Chitosan / interfering RNA Nanopartikkel mediert genet Slå i Disease Vector mygglarver

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å hemme genfunksjon i sykdomsvektor mygg ved bruk av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er inntatt av larver.

Abstract

Vektor mygg påføre mer menneskelig lidelse enn noen annen organisme – og drepe mer enn én million mennesker hvert år. De mygg genomprosjekter tilrettelagt forskning i nye fasetter av mygg biologi, inkludert funksjonelle genetiske studier i primær afrikanske malaria vektor Anopheles gambiae og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA uforstyrret (RNAi-) mediert genet Slå har blitt brukt til å målrette gener av interesse i begge disse sykdomsvektormyggarter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er kombinert med mat og inntas av larver. Dette er teknisk ukomplisert høy gjennomstrømning, og forholdsvis billig metode, som er kompatibel med langt dobbelttrådet RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler har blitt brukt for en vellykket knockdown av en rekke forskjellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Etter larve feedings, knockdown, noe som er bekreftet gjennom QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vedvare minst gjennom sent pupal scenen. Denne metoden kan anvendes på et bredt utvalg av mygg og andre insektarter, inkludert skadedyr i jordbruket, så vel som andre ikke-modellorganismer. I tillegg til sin anvendelse i forskningslaboratorium, i fremtiden, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer, kan potensielt bli anvendt i felten.

Introduction

Blod fôring vektor mygg av Anopheline og Aedine slekter overføre sykdomsfremkallende stoffer som er ansvarlige for flere av de verste svøper i menneskeheten. Anslagsvis 3,4 milliarder mennesker er i faresonen for å pådra malaria, som er ansvarlig for over en halv million dødsfall årlig på verdensbasis. Malaria resultater fra infeksjon med Plasmodium sp. Parasitter, som overføres til mennesker gjennom bitt av infisert mygg av Anopheles slekten, inkludert rektor afrikanske vektor Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , Aedes aegypti er den primære mygg vektor for dengue virus som forårsaker denguefeber, en ikke-spesifikk febril sykdom som er den mest utbredte og betydelig arboviral sykdom i verden 2014) ^1.. Dengue-virus er i dag en trussel mot> 2,5 milliarder mennesker i tropene, med en årlig incidence på ca 50 millioner tilfeller har resultert i ~ 24 000 dødsfall årlig ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Til tross for den ødeleggende globale effekten av mygg-borne sykdommer på menneskers helse, er effektive virkemidler for å forebygge og behandle disse sykdommene mangler. Mygg kontroll er i dag den beste metoden for sykdomsforebygging.

Potensialet for å styre leddyr sykdommer ved genetisk manipulering av vektor insekter har blitt anerkjent i over fire tiår ^tre. Transgene stammer av A. aegypti konstruert for å ha en repressible kvinnelig spesifikke flight fenotype nylig har gjort potensialet for bruk av transgene vektor kontroll strategier en realitet ^4-6. Disse fremskritt har utfordret forskerne å identifisere nye genetiske mål for vektor kontroll og ekstra middel til å manipulere gen-funksjon i vektor mygg. Endring av genekspresjon during utvikling, slik tilfellet var i kvinneflight mygg ⁴ var, kan fremme klarlegging av nye vektor kontroll strategier. Imidlertid i stor grad på grunn av tekniske utfordringer, funksjonene til svært få gener har vært preget under utviklingen av A. gambiae, A. aegypti, eller andre myggarter.

Siden den ble oppdaget i C. elegans ^7, RNA-interferens (RNAi), som er konservert i dyr, planter og mikroorganismer, har vært i utstrakt bruk for funksjonell genetiske studier i en rekke organismer, inkludert insekter ^8,9. RNAi veien er initiert av dicer, som kløyver lang dsRNA i korte 20-25 nukleotid-lang sirnas som fungerer som sekvens-spesifikke RNA forstyrrende. sirnas stillhet gener som er komplementære i rekkefølge ved å fremme avskrift omsetning, cleavage, og forstyrrelse av oversettelses ^9. Lange dsrna molekyler (typisk 300-600 bp) eller egendefinerte sirnas rettet mot en particular-sekvens kan anvendes i forskningslaboratorium for lyddemping ethvert gen av interesse. Ved å styre når interfering RNA er levert, kan forskerne styre tiden på hvilket gen stanse innviede. Denne fordel er nyttig fordi det kan brukes til å overvinne utfordringer som utviklings letalitet eller sterilitet, som kan hindre produksjon og vedlikehold av stammer som bærer mutasjoner arve, en kostbar og arbeidskrevende prosess som ennå ikke er tilgjengelig på alle insektarter. Selv om graden av genet Slå av RNAi kan variere fra gen til genet, vev til vev, og dyr til dyr, er RNAi mye brukt for funksjonell analyse av gener i mygg og andre insekter ^8,9.

