Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.
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Artículo de método
El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Mosquitos vectores infligen más sufrimiento humano que cualquier otro organismo - y matan a más de un millón de personas cada año. Los proyectos del genoma del mosquito facilitaron la investigación en nuevas facetas de la biología de los mosquitos, incluidos estudios genéticos funcionales en el principal vector de la malaria Anopheles gambiae africana y el dengue y la fiebre amarilla vector Aedes aegypti. ARN de interferencias (RNAi-) mediada por el silenciamiento de genes se ha utilizado para dirigir genes de interés en ambas de estas especies de mosquitos vectores de enfermedades. Aquí se describe un procedimiento para la preparación de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que se combinan con los alimentos y ingeridos por las larvas. Este técnicamente sencilla, de alto rendimiento, y la metodología relativamente barato, que es compatible con una larga ARN de doble cadena (dsRNA) o pequeños ARN de interferencia (siRNA) moléculas, se ha utilizado para la caída con éxito de un número de diferentes genes en A. gambiae y A. aegyptilarvas. Siguiendo la alimentación de larvas, desmontables, que se verifica a través de QRT-PCR o hibridación in situ, pueden persistir por lo menos a través de la fase de pupa tarde. Esta metodología puede ser aplicable a una amplia variedad de mosquitos y otras especies de insectos, incluyendo las plagas agrícolas, así como otros organismos no modelo. Además de su utilidad en el laboratorio de investigación, en el futuro, quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable, podría potencialmente ser utilizada en el campo.
Introducción
Los mosquitos se alimentan de sangre de vectores de los géneros anofelinos y Aedine transmiten agentes patógenos responsables de varios de los peores flagelos de la humanidad. Se estima que unos 3,4 mil millones de personas están en riesgo de contraer la malaria, que es responsable de más de medio millón de muertes al año en todo el mundo. Resultados de la malaria de la infección por Plasmodium sp. Parásitos, que se transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados del género Anopheles, incluyendo el vector africano director Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/....
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Protocolo
1. Mosquito Especies y Crianza
- Mantener A. gambiae G3 y A. cepas aegypti Liverpool IB12 (utilizados en los estudios representativos abajo) u otras cepas de interés de acuerdo con la práctica de laboratorio estándar o como se describe previamente 23,24.
2. dsRNA y siRNA Diseño y Producción
- Diseño cebadores para construir plantillas de ARN de doble cadena largos específicos para el gen de interés. Utilice la herramienta de E-RNAi 25. Producir dsRNA de acuerdo con el método de elección o como se describió previamente 19.
- Para un control negativo,....
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Resultados
A. gambiae:
Nanopartículas de quitosano / dsRNA se forman debido a la interacción electrostática entre los grupos amino de quitosano y los grupos fosfato de dsRNA. La eficiencia de la incorporación de dsRNA en nanopartículas es usualmente por encima de 90%, medido por el agotamiento de dsRNA de la solución. Imágenes de microscopía de fuerza atómica muestran que el quitosano-dsRNA promedios de tamaño de partícula 140 nm de diámetro, que van desde 100 hasta 200 .......
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Discusión
El / interferir metodología de nanopartículas de quitosano ARN descrito en este documento se ha utilizado para dirigir eficazmente genes durante el desarrollo larval en A. gambiae (Figuras 2, 3) y A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, los cuadros 1, 2). Nanopartículas de quitosano pueden ser preparadas con cualquiera de largo dsRNA o siRNA, ambos de los cuales se han utilizado con éxito en los mosquitos como se evidencia por los resultados representativos descritos en el presen.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La financiación de la Estación Experimental Agrícola de Kansas y el Centro de Genómica de Artrópodos del Estado K para KYZ apoyó el desarrollo original del silenciamiento génico mediado por quitosano/dsRNA en A. gambiae19. El trabajo de A. gambiae descrito aquí fue apoyado en parte por R01-AI095842 de NIH/NIAID a KM. El desarrollo del silenciamiento génico mediado por quitosano/siRNA en A. aegypti20,21 fue apoyado por el premio R01-AI081795 de los NIH/NIAID a MDS. El contenido de este estudio es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,02 ml pipeman | Rainin | PR20 | para la resuspensión de ARN interferente |
| 0,2 ml pipeman | Rainin | PR200 | para la resuspensión de ARN interferente y preparación de ARN/nanopartículas interferentes |
| 0,5 ml tubo graduado | Fischer Scientific | 05-408-120 | para la alícuota de ARN interferente resuspendido |
| 1 ml pipeta | Rainin | PR1000 | para la resuspensión de ARN interferente y preparación de ARN interferente/nanopartículas |
| 1,5 ml tubo graduado | Fischer Scientific | 05-408-046 | para la preparación de ARN/nanopartículas interferentes |
| Acetato de sodio 1M, pH 4,5 | TEKnova | S0299 | para preparar tampón de acetato de sodio |
| Ácido acético, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grado | BDH | VWR BDH3092-500MLP | para preparar tampón de acetato de sodio |
| Agarosa Grado de Tecnología Genética MP | Biomedicals LLC. | 800668 | ARN/nanopartículas interferentes preparadas |
| Eppendorf AG | 5415D | para pellets de ARN/nanopartículas de interferencia | |
| quitosano, de conchas de camarón | Sigma-Aldrich | C3646-25G | para combinar con ARN interferente para la preparación de ARN/nanopartículas interferentes |
| Levadura seca | Universal Food Corp | NA | para preparar alimento para larvas de mosquitos con ARN interferente/ nanopartículas |
| Herramienta E-RNAi | Centro Alemán de Investigación del Cáncer | NA | para el diseño de dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// alimento para |
| peces dorados | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | para preparar alimento para larvas de mosquitos con ARN/nanopartículas que interfieren |
| Baño de agua calentado | Thermo Scientific | 51221048 | para calentar el ARN/nanopartículas interferentes a 55oC |
| Hielo | no aplicable | aplicable | para la descongelación de ARN interferente y la preparación de ARN/nanopartículas |
| [header] | |||
| Cubo de hielo | Fisher Scientific | 02-591-44 | para el almacenamiento de hielo utilizado durante el procedimiento, |
| polvo de hígado | MP Biomedicals LLC. | 900396 | para alimentar a las larvas de mosquitos después de la interferencia con el tratamiento de ARN/nanopartículas |
| Horno | de microondas Una variedad de proveedores | no aplicable | para preparar solución de agarosa al 2% |
| Petrid (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | la cámara de alimentación de ARN/nanopartículas interferentes para larvas |
| Medidor de pH | Mettler Toledo | S220 | para la preparación de tampones |
| Cuchilla de afeitar | Fischer Scientific | 12-640 | para dividir el ARN interferente/pellet de nanopartículas para la alimentación |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | personalizado | para la preparación de siRNA/nanopartículas |
| Sulfato de sodio, anhidro (Na2SO4) | BDH/distribuido por VWR | VWR BDH0302-500G | para preparar una solución de sulfato de sodio de 50 mM en la que se |
| Termómetro | resuspendido VWR | 61066-046 | para medir la temperatura del baño |
| agua Palillos-dientes | VWR | 470146-908 | para agitar durante la preparación de alimentos de ARN/nanopartículas de interferencia y el corte de gel de pellets |
| Congelador ultrabajo | variedad de proveedores | no aplicable | para el almacenamiento de alícuotas de ARN interferente y ARN/nanopartículas interferentes a -80oC |
| Mezclador de vórtice | Fischer Scientific | 02-216-108 | para la preparación de quitosano/ARN interferente |
| Papel de peso | Fischer Scientific NC9798735 | para dividir la pelletización de ARN/nanopartículas interferentes para la alimentación | |
Referencias
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
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Reimpresiones y permisos
