsRNA <em> A. gambiae larve. livelli di mRNA relativi di AgCHS2 in larve si nutrono di nanoparticelle con ds AgCHS2 o ds controllo GFP. I dati sono presentati come media ± SD di tre repliche biologiche indipendenti. Diverse lettere su barre indicano differenze significative in base a test t accoppiati (P = 0.003).

Knockdown di AgCHS1 ridotto significativamente il contenuto totale di chitina quarto larve instar e aumenta la suscettibilità alla insetticida inibitore della sintesi della chitina, diflubenzurone 19, Knockdown di AgCHS2 aumentato significativamente l'effetto di calcofluor bianco e ditiotreitolo che interrotto la matrice peritrofica (PM) in quarta instar larve (figura 3) con conseguente aumento della mortalità 17.

Figura 3
AgCHS2 ingerito nanoparticelle su A. gambiae matrix peritrofica (PM) permeabilità. Calcofluor trattamento bianco o DTT sconvolge il PM di A. gambiae larve che è ulteriormente era traboccante da AgCHS2 atterramento attraverso l'ingestione del chitosano / dsRNA nanoparticelle 19. (A) Mosquito con PM intatto. (B) Mosquito con PM perturbato, destrano blu perde nella ceacae gastrica.

A. aegypti:

Chitosano / nanoparticelle siRNA sono stati usati per indirizzare il gene guida degli assoni semaphorin-1a (sema1a) durante A. aegypti sviluppo larvale 20. Knockdown di sema1a è stata confermata attraverso l'ibridazione in situ, che ha rilevato ha ridotto i livelli di sema1a in ≈60% dei cervelli larvali culonon elaborato e non è riuscito a rilevare l'espressione sema1a in ≈40% dei cervelli animali atterramento (Figura 4C vs. B; freccia gialla indica il lobo antennale). saggi qRT-PCR eseguiti su animali interi pool rivelato che questa tecnica ha comportato 32 riduzione del ± 10% in trascrizioni sema1a rispetto al controllo-nanoparticelle animali alimentati (Figura 4A; P <0,01 basato sul test t accoppiato, N = 5, dove N è il numero di repliche biologiche). Knockdown nel cervello persisteva attraverso almeno 24 ore di sviluppo pupa, come evidenziato dalla perdita di espressione di anticorpi anti-Sema1a (Figura 4E1 vs. D1), che è stato utilizzato per identificare gli animali con significativa atterramento nel corso analizza larvale e pupa fenotipo olfattiva. Difetti lobo antennali larvali e pupe (quantificati in Tabella 1) sono stati rilevati in sema1a atterramento larve e pupe (Figura 4E2, E3 vs. (Figura 4E2 vs. D2, visualizzata con mAbnc82; sovrapposizioni di entrambi i segnali sono mostrati nella Figura 4D3, E3). Fenotipi comparabili sono stati generati con due sema1a separati siRNA smontabile, che ha contribuito a garantire che i difetti osservati non erano il risultato di off-targeting per sito da una siRNA. I più alti livelli di atterramento sono stati generati quando sono stati combinati i siRNA, una strategia che può essere utilizzato per aumentare l'efficienza atterramento (vedi Mysore et al. 20 per maggiori dettagli).

Figura 4
Figura 4. Il chitosano / siRNA indotto atterramento di sema1a nel sistema olfattivo sviluppo di A. aegypti. QRT-PCR (A) e ibridazione in situ (B, C) ​​saggi confermato atterramento di sema1a in larve alimentato da una miscela di sema1a di targeting siRNA 890 e siRNA 1198 chitosano / interferenti RNA nanoparticelle contro nanoparticelle di controllo. Perdita di espressione Sema1a provocato glomeruli che sono deformati (E1-3 vs. D1-3). Vedere il testo per i dettagli. Dorsale è in tutti i pannelli. Bar Scala = 25 micron. Questa figura è originariamente apparso in Mysore et al 20. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Larve Pupe
siRNA n <strong> Wildtype Difetti AL n Tipo selvatico Difetti AL
Controllo 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tabella 1. La quantificazione dei difetti del lobo antennali seguenti atterramento sema1a. Una sintesi compilato dei risultati ottenuti per il controllo siRNA vs. sema1a atterramento (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 chitosano nanoparticelle-alimentato gli animali provenienti da un totale di otto esperimenti replicati eseguiti sia in larve ( è mostrato a sinistra) e pupe (destra). Il totalesono indicati il ​​numero di individui valutati (n) e numeri / percentuali di animali che presentano wild type morfologia vs. lobo antenne (AL) difetti (difetti di targeting neurone recettore olfattivo, neuropilo difettoso e formazione glomeruli). Knockdown è stata verificata immunoistochimica con anticorpi anti-Sema1a colorazione in un sottoinsieme di animali (15 larve e pupe 10), che hanno mostrato i difetti più gravi (indicato con *). Tutti gli animali abbattibili valutati in questo modo sono stati trovati ad aver ridotto i livelli di Sema1a, mentre i livelli Sema1a negli animali di controllo alimentati non sono stati notevolmente modificati. Questa tabella è originariamente apparso in Mysore et al 20.