Tre interfererende RNA leverings strategier har blitt brukt i mygg: mikroinjeksjon, soaking / lokal applikasjon, og inntak. For en detaljert historie og sammenligning av bruken av disse tre teknikkene i insekter, henvises det til Yu et al ^8. We har med hell brukt mikroinjeksjon ¹⁰ som et middel til å levere sirnas å målrette utviklings gener i A. aegypti embryoer, larver og pupper ^11-14. Men denne arbeidskrevende levering strategi krever både en mikroinjeksjon oppsett og en dyktig hånd. Videre er mikroinjeksjon stressende for organismen, en problemfaktor, spesielt når atferds fenotyper vil bli vurdert. Endelig kan mikroinjeksjon levering ikke forlenges til feltet for vektorkontroll. Som et alternativ, har soaking organismen i interfering RNA løsning også blitt et populært middel for å indusere genet Slå, som det er praktisk og krever lite utstyr eller arbeidskraft. Soaking har primært blitt brukt i insektcellelinje studerer ^åtte, men i en fersk studie, ble knockdown oppnådd i A. aegypti larver neddykket i en oppløsning av dsRNA ^15, hvor dyrene viste seg å være inntak. Imidlertid, for studier som involverer analyse av flere Experimental grupper eller fenotyper, er soaking ganske kostbare. Lopez-Martinez et al. ¹⁶ beskrevet rehydrering drevet RNAi, en ny tilnærming for interfering RNA levering som involverer dehydrering i saltvannsoppløsning og rehydrering med en eneste dråpe vann som inneholder RNA forstyrrende. Denne tilnærmingen gjør kutte kostnadene forbundet med hele dyr nedsenking, men er dyrere enn mikroinjeksjon og kan være begrenset i sin søknad til arter som tåler høye osmotiske trykk. Dessuten er det vanskelig å forestille seg hvordan nedsenking eller dehydrering / rehydrering nedsenking metodikk kunne tilpasses for vektorkontroll i felten. For disse grunner, for post-embryonale studier, levering av interfering RNA med inntatt mat er et levedyktig alternativ strategi.

Selv svelging baserte strategier ikke fungerer i alle insektarter, kanskje mest kjent Drosophila melanogaster, har oral levering av interfering RNA blandet med mat forfremmet genet silencing i en rekke insekter ^8,17, inkludert A. aegypti voksne ^18. Vi beskrev kitosan nanopartikkel-mediert RNAi i A. gambiae larver ¹⁹ og har med hell brukt denne tilnærmingen for reduksjon av genuttrykk i A. aegypti larver ^20,21. Her, metodikk for dette RNAi prosedyre, som innebærer entrapping av interfering RNA ved polymer kitosan, er detaljert. Chitosan / interfererende RNA-nanopartikler er dannet av selvbygging av polykationer med interfererende RNA gjennom de elektrostatiske krefter mellom positive ladninger av aminogruppene i kitosan og negative ladninger som bæres av de fosfatgrupper på ryggraden i interfererende RNA ^19. Fremgangsmåten som er beskrevet er kompatibel med både lange dsrna molekyler (heretter referert til som dsRNA) eller dobbelt-trådet siRNA (heretter referert til som siRNA). Etter syntese kitosan / interfererende RNA nanopartikler er blandet med larve mat og levert tillarver gjennom oralt inntak. Denne metoden er relativt billig, krever lite utstyr og arbeidskraft ^19, og legger til rette for høy gjennomstrømming analyse av flere fenotyper, inkludert analyse av atferd ^20,21. Denne metode, som kan tilpasses for genet Slå studier i andre insekter, blant andre sykdoms vektorer og insekt skadedyr i jordbruket, kan benyttes for genet Slå i en rekke andre dyrearter. Videre, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer ^22, kan potensielt bli anvendt i feltet for artsspesifikk mygg kontroll.

Protocol

1. Mosquito Arter og stell Opprettholde A. gambiae G3 og A. aegypti Liverpool IB12 stammer (som brukes i de representative studier under) eller andre stammer av interesse i henhold til standard lab praksis eller som tidligere beskrevet 23,24. 2. dsRNA og siRNA Design og Produksjon Design primere for å konstruere lange dsrna maler som er spesifikke for genet av interesse. Bruk E-RNAi verktøy 25. Produsere dsRNA i henhold ti…

Representative Results

A. gambiae: Kitosan / dsrna nanopartikler dannes på grunn av den elektrostatiske interaksjon mellom aminogruppene av chitosan og fosfatgrupper av dsRNA. Effektiviteten av dsRNA inkorporering i nanopartikler er vanligvis over 90%, målt ved uttømming av dsRNA fra oppløsningen. Atomic force mikroskopi bilder viser at kitosan-dsrna partikkelstørrelse gjennomsnitt 140 nm i diameter, alt 100-200 nm (figur 1). <p class="jove_content" fo:keep…

Discussion

Chitosan / interfererende RNA nanopartikkel metodologi beskrevet her har blitt brukt til å målrette gener under larveutvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, Bord 1, 2). Kitosan nanopartikler kan være forberedt med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge har vært brukt med hell i mygg som gjenspeiles av de representative resultatene som er beskrevet her. Syntese av dsRNA er billigere enn å kjøpe siRNA, men er mer arbeidskrevende. Hvis kit…

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Descriptions
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100X15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings