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Biology

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

Abstract

Mosquitos vectores infligen más sufrimiento humano que cualquier otro organismo - y matan a más de un millón de personas cada año. Los proyectos del genoma del mosquito facilitaron la investigación en nuevas facetas de la biología de los mosquitos, incluidos estudios genéticos funcionales en el principal vector de la malaria Anopheles gambiae africana y el dengue y la fiebre amarilla vector Aedes aegypti. ARN de interferencias (RNAi-) mediada por el silenciamiento de genes se ha utilizado para dirigir genes de interés en ambas de estas especies de mosquitos vectores de enfermedades. Aquí se describe un procedimiento para la preparación de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que se combinan con los alimentos y ingeridos por las larvas. Este técnicamente sencilla, de alto rendimiento, y la metodología relativamente barato, que es compatible con una larga ARN de doble cadena (dsRNA) o pequeños ARN de interferencia (siRNA) moléculas, se ha utilizado para la caída con éxito de un número de diferentes genes en A. gambiae y A. aegyptilarvas. Siguiendo la alimentación de larvas, desmontables, que se verifica a través de QRT-PCR o hibridación in situ, pueden persistir por lo menos a través de la fase de pupa tarde. Esta metodología puede ser aplicable a una amplia variedad de mosquitos y otras especies de insectos, incluyendo las plagas agrícolas, así como otros organismos no modelo. Además de su utilidad en el laboratorio de investigación, en el futuro, quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable, podría potencialmente ser utilizada en el campo.

Introduction

Los mosquitos se alimentan de sangre de vectores de los géneros anofelinos y Aedine transmiten agentes patógenos responsables de varios de los peores flagelos de la humanidad. Se estima que unos 3,4 mil millones de personas están en riesgo de contraer la malaria, que es responsable de más de medio millón de muertes al año en todo el mundo. Resultados de la malaria de la infección por Plasmodium sp. Parásitos, que se transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados del género Anopheles, incluyendo el vector africano director Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti es el mosquito vector primario para el virus del dengue, que causa la fiebre del dengue, una enfermedad febril inespecífica que es la enfermedad por arbovirus más extendida e importante en el mundo. El virus del dengue es actualmente una amenaza a> 2,5 mil millones de personas en los trópicos, con una inciden anualce de aproximadamente 50 millones de casos con resultado de ~ 24.000 muertes al año ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. A pesar del impacto mundial devastadora de enfermedades transmitidas por mosquitos en la salud humana, medio eficaz de prevención y tratamiento de estas enfermedades son escasas. El control de mosquitos es actualmente el mejor método de prevención de enfermedades.

El potencial para el control de enfermedades transmitidas por artrópodos por la manipulación genética de los insectos vectores ha sido reconocido por más de cuatro décadas 3. Cepas transgénicas de A. aegypti diseñados para tener un volador fenotipo femenino específico represible han hecho recientemente la posibilidad de utilizar las estrategias de control de vectores transgénicos una realidad 4-6. Estos avances han desafiado a los investigadores a identificar dianas genéticas novedosas para el control de vectores y otros medios de manipulación de genes en función de los mosquitos vectores. La alteración de la expresión génica durante el desarrollo, como fue el caso en las mujeres no volador mosquitos 4, puede promover el esclarecimiento de las estrategias de control de vectores novedosos. Sin embargo, en gran parte debido a las dificultades técnicas, las funciones de muy pocos genes se han caracterizado durante el desarrollo de A. gambiae, A. aegypti, o de otras especies de mosquitos.

Desde su descubrimiento en C. elegans 7, RNA de interferencia (RNAi), que se conserva en los animales, plantas y microorganismos, se ha utilizado ampliamente para estudios genéticos funcionales en una amplia variedad de organismos, incluyendo insectos 8,9. La vía de RNAi se inicia por Dicer, que escinde largo dsRNA en 20-25 siRNAs cortos-nucleótidos de largo que funcionan como ARN de interferencia específico de secuencia. genes silencio siRNAs que son complementarias en la secuencia mediante la promoción de rotación de transcripción, escote, y la interrupción de la traducción 9. Largas moléculas de dsRNA (típicamente 300-600 pb) o siRNAs personalizadas dirigidas a una particulasecuencia r se puede utilizar en el laboratorio de investigación para silenciar cualquier gen de interés. Mediante la gestión de ARN de interferencia cuando se entrega, los investigadores pueden controlar el tiempo en el que el silenciamiento de genes iniciados. Esta ventaja es útil, ya que se puede utilizar para superar retos como la letalidad del desarrollo o la esterilidad, lo que puede dificultar la producción y mantenimiento de cepas con mutaciones hereditarias, un proceso costoso y laborioso que aún no está disponible en todas las especies de insectos. Aunque el grado de silenciamiento génico por RNAi puede variar de un gen a gen, tejido a tejido, y un animal a otro, RNAi es ampliamente utilizado para el análisis funcional de los genes en los mosquitos y otros insectos 8,9.

Tres estrategias de entrega de interferencia de ARN se han utilizado en los mosquitos: la microinyección, la aplicación de remojo / tópica, y la ingestión. Para una historia detallada y comparación del uso de estas tres técnicas en los insectos, consulte Yu et al 8. We han utilizado con éxito microinyección 10 como un medio de entrega de siRNAs para dirigir genes de desarrollo en A. aegypti embriones, larvas y pupas 11-14. Sin embargo, esta estrategia de prestación de mano de obra intensiva requiere tanto una configuración de microinyección y una mano experta. Por otra parte, la microinyección es estresante para el organismo, un factor de confusión, en particular cuando se evaluarán fenotipos conductuales. Por último, la entrega microinyección no puede extenderse al campo para el control de vectores. Como alternativa, empapando el organismo en interferir solución de ARN también se ha convertido en un medio popular para inducir el silenciamiento de genes, ya que es conveniente y requiere poco equipo o el trabajo. El remojo principalmente se ha aplicado en la línea celular de insecto estudia 8, pero en un estudio reciente, desmontables se logró en A. aegypti sumerge en una solución de dsRNA 15, que los animales parecían estar ingerir. Sin embargo, para los estudios con análisis de múltiples Experimentagrupos l o fenotipos, remojo es bastante costoso. López-Martínez et al. 16 describe la rehidratación impulsado RNAi, un nuevo enfoque para la entrega de ARN de interferencia que implica la deshidratación en solución salina y la rehidratación con una sola gota de agua que contiene ARN de interferencia. Este enfoque no corta los costos asociados con la inmersión de animal completo, pero es más caro que la microinyección y puede ser limitada en su aplicación a las especies que pueden tolerar altas presiones osmóticas. Por otra parte, es difícil imaginar cómo la inmersión o la metodología de inmersión / rehidratación deshidratación podrían ser adaptados para el control de vectores en el campo. Por estas razones, para estudios post-embrionarias, la entrega de ARN de interferencia con los alimentos ingeridos es una estrategia alternativa viable.

Aunque las estrategias basadas en la ingestión no funcionan en todas las especies de insectos, tal vez sobre todo Drosophila melanogaster, la administración oral de ARN de interferencia se mezcla con los alimentos ha promovido si genlencing en una variedad de insectos 8,17, incluyendo A. aegypti adultos 18. Describimos quitosano nanopartículas mediada RNAi en A. larvas gambiae 19 y se han aplicado con éxito este enfoque para la reducción de la expresión de genes en A. Aegypti 20,21. Aquí, la metodología para este procedimiento RNAi, que implica el atrapamiento del ARN de interferencia por el quitosano polímero, es detallada. Chitosan / interferencia de ARN nanopartículas están formadas por autoensamblaje de policationes con ARN de interferencia a través de las fuerzas electrostáticas entre las cargas positivas de los grupos amino en el quitosán y las cargas negativas llevadas por los grupos fosfato en la cadena principal de ARN de interferencia 19. El procedimiento descrito es compatible con las moléculas de ARN de doble cadena larga (en adelante como dsRNA) o doble cadena siRNA (en lo sucesivo, siRNA). Después de la síntesis, quitosano / interferencia nanopartículas de ARN se mezclan con el alimento de las larvas y se entregan alarvas a través de la ingestión oral. Esta metodología es relativamente barato, requiere poco equipo y mano de obra 19, y facilita el análisis de alto rendimiento de múltiples fenotipos, incluyendo el análisis de los comportamientos de 20,21. Esta metodología, que puede ser adaptado para estudios de silenciamiento de genes en otros insectos, incluyendo otros vectores de enfermedades y plagas de insectos agrícolas, lo que potencialmente podría ser utilizado para el silenciamiento de genes en una variedad de otras especies animales. Además, el quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable 22, lo que potencialmente podría ser utilizado en el campo para el control de mosquitos específico de la especie.

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Protocol

1. Mosquito Especies y Crianza

  1. Mantener A. gambiae G3 y A. cepas aegypti Liverpool IB12 (utilizados en los estudios representativos abajo) u otras cepas de interés de acuerdo con la práctica de laboratorio estándar o como se describe previamente 23,24.