In una seconda indagine sono stati utilizzati 21, chitosano / nanoparticelle siRNA di indirizzare il fattore di trascrizione Single-minded (Sim) durante lo sviluppo del sistema olfattivo. saggi qRT-PCR con cervelli pool sezionati da animali interi indicato che il cervello atterramento sim hanno avuto in media un 47% reductisu in trascrizioni sim rispetto agli animali di controllo nanoparticelle nutriti (P = 0.005 basato sul test t accoppiato). Test comparabili con antenne rivelati in media una riduzione del 77% dei livelli di sim rispetto per gli animali (P = 0.002 basato sul test t accoppiato) controllare-alimentati. Nonostante una certa variabilità dei livelli di knockdown tra tessuti e animali, trascrizioni sim non sono stati rilevati mediante ibridazione in situ in ≈50% del knockdown cervelli animali / antenne seguito al trattamento con una di due diverse siRNAs abbattibili (Figura 5B2, B3, C2, C3 vs B1, C1, tabella 2). In lievito test comportamentali nel corso della quale gli individui che sono stati attratti da lieviti sono stati assegnati un punteggio di 1, mentre gli animali che non sono stati attratti hanno ricevuto un punteggio di 0, i punteggi medi per sim 430 o SIM 718 animali erano knockdown significantly inferiore a quella di animali di controllo alimentati in due esperimenti replicati (Figura 5A; P <0,001 basato sul test t accoppiato). Defective-odore tracciamento comportamento (Figura 5A) correlato con livelli ridotti di sim nel antenne (Figura 5B2, B3 vs B1) e cervello (Figura 5C2, C3 vs C1, puntini gialli segnano il perimetro del lobo antennale; vedi tabella 2 per la quantificazione dei risultati). Difetti multipli sono stati identificati nel antenne e lobi delle antenne di animali abbattibili sim (vedi Mysore et al 21 per maggiori dettagli.). Ad esempio, sim larve e pupe atterramento mancava espressione di Orco, l'obbligato co-recettore per tutti i recettori olfattivi di neuroni olfattivi (Figura 6). Livelli di trascrizione Orco ridotti sono stati rilevati in individui alimentati con sim 430 ( Figura 6A3, B3) o sim 718 (Figura 6A4, B4) atterramento (KD) chitosano / nanoparticelle siRNA (confrontare per tipo di animali selvatici in figura 6A1, B1 e controllare chitosano / siRNA nanoparticelle nutriti gli animali nella Figura 6A2, B2). La perdita di espressione Orco fenotipo osservato in L4 (Figura 6A1-A4) persistito attraverso almeno 24 ore dopo la formazione di pupa (Figura 6B1-B4).

Figura 5
Figura 5. sim atterramento spettacolo larve difettoso comportamento odore-attrattivo. L'ibridazione in situ ha rivelato livelli ridotti di RNA sim nel antenne (B2, B3) e cervello (C2, C3) di sim 430 e sim 718 animali knockdown (confrontare per controllare nutriti in B1, C1), che non è riuscito a rispondere al lievito odorizzante attrattivo (A). Vedere il testo per i dettagli. Le estremità prossimali delle antenne sono orientate verso l'alto in B1-B3. Dorsale è orientata verso l'alto in C1-C3. Bar Scala = 25 micron. Questa figura è originariamente apparso in Mysore et al 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. La perdita di espressione Orco in A. sviluppo antenna aegypti seguito atterramento di sim. livelli ridotti di orco trascrizione sono stati rilevati in individui fed con sim 430 (A3, B3) o sim 718 (A4, B4) atterramento (KD) chitosano / nanoparticelle siRNA (confrontare per tipo animali selvatici in A1, B1 e controllare chitosano / siRNA nanoparticelle nutriti gli animali in A2, B2). Vedere il testo per i dettagli. Bar Scala = 25 micron. Questo dato è stato compilato da immagini pubblicate in Mysore et al 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Attratto Non Attratto
siRNA n # Animali Normale Moderato Nullo # Animali Normale Moderato Nullo
Controllo 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tabella 2. Livellos di sim e la performance larvale in un test comportamentale lievito. Una sintesi compilato dei risultati ottenuti in quattro lievito odorizzante attractant replicare gli esperimenti è mostrato. Il numero totale di animali (n) indica il numero di larve individuale che sono stati testati in questi saggi comportamentali. Il numero di larve individuale (# Animali) che sono stati attratti (a sinistra, gli animali che hanno toccato il pellet lievito e sono stati assegnati un punteggio di 1) o non ha attirato (a destra, animali che non toccano il pellet di lievito e ha ricevuto un punteggio di 0) sotto ogni condizione (controllo, sim 430 KD, o sim 718 KD chitosano / siRNA nanoparticelle-fed) vengono visualizzati, e le percentuali di animali in totale sono inclusi i seguenti numeri grezzi. Knockdown di sim è stata valutata attraverso l'ibridazione in situ nel cervello e le antenne degli animali ha attirato (a sinistra) o non ha attirato (a destra) per il lievito. Ilnumero grezzo / percentuale di individui con normale (paragonabile con il tipo selvatico livelli di trascrizione sim), Null (senza sim trascrizione osservabile), o moderata (ridotto ma non wild type) i livelli di sim sono indicati. Perdita di sim correlata bene con una mancanza di attrazione per il lievito. Questa tabella è originariamente apparso in Mysore et al 21.

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Discussion

Il chitosano / interferenti metodologia nanoparticelle RNA qui descritto è stato utilizzato per indirizzare efficacemente i geni durante lo sviluppo larvale in A. gambiae (figure 2, 3) e A. aegypti (figure 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Nanoparticelle chitosano possono essere preparati sia con lunghi dsRNA o siRNA, entrambi i quali sono stati utilizzati con successo in zanzare, come dimostrano i risultati rappresentativi qui descritti. Sintesi di dsRNA è meno costoso rispetto all'acquisto di siRNA, ma è più alta intensità di manodopera. Se / siRNA si utilizza chitosano, fenotipi può essere confermata con più siRNA, consentendo una migliore garanzia che il fenotipo scoperta non è dovuta a off-site targeting. Inoltre, la produzione commerciale di siRNA in massa può meglio favorire la crescita di chitosano / interfering RNA silencing per specie-specifico controllo delle zanzare al campo. Ovviamente questo richiede il superamento obstaCles come il costo e la consegna.

Anche se abbiamo avuto un buon successo con questo protocollo, le metodologie devono essere ottimizzati per ogni gene. Per questo motivo, si consiglia di testare molteplici siRNA, o forse uno siRNA e una lunga dsRNA, al momento della comparsa di un nuovo progetto. Una volta fenotipi sono identificati e confermati con almeno due distinte siRNAs corrispondente ad un gene di interesse, può essere utile combinare questi siRNAs per aumentare fenotipo penetranza (Figura 4). La tempistica e anche la durata di chitosano / interferenti tempo di alimentazione RNA possono essere ottimizzati per ciascuno studio. A. gambiae prosperare se somministrate solo con chitosano / interferenti cibo RNA come qui descritto. Tuttavia, negli esperimenti abbiamo effettuato sinora, A. aegypti non sono cavata bene senza alimentazione supplementare, un problema che abbiamo superato con il conferimento ad una dieta di cibo normale dopo 4 ore di chitosano / interferenti alimentazione RNA. Esperimenti con chitosano / interferentiConsegna RNA in un diverso substrato alimentare, che non abbiamo ancora tentato, può aggirare questo problema. Abbiamo scoperto che 4 h poppate al giorno nel corso di diversi giorni determinano un buon equilibrio tra atterramento e una nutrizione adeguata, ma la modifica della durata di alimentazione potrebbe essere perseguita ulteriormente come desiderato. Inoltre, il stadio larvale in cui viene iniziata / continued chitosano / interferente alimentazione nanoparticelle RNA può essere adattato per ciascun esperimento seconda del periodo di sviluppo critico in cui viene esaminato funzione genica, un importante vantaggio di questo protocollo.

La verifica di knockdown è ovviamente fondamentale, ma può anche richiedere la risoluzione dei problemi. Per questo motivo, può essere utile controllare simultaneamente se vengono generati come viene valutata l'efficienza knockdown fenotipi di interesse. Per gli esperimenti di convalida qRT-PCR, è fondamentale che i primer e le condizioni di PCR sono ottimizzati. Inoltre, è importante che gli animali sono evolutivamentesincronizzato al momento della comparsa dell'esperimento, come espressione di alcuni trascritti può essere molto dinamico durante lo sviluppo e per ritmi circadiani 29. Inoltre, mentre questa tecnica genera chiaramente atterramento oltre l'intestino, stiamo cominciando soltanto a valutare i tessuti per i quali questa tecnica è efficace, e puo 'variare da specie a specie. Sarà quindi utile per misurare atterramento in particolare di tessuti, che possono essere ottenuti sezionando i tessuti di interesse da animali interi per qRT-PCR test o tramite ibridazione in situ (figure 4-6) 20,21 e immunoistochimica (Figura 4) 20 saggi (vedi Haugen et al. 27 e Clemons et al. 28, rispettivamente, per la risoluzione di questi protocolli). Dal atterramento varia da individuo a individuo, è utile effettuare saggi doppio etichettatura per valutare fenotipi in combinazione con livelli atterramento (Figuri 4) 20, che facilita notevolmente la caratterizzazione fenotipo. Per gli studi comportamentali, i livelli di atterramento in singoli animali possono essere correlati con le loro performance comportamentali (Tabella 2) 20,21.

A seguito chitosano-mediata interferenza consegna RNA a A. aegypti larve, espressione genica ridotta viene rilevata a 24 ore di sviluppo pupa (figure 4, 6) 20,21. Anche se i livelli di espressione genica non sono ancora stati valutati in modo dettagliato oltre questo punto di sviluppo, sono stati rilevati livelli ridotti di espressione genica in entrambi 48 e 72 h A. aegypti pupe (KM, inedito). Sarebbe utile per perseguire più dettagliate analisi dei livelli di atterramento in più fasi di A. aegypti sviluppo pupa e anche per valutare A. gambiae pupe. Sarebbe anche interessante verificare se atterramento persiste negli adulti e di esplorare nanoparticelle-mediata interfering strategie consegna RNA per le zanzare adulte.

Sono stati recentemente introdotti site-specific gene nucleasi mira approcci alla A. aegypti e A. gambiae e sono permettendo la generazione di mirati, mutazioni ereditarie nelle zanzare e altri organismi modello non genetici 30,31. Sebbene l'uso di questi approcci permette la perdita più uniforme della funzione fenotipo analisi, un vantaggio rispetto agli approcci RNAi, screening per le mutazioni di interesse è ancora abbastanza tempo e ad alta intensità di manodopera. Inoltre, anche se la perdita RNAi di studi di funzione necessita di manutenzione di soli ceppi di tipo selvatico, ceppi di zanzare mutanti devono essere allevati singolarmente. Il mantenimento di recessive mutazioni letali sterili o adulto attualmente impegnativo data l'attuale mancanza di marcati bilanciatori di zanzare. Così, mentre site-specific gene targeting per nucleasi approcci stanno guadagnando rapidamente popolarità, chitosano / RNA di targeting può essere ottimale interferirescelta per i laboratori non attrezzati per mantenere i ceppi di zanzare e nei casi in cui la perdita di funzione del gene durante lo sviluppo è incompatibile con la sopravvivenza del ceppo.

Sulla base dei nostri risultati, ci aspettiamo che il chitosano / RNA interferenti può essere utilizzata ampiamente per atterramento di molti geni diversi durante lo sviluppo di A. gambiae, A. aegypti, così come altri insetti, e potenzialmente altri organismi modello non genetici. Silenziamento genico di successo con chitosano / interfering RNA è stato segnalato in altre specie di artropodi, tra cui Penaeus monodon (gamberetti) 32. Uno studio recente ha dimostrato che le nanoparticelle favoriscono la captazione del dsRNA e quindi migliorare l'efficienza atterramento rispetto con alimentazione diretta del dsRNA nel piralide asiatico 33, che sottolinea la possibilità di utilizzare questa tecnologia per indirizzare parassiti agricoli. L'eventuale uso di siRNA-nanoparticelle come terapeutica nell'uomo sta attirando molto of interesse nella comunità medica. Giljohann et al. 34 ha descritto la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle polivalenti coniugati RNA-oro, che hanno sei volte più lunga emivita rispetto per liberare dsRNA e facilmente entrare nelle cellule. Davis et al. 35 descrive il primo trial clinico umano che coinvolge la somministrazione sistemica di siRNAs usando un sistema di erogazione di nanoparticelle di pazienti con tumori solidi, e la possibilità di utilizzare chitosano / terapeutici siRNA stato recentemente rivisto 36. Così, chitosano / interferenti gene RNA tecnologia di targeting è una tecnica di laboratorio prezioso con un potenziale per le applicazioni più ampie. La ricerca futura esplorerà applicazioni aggiuntive per questa tecnica. Inoltre, la modifica chimica di chitosano e altri polimeri, un'area attiva di ricerca, può aumentare l'efficienza di interferire consegna RNA o consentire somministrazione mirata ai tessuti specifici 37.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

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References

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