2. dsRNA y siRNA Diseño y Producción

  1. Diseño cebadores para construir plantillas de ARN de doble cadena largos específicos para el gen de interés. Utilice la herramienta de E-RNAi 25. Producir dsRNA de acuerdo con el método de elección o como se describió previamente 19.
    1. Para un control negativo, sintetizar dsRNA 19 correspondiente a la secuencia de la proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidasa (β-gal), o algún otro gen no se expresa en los mosquitos. Si así se desea, dsRNA 19 utilizado para generar los resultados representativos se resumen a continuación se puede utilizar como un control positivo. Tienda dsRNA disuelve en agua RNasa libre a -80 °; C hasta que se necesite.
  2. Por otra parte, el diseño de genes específicos de siRNA de acuerdo con la práctica estándar de laboratorio o como se describe anteriormente 10. Mezcle la secuencia de un siRNA desmontables para diseñar ARNsi de control negativo que no corresponde a cualquier gen de mosquitos. Compra los siRNAs personalizados, que están disponibles a través de un número de proveedores de confianza.
    1. Si así se desea, siRNAs 20,21 utilizado para obtener los resultados representativos se resumen a continuación se puede utilizar como controles positivos. Tienda siRNA disuelve en agua libre de ARNasa a -80 ° C hasta que se necesite.

3. Preparación Chitosan / ARN de interferencia nanopartículas

  1. Reúna sulfato de sodio RT 100 mM pre-hechos (100 mM Na 2 SO 4 en desionizada H 2 O) y acetato de sodio 0,1 M (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 en desionizada H 2 O) tampones.
  2. Disolver quitosano (≥75%desacetilada) en tampón de acetato de sodio 0,1 M para hacer 0,02% (w / v) de solución de trabajo y mantener la solución a temperatura ambiente antes de su uso.
  3. Disolver dsRNA o siRNA en 50 l H 2 O desionizada y añadirlo al tampón de sulfato de sodio 100 mM para hacer una solución de 100 l de 32 g de dsRNA / siRNA por 100 l de sulfato de sodio 50 mM.
  4. Añadir 100 l de solución de quitosano a la solución de dsRNA / siRNA y luego calentar la mezcla en un baño de agua a 55 ° C durante 1 min. Establecer un control mediante la adición de 100 l de sulfato de sodio 50 mM a 100 l de solución de quitosano y seguir el mismo procedimiento.
  5. Mezclar las soluciones inmediatamente durante 30 segundos mediante agitación de alta velocidad a temperatura ambiente para facilitar la formación de nanopartículas.
  6. Centrifugar la mezcla a 13.000 xg durante 10 min a TA, después de lo cual un pellet debe ser visible. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. El aire seco de la pastilla para ≈10 min a RT antes de usarla para preparar la comida de los mosquitos.
  7. MEDIDA la concentración de dsRNA / siRNA en el sobrenadante utilizando el sobrenadante de la control (ver 3.5) como un blanco para calcular la cantidad total de dsRNA / siRNA que permaneció en el sobrenadante. Utilice la diferencia entre las cantidades de partida de dsRNA / siRNA y las cantidades restantes en los sobrenadantes para calcular el porcentaje de dsRNA / siRNA atrapado en las nanopartículas. Esta eficiencia de carga es normalmente más del 90%.
  8. Repita el mismo procedimiento si se necesitan más nanopartículas. Utilice las nanopartículas secas inmediatamente. El impacto de almacenamiento en frío de partículas antes de su uso no ha sido evaluada.

4. Preparación Mosquito Alimentos que contienen quitosano / ARN de interferencia Nanopartículas

  1. Prepare 1 ml de una solución de agarosa al 2% (w / v) en agua desionizada, fundir la agarosa, y mantener la solución de agarosa fundida en un baño de 55 ° C el agua antes de su uso.
  2. Mezclar alimentos en escamas de pescado (47% de proteína cruda, min. 10% de grasa cruda, max. De fibra cruda 3%) y levadura seca en unarelación de 2: 1 (w / w). Triturar la mezcla de pequeñas partículas con un mortero (transitable a través Nº 50 EE.UU. tamiz de prueba estándar). Utilice la comida suelo, que debe ser de color marrón, ya sea inmediatamente o almacenarlo en un contenedor sellado a 4 ° C durante varias semanas.
  3. En un tubo de 1,5 ml, mezclar 6 mg de alimentos suelo con las nanopartículas secas de la Sección 3.7 con un palillo.
  4. Añadir 30 l de solución de gel de agarosa al 2% pre-fundida a la mezcla de nanopartículas de alimentos; revuelva inmediatamente ya fondo mediante el uso de una punta de un palillo o una pipeta.
  5. Utilice el gel que contiene alimentos y nanopartículas para alimentar a las larvas de mosquitos inmediatamente. Alternativamente, una vez que el gel se solidificó completamente a TA, almacenar el gel a 4 ° C y utilizar el día siguiente, o a -80 ° C para su uso posterior.

5. La alimentación de larvas de mosquitos con alimentos que contengan quitosano / ARN de interferencia Nanopartículas

  1. Alimentación A. gambiae larvas de mosquitos:
    1. Retirar un SIpellet gel ngle del tubo de 1,5 ml con un palillo y lo dividirá en 6 rebanadas iguales utilizando una hoja de afeitar limpia o palillo de dientes.
    2. Transferencia de 20 larvas de tercer instar a un plato de Petri de 500 ml que contiene 100 ml de agua desionizada.
    3. Alimentar a las larvas de mosquito mediante la adición de una rebanada de la pastilla de gel (finamente picado en trozos más pequeños) por placa de Petri de una vez al día durante cuatro días. Asegúrese de observar las larvas se alimentan de la pastilla, que debería ser significativamente reducida en tamaño o completamente ausentes por el día siguiente. Después de un tiempo, los mosquitos se convertirán en larvas de cuarto instar tarde.
    4. Grabe los cambios fenotípicos visibles durante el experimento. Examinar los niveles de transcripción y otros cambios fenotípicos como se discutió en la sección 6 al final del período de cuatro días.
  2. Alimentación A. aegypti larvas:
    1. Cortar el pellet gel en 6 rebanadas iguales utilizando una hoja de afeitar limpia o un palillo.
    2. Coloque 50-sincronizado edad de 24 horas después de la eclosión del huevo filarvas de instar primero en una placa de Petri en ≈40 ml de agua desionizada.
    3. Las larvas se alimentan un corte por placa de Petri durante 4 horas / día, a continuación, transferir las larvas de nuevo a la dieta de las larvas regular de 2: 1 de tierra, alimentos en escamas de pescado y levadura seca para el resto del día. Repita el procedimiento diario a través de los cuatro estadios larvales.
    4. Examinar los niveles de transcripción y otros cambios fenotípicos como se discutió en la sección 6 en los puntos de tiempo de desarrollo deseados.

6. Confirmación del gen Desmontables

  1. Relativo cuantificación transcripción de QRT-PCR en A. aegypti y A. gambiae larvas.
    1. Realizar y analizar los ensayos de qRT-PCR con tres réplicas biológicas en al menos 10 de control agrupada vs. larvas experimental como se describe 11,19,20, o de acuerdo con el procedimiento estándar de laboratorio. Los resultados representativos se incluyen a continuación.
    2. Para el análisis de una parte particular del tipo de tejido / cuerpo (es decir., El cerebro o antena), perform QRT-PCR como se describe en 6.1.1 después de la disección para recuperar el tejido de interés (por ejemplo, ver Mysore et al. 21).
  2. Confirmación de caída por hibridación in situ
    1. Sintetizar antisentido digoxigenina-etiquetados y sentir ribosondas de control de acuerdo con la práctica estándar de laboratorio o como se describe 26.
    2. Ejecutar la hibridación in situ por el protocolo Haugen et al. 27 para la confirmación de caída como se describió anteriormente 11,20 y discutido en la sección de resultados representativos a continuación.
  3. Confirmación de caída por inmunohistoquímica
    1. Si se dispone de anticuerpos contra el producto proteico del gen objetivo, realizar inmunohistoquímica como se ha descrito previamente 28, que facilita la identificación de los individuos con los mayores niveles de caída para el análisis de fenotipo 20 como se ejemplifica en la representative resultados sección de abajo.

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Representative Results

A. gambiae:

Nanopartículas de quitosano / dsRNA se forman debido a la interacción electrostática entre los grupos amino de quitosano y los grupos fosfato de dsRNA. La eficiencia de la incorporación de dsRNA en nanopartículas es usualmente por encima de 90%, medido por el agotamiento de dsRNA de la solución. Imágenes de microscopía de fuerza atómica muestran que el quitosano-dsRNA promedios de tamaño de partícula 140 nm de diámetro, que van desde 100 hasta 200 nm (Figura 1).

Figura 1
Figura 1. la formación de nanopartículas de quitosano y ARN de interferencia. Imagen de microscopía de fuerza atómica de las nanopartículas de quitosano / ARN de doble cadena (A) o solución de quitosano sin la adición de dsRNA (B). El tamaño de las imágenes fue de 1,0 m x 1,0 m. Barra de escala = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La alimentación de estas partículas que se combinan con los alimentos larval estándar y incorporados en agarosa apoya el desarrollo larval normal. Es importante destacar que, desmontables específica de transcripciones AgCHS1 ectodermo derivados, así como AgCHS2-intestino medio específico (Figura 2) es posible 19, demostrando que dsRNA tomada a través de la ingestión de nanopartículas iniciados RNAi más allá del intestino medio. Se observaron eficiencias desmontables ≈40-60% (por ejemplo., La Figura 2) y varían entre transcripciones.

Figura 2
Figura 2. niveles de transcripción de la quitina sintasa 2 (AgCHS2) después de dsRNA ingestión en <em> A. gambiae larvas. niveles de mRNA relativos de AgCHS2 en larvas alimentadas con nanopartículas con ds ds AgCHS2 o de control de las buenas prácticas agrarias. Los datos se presentan como media ± SD de tres réplicas biológicas independientes. Letras diferentes en las barras indican diferencias significativas sobre la base de pruebas t pareadas (P = 0,003).

Desmontables de AgCHS1 redujo significativamente el contenido total de quitina de cuarto estadio las larvas y el aumento de la susceptibilidad al insecticida inhibidor de la síntesis de quitina, diflubenzuron 19, desmontables de AgCHS2 aumentó significativamente el efecto de calcofluor blanco y ditiotreitol que interrumpió la matriz peritrófica (PM) en el cuarto instar larvas (Figura 3) que resulta en aumento de la mortalidad 17.

Figura 3
AgCHS2 ingerido nanopartículas sobre A. peritrophic matriz (PM) permeabilidad gambiae. Calcofluor tratamiento blanca o TDT interrumpe la PM de A. gambiae larvas que se exuberated aún más por AgCHS2 caída a través de la ingestión del quitosano / dsRNA nanopartículas 19. (A) Mosquito con PM intacto. (B) Mosquito con PM interrumpido, dextrano azul se escapa en el ceacae gástrico.

A. aegypti:

Quitosano / nanopartículas siRNA fueron usados ​​para ubicar el gen axón orientación semaphorin-1a (sema1a) durante A. desarrollo de las larvas aegypti 20. Derribo de sema1a fue confirmada a través de la hibridación in situ, que detectó niveles reducidos de sema1a en ≈60% de los cerebros culo larvalesEssed y no pudo detectar la expresión sema1a en ≈40% de los cerebros animales desmontables (Figura 4C vs. B; punta de flecha amarilla indica el lóbulo antenal). ensayos de qRT-PCR realizados en animales enteros agrupados revelaron que esta técnica resultó en la reducción de 32 ± 10% en las transcripciones sema1a comparación con el control en nanopartículas animales alimentados (Figura 4A; P <0,01 basado en la prueba t pareada, N = 5, donde N es el número de repeticiones biológica). Caída en el cerebro persistió a través de por lo menos 24 h de desarrollo pupal, como se evidencia por la pérdida de anti-Sema1a expresión de anticuerpos (Figura 4E1 vs. D1), que se utilizó para identificar a los animales con caída significativa durante el análisis de fenotipo olfativa de larvas y pupas. Se detectaron defectos del lóbulo antenal de larva y pupa (cuantificados en la Tabla 1) en sema1a desmontables larvas y pupas (Figura 4E2, E3 vs. (Figura 4E2 frente a D2, visualizado con mAbnc82; superposiciones de ambas señales se muestran en la Figura 4D3, E3). Fenotipos comparables se generaron con siRNAs desmontables dos sema1a separado, lo que ayudó a asegurar que los defectos observados no fueron el resultado de fuera de sitio dirigido por cualquiera de siRNA. Se generaron los más altos niveles de caída cuando se combinaron los siRNAs, una estrategia que se puede utilizar para aumentar la eficiencia desmontables (ver Mysore et al. 20 para más detalles).

Figura 4
Figura 4. Chitosan / siRNA inducida desmontables de sema1a en el sistema olfativo desarrollo de A. aegypti. QRT-PCR (A) e hibridación in situ (B, C) ​​ensayos confirmó desmontables de sema1a en las larvas alimentadas con una mezcla de sema1a siRNA dirigidos a 890 y 1198 de quitosano / siRNA de interferencia de ARN vs. nanopartículas nanopartículas de control. La pérdida de expresión Sema1a resultó en glomérulos que se deforma (E1-3 vs. D1-3). Ver texto para más detalles. Dorsal es en todos los paneles. La barra de escala = 25 micras. Esta cifra apareció originalmente en Mysore et al 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las larvas Pupas
siRNA n <strong> Wildtype Defectos AL n Wildtype Defectos AL
Control 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tabla 1. Cuantificación de defectos lóbulo antenal siguientes caída sema1a. Un resumen compilado de los resultados obtenidos para el control de siRNA vs. sema1a desmontables (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 quitosano animales alimentados con nanopartículas de un total de ocho replicar los experimentos realizados tanto en larvas ( se muestra a la izquierda) y pupas (derecha). El totalnúmero de individuos evaluados (n) ya los números / porcentaje de animales que presenten tipo salvaje morfología vs. (AL) defectos del lóbulo antenal (defectos dirigidos neurona receptor olfativo, neurópilo defectuoso y formación glomérulos) se indican. Derribo se verificó mediante inmunohistoquímica con la tinción de anticuerpos anti-Sema1a en un subgrupo de animales (15 larvas y pupas 10) que muestran los defectos más graves (indicado con *). Se encontró que todos los animales desmontables evaluados de esta manera para tener niveles reducidos de Sema1a, mientras que los niveles Sema1a en los animales de control alimentados no se alteró notablemente. Esta tabla apareció originalmente en Mysore et al 20.

En una segunda investigación se utilizaron 21, quitosano / nanopartículas siRNA para dirigir el factor de transcripción individual-mente (Sim) durante el desarrollo del sistema olfativo. ensayos de qRT-PCR con cerebros agrupados disecados de animales enteros indica que los cerebros de derribo sim tenían en promedio un 47% reductien en transcripciones sim en comparación con los animales de control alimentados con nanopartículas (p = 0,005 basado en test t pareado). Ensayos comparables con antenas reveladas en promedio una reducción del 77% en los niveles de sim con respecto a los animales (P = 0,002 basado en la prueba t pareada) controlar-alimentados. A pesar de cierta variabilidad en los niveles de caída entre los tejidos y animales, las transcripciones SIM no se detectaron a través de hibridación in situ en ≈50% de la caída cerebros animales / antenas después del tratamiento con cualquiera de los dos siRNAs desmontables diferentes (Figura 5B2, B3, C2, C3 vs B1, C1, Tabla 2). En ensayos de comportamiento de la levadura durante el cual los individuos que fueron atraídos a la levadura se otorgaron una puntuación de 1, mientras que los animales que no fueron atraídos recibieron una puntuación de 0, puntuaciones medias para sim 430 o SIM 718 animales eran desmontables significantly menor que la de los animales de control alimentados en dos experimentos repetidos (Figura 5A; P <0.001 basado en test t pareado). Defectuoso olor seguimiento del comportamiento (Figura 5A) se correlacionó con niveles reducidos de SIM en el antenas (Figura 5B2, B3 vs. B1) y el cerebro (Figura 5C2, C3 vs. C1, puntos amarillos marcar el perímetro del lóbulo antenal; véase la tabla 2 para la cuantificación de los resultados). Defectos Múltiples fueron identificados en las antenas y los lóbulos antenales de animales desmontables sim (ver Mysore et al 21. Para más detalles). Por ejemplo, las larvas y pupas caída sim carecían de expresión de orco, el co-receptor obligado para todos los receptores de olor en las neuronas olfativas del receptor (Figura 6). Se detectaron Reducción de los niveles de transcripción Orco en individuos alimentados con sim 430 ( Figura 6A3, B3) o la tarjeta SIM 718 (Figura 6A4, B4) caída (KD) quitosano / nanopartículas siRNA (comparar al tipo de animales salvajes en la Figura 6A1, B1 y controlar quitosano siRNA animales / nanopartículas alimentados en la Figura 6A2, B2). La pérdida de fenotipo expresión orco observado en L4 larvas (Figura 6A1-A4) persistió durante al menos 24 horas después de la formación de pupa (Figura 6B1-B4).

Figura 5
Figura 5. sim desmontables espectáculo larvas comportamiento olor atrayente defectuoso. Hibridación in situ reveló reducción de los niveles de ARN sim en las antenas (B2, B3) y el cerebro (C2, C3) de sim 430 y sim 718 animales desmontables (comparar controlar alimentados en B1, C1), que no respondió a atrayente odorante levadura (A). Ver texto para más detalles. Los extremos proximales de las antenas están orientadas hacia arriba en B1-B3. Dorsal está orientado hacia arriba en C1-C3. La barra de escala = 25 micras. Esta cifra apareció originalmente en Mysore et al 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. La pérdida de expresión orco en el desarrollo de A. antena aegypti siguiente desmontables de sim. Los niveles reducidos de transcripción orco se detectaron en individuos fed con sim 430 (A3, B3) o sim 718 (A4, B4) caída (KD) quitosano / nanopartículas siRNA (en comparación con el tipo de animales salvajes en A1, B1 y controlar quitosano siRNA animales / nanopartículas alimentados en A2, B2). Ver texto para más detalles. La barra de escala = 25 micras. Esta cifra fue compilada de imágenes publicadas en Mysore et al 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Atraído No Atraídos
siRNA n # Animales Normal Moderado Nulo # Animales Normal Moderado Nulo
Control 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tabla 2. Nivels de sim correlaciona con el rendimiento de las larvas en un ensayo de comportamiento de la levadura. Un resumen compilado de los resultados obtenidos en cuatro levadura odorante atrayente replicar los experimentos se muestra. El número total de animales (n) indica el número de larvas individuales que fueron probados en estos ensayos de comportamiento. El número de larvas individuales (#) Los animales que fueron atraídos (izquierda, los animales que se juntaban la pastilla de levadura y se otorgaron una puntuación de 1) o no atraído (a la derecha; los animales que no tocan el sedimento de levadura y recibió una puntuación de 0) en cada condición (Control, sim 430 KD, o sim 718 KD quitosano / siRNA nanopartícula alimentados) se muestran, y los porcentajes de animales totales se incluyó a raíz de los números crudos. Derribo de sim se evaluó a través de la hibridación in situ en los cerebros y las antenas de los animales atrajo (izquierda) o no atraído (a la derecha) a la levadura. Lanúmero prima / porcentaje de individuos con Normal (comparable a los niveles de transcripción de tipo salvaje sim), Null (sin transcripción sim observable) o moderada (reducido, pero no de tipo salvaje) niveles SIM se indican. Pérdida de sim correlaciona bien con una falta de atracción a la levadura. Esta tabla apareció originalmente en Mysore et al 21.

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Discussion

El / interferir metodología de nanopartículas de quitosano ARN descrito en este documento se ha utilizado para dirigir eficazmente genes durante el desarrollo larval en A. gambiae (Figuras 2, 3) y A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, los cuadros 1, 2). Nanopartículas de quitosano pueden ser preparadas con cualquiera de largo dsRNA o siRNA, ambos de los cuales se han utilizado con éxito en los mosquitos como se evidencia por los resultados representativos descritos en el presente documento. Síntesis de dsRNA es menos costoso que la compra de siRNA, pero es más mano de obra intensiva. Si se utiliza el quitosano / siRNA, fenotipos se pueden confirmar con múltiples siRNAs, lo que permite una mayor garantía de que el fenotipo descubierto no es debido a fuera de las instalaciones de focalización. También, la producción comercial de siRNAs en masa puede facilitar una mejor expansión de quitosano / ARN de interferencia silenciamiento para el control de mosquitos de especies específicas en el campo. Esto por supuesto requiere superar obstaculos tales como el costo y entrega.

Aunque hemos disfrutado de buen éxito con este protocolo, metodologías deben ser optimizados para cada gen. Por esta razón, se recomienda el ensayo de múltiples siRNAs, o quizás uno siRNA y una larga dsRNA, en el inicio de un nuevo proyecto. Una vez fenotipos se identifican y se confirmaron con al menos dos siRNAs distintas correspondiente a un gen de interés, puede ser útil combinar estos siRNAs para aumentar la penetrancia fenotipo (Figura 4). El momento y también la duración de quitosano / interferir tiempo de alimentación de ARN pueden ser optimizados para cada estudio. A. gambiae prosperar cuando se alimenta solamente con quitosano / interferir alimentos ARN como se describe en el presente documento. Sin embargo, en los experimentos que hemos realizado hasta la fecha, A. aegypti no les ha ido bien sin nutrición suplementaria, un problema que hemos superado transfiriéndolos a una dieta de comida normal después de 4 h de quitosano / interferir alimentación ARN. Experimentar con quitosano / interfiriendoEntrega de ARN en un sustrato alimenticio diferente, lo que todavía no hemos intentado, puede evitar este problema. Hemos encontrado que 4 h alimentación diaria a lo largo de varios días como resultado un buen equilibrio entre la caída y la nutrición adecuada, pero la modificación de la duración de la lactancia aún podría servirse como se desee. Además, el estadio larval en el que se inicia / continua quitosano / interferir alimentación de nanopartículas de ARN se puede adaptar para cada experimento en función del período de desarrollo crítico en el que se examina la función de genes, una gran ventaja de este protocolo.

Verificación de la caída es, por supuesto crítico, pero también puede requerir la solución de problemas. Por esta razón, puede ser útil para comprobar simultáneamente si se generan fenotipos de interés a medida que se evaluó la eficiencia de caída. Para los experimentos de validación de QRT-PCR, es fundamental que los cebadores y condiciones de PCR están optimizados. Por otra parte, es importante que los animales son de desarrollosincronizada en el inicio del experimento, como expresión de algunas transcripciones puede ser muy dinámico durante el desarrollo y debido a los ritmos circadianos 29. Además, si bien esta técnica genera claramente caída más allá del intestino, sólo estamos empezando a evaluar los tejidos para que esta técnica es eficaz, y esto puede variar entre las especies. Por tanto, será útil para medir la caída en tejidos particulares, que se pueden conseguir mediante la disección de tejidos de interés a partir de animales enteros para QRT-PCR o por medio de ensayos de hibridación in situ (Figuras 4-6) 20,21 e inmunohistoquímica (Figura 4) 20 ensayos (ver Haugen et al., 27 y Clemons et al. 28, respectivamente, para solucionar estos protocolos). Desde caída varía de un individuo a otro, es útil para realizar ensayos de doble etiquetado para evaluar fenotipos en combinación con los niveles de derribo (FiguRe 4) 20, lo que facilita enormemente la caracterización fenotipo. Para los estudios de comportamiento, los niveles de caída en los animales individuales se pueden correlacionar con sus actuaciones de comportamiento (Tabla 2) 20,21.

Siguiendo mediada por quitosano interferir entrega ARN para A. aegypti, se detecta la reducción de expresión de genes en 24 h de desarrollo pupal (Figuras 4, 6) 20,21. Aunque los niveles de expresión de genes aún no se han evaluado de forma detallada más allá de este punto del desarrollo, la reducción de los niveles de expresión de genes se han detectado en ambos 48 y 72 h A. pupas aegypti (KM, sin publicar). Sería útil para lograr los análisis más detallados de los niveles de derribo en múltiples etapas de A. desarrollo pupal aegypti y también para evaluar A. pupas gambiae. También sería interesante determinar si desmontables persiste en los adultos y para explorar nanopartículas mediada-interfering estrategias de prestación de ARN de mosquitos adultos.

Sitio específico de gen de la nucleasa estrategias selectivas se han introducido recientemente a A. aegypti y A. gambiae y están permitiendo la generación de selectivos, mutaciones hereditarias en los mosquitos y otros organismos modelo no genéticos 30,31. Aunque el uso de estos enfoques permite la pérdida de más uniforme de la función fenotipo análisis, una ventaja sobre los enfoques de ARNi, la detección de mutaciones de interés es todavía bastante tiempo y mano de obra intensiva. Por otra parte, aunque la pérdida de RNAi estudios de la función requiere un mantenimiento de sólo cepas de tipo salvaje, las cepas de mosquitos mutantes deben ser criados por separado. El mantenimiento de las mutaciones letales estériles o adultos recesivos actualmente está desafío dada la actual falta de balanceadores marcados en los mosquitos. Así, mientras específica de sitio gen de la nucleasa estrategias selectivas están ganando rápidamente popularidad, quitosano / ARN diana puede ser la óptima interferiropción para laboratorios que no están equipados para mantener cepas de mosquitos y en casos en los que la pérdida de la función de los genes durante el desarrollo es incompatible con la supervivencia de la cepa.

En base a los hallazgos, anticipamos que el quitosano / ARN de interferencia puede ser utilizado ampliamente para el derribo de muchos genes diferentes durante el desarrollo de A. gambiae, A. aegypti, así como otros insectos, y potencialmente otros organismos modelo no genéticos. El éxito de silenciamiento génico con quitosano / ARN de interferencia ha sido reportado en otras especies de artrópodos, incluyendo Penaeus monodon (camarón) 32. Un estudio reciente demostró que las nanopartículas facilitan la absorción de dsRNA y por lo tanto mejorar la eficiencia de caída en comparación con la alimentación directa de dsRNA en el barrenador asiático 33, lo que subraya el potencial para el uso de esta tecnología para dirigir las plagas agrícolas. El posible uso de siRNA-nanopartículas como agentes terapéuticos en humanos está atrayendo a una gran cantidad of interés en la comunidad médica. Giljohann et al. 34 describe la síntesis y caracterización de conjugados de nanopartículas de ARN-oro polivalentes, que tienen seis veces más larga vida media en comparación con liberar dsRNA y entrar fácilmente en las células. Davis et al. 35 describe el primer ensayo clínico humano que implica la administración sistémica de siRNAs utilizando un sistema de liberación de nanopartículas a los pacientes con tumores sólidos, y la posibilidad de utilizar de quitosano / terapéutica siRNA fue revisado recientemente 36. Por lo tanto, el quitosano / interferir gen de ARN tecnología de orientación es una técnica de laboratorio valioso con potencial para aplicaciones más amplias. La investigación futura explorará aplicaciones adicionales para esta técnica. Por otra parte, la modificación química del quitosano y otros polímeros, un área activa de investigación, puede aumentar la eficiencia de la prestación ARN de interferencia o permitir la ejecución selectiva de tejidos específicos 37.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

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References

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