Summary
La maladie de Dupuytren (DD) est une maladie fibroproliférative de la paume de la main. Ici, nous présentons un protocole à la culture spécimens de résection de DD dans un (3D) système de culture tridimensionnelle. Ce système de culture à court terme permet la préservation de la structure 3D et propriétés moléculaires du tissu fibreux.
Introduction
La maladie de Dupuytren (DD), une maladie fibroproliférative bénigne provoque la flexion des doigts permanente due à la formation de nodules et les cordons dans la paume de la main. Bien que la propagation de la maladie est particulièrement élevé chez les Caucasiens d'Europe du Nord, l'étiologie génétique sous-jacente de la maladie reste inconnue 1. La principale caractéristique de DD est l'excès de production de matrice extracellulaire (ECM) protéines (par exemple, collagène), qui forment un tissu fibreux dur occupant l'espace entre les tendons et la peau de la paume de la main et des doigts, ce qui perturbe de façon permanente les mouvements fins de la main 2, 3. La récurrence de la maladie suggère altérations génétiques sous-jacents comme une cause de la fibrose 1, 4. Un traitement efficace pourrait être de cibler directement les mécanismes fibrotiques incontrôlables au niveau cellulaire et moléculaire.
Notre travail récent sur la fibrose nous a conduit à l'élaboration d'unnouveau système de culture en 3D qui permet la culture à court terme de tissu fibreux humain avec le potentiel de dépistage des drogues. Ce système a contribué à surmonter l'approche limite de cultures de fibroblastes 2D et de définir un rôle pour la régulation à la baisse partielle, réalisée par le saut d'exon, d'activation de la voie TGF dans la médiation de la fibrose 5.
Nous avons développé une méthode à la culture ex vivo pièces d'exérèse humaine de patients DD pour étudier l'interaction entre les myofibroblastes et l'ECM entourant 5, 6. L'étude de DD fibrose du tissu conjonctif ainsi que d'autres maladies fibrotiques se appuie sur l'analyse histopathologique de l'excisée chirurgicale spécimens, l'isolement des fibroblastes du tissu et l'établissement de cultures primaires ou de procédures de triage des cellules. Ces approches sont assez statique, car ils ne permettent pas la manipulation exogène des propriétés de la maladie ou une intervention thérapeutique par l'expérimentateur. En outre, CE primairecultures ll ont tendance à se adapter aux conditions de culture et de leurs propriétés d'expression des gènes diffèrent essentiellement de la situation in vivo sur tous les passages, même pendant les premiers passages (parmi passage 3 et 6) 7, 8. Nous avons réussi à maintenir le matériel chirurgical des déchets ex vivo conditions de culture pour une période de temps qui permet l'étude des caractéristiques spécifiques du patient et le criblage de composés médicamenteux anti-fibrotiques ou anti-inflammatoires.
Le système est basé sur une membrane de nitrocellulose qui permet un contact du tissu avec le milieu, mais pas avec la matière plastique, par conséquent, la prévention de l'altération du tissu lors de la fixation, comme observé précédemment lors de la mise en culture de fibroblastes de DD ainsi que d'autres types de cellules 9. Aucun gel de collagène ou d'un autre substrat de protéine ECM est nécessaire, étant donné que le tissu DD se produit de grandes quantités de ces protéines. Ce est avantageux pour l'entretien des micro ECM natif et le chiffre d'affaires le péchédes substrats à matrice CE sont régulateur important de l'architecture et de la fonction 10, 11 tissus. Par exemple, les protéines de la MEC telles que la fibronectine, la laminine et le collagène, peuvent influencer polarité avant-arrière de fibroblastes indiqués comme similaire à polarité apicale-basale dans les cellules epitheliales 12, 13 . cellules polarisées ont répartition asymétrique des molécules extracellulaires qui détermine la migration cellulaire et l'expression des gènes, par exemple, l'accessibilité de l'intégrine α1β1 sur la membrane affecte l'adhérence cellulaire de collagène de type I 14. Etant donné que l'objectif principal de ce modèle 3D a été de préserver le micro-environnement natif, aucune substrat de matrice ECM artificielle a été utilisée.
En bref: pièces d'exérèse sont également coupés dans un environnement stérile et placés sur des membranes nitrocellular. Si le traitement administré par injection est nécessaire, les tissus sont injectés après qu'ils ont été placés sur la membrane. Si le traitement ne nécessite pas d'être administrés par injection puis le composé est ajouté au milieu de culture (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), avec 1% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine (P / S)). Les cultures sont maintenues pendant un maximum de dix jours, après quoi le tissu est fixé à 4% de paraformaldehyde (PFA), traité par une solution de saccharose à 30%, noyé dans du composé OCT et stocké à -80 ° C, comme décrit précédemment 5.
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Protocol
Ce protocole suit les directives LUMC et AMC de comité d'éthique de la recherche humaine.
1. Procédure chirurgicale et collecte de tissus
Remarque: Bien qu'il existe différentes techniques pour l'excision chirurgicale de la maladie de Dupuytren, l'étalon-or actuel est le fasciectomie partielle 15. La plupart des patients sont traités dans la clinique chirurgie d'un jour.
- Effectuer la chirurgie sous anesthésie générale ou régionale en fonction des préférences du patient et de l'anesthésiste'S et de co-morbidités du patient. Ces considérations sont au-delà de la portée de ce document. Avant l'incision, toucher la peau avec un objet pointu afin de vérifier que l'anesthésie est satisfaisante. Utilisez un garrot pour faciliter la visualisation chirurgicale dans un champ sans effusion de sang.
- Après apprêter stérile et drapage, marquer l'incision prévue avec un stylo. Inciser la peau avec un scalpel sous loupe grossissement soit longitudinalement or en utilisant des incisions en zigzag à prévenir les contractures supplémentaires et également pour permettre une exposition suffisante.
- Utilisation de ciseaux de dissection, libérer la peau et la couche sous-cutanée de sous-jacents les palmaire fascia contractés. Identifier et protéger le faisceau neurovasculaire du doigt parce que le cordon malade peut le déplacer vers la ligne médiane. Une fois que le tissu fibreux (nodules et / ou cordon) est décrite, exciser fortement et régional (montant) à l'aide d'un scalpel. Effectuer hémostase méticuleuse sous contrôle de garrot à la fin de la procédure pour éviter la formation d'hématome.
- Pour fermer la peau, utiliser plasties en Z supplémentaires pour obtenir un allongement partielle de la peau.
- Pour ces études utilisent seulement la partie des nodules du cordon fibreux, la partie la plus active et cellulaire de la maladie. Demandez le chirurgien procéder à une identification macroscopique. Les nodules isolés dans la paume de la main sont souvent précurseurs ou une corde, mais ne sont presque jamais résection, car ils ne causent habituellement pas de symptômes.Ceux que nous résection étaient les nodules qui faisaient partie d'un cordon du doigt contractée. Identifier ces nodules par la partie épaisse et dure des cordons dans le handpalm (figure 1A).
- Une fois que le chirurgien retire le tissu, transférer immédiatement à l'aide de pinces stériles dans un tube de 50 ml contenant du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S). Maintenir le tissu pour un maximum de deux heures dans ce milieu sur une zone de la glace humide (4 ° C) (par exemple, le transport du tissu à partir de la salle d'opération de l'outil de culture cellulaire).
- Gardez les échantillons sur de la glace (4 ° C) tout en préparant la prochaine étape. Préparation de la chambre de matériaux et culture cellulaire nécessite de 10 à 20 min.
2. Préparation des instruments, milieu de culture et Culture Inserts
Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.
- Préparer 500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FCS et 1% (P / S) et le filtre sterilize. Préchauffer le milieu à 37 ° C.
- Forceps autoclave, une paire de ciseaux Mayo courbes lame (150-170 mm de longueur) et une paire de ciseaux de Metzenbaum et conserver dans un récipient stérile.
- Sous flux laminaire, ouvrez une plaque de 12 puits de culture stérile. Placez un insert de culture (0,45 um taille des pores, 12 mm de diamètre) dans chaque puits de la plaque à 12 puits (figure 1B, panneau inférieur).
- Remplir la plaque 12 puits avec 600 pi de préchauffé (37 ° C) milieux de culture par pipetage sur le bien et non pas directement sur la membrane de l'insert. Placer la plaque dans l'incubateur (37 ° C, CO 2 5%) (figure 1B, panneau supérieur).
- Vous pouvez également utiliser une plaque de 24 puits et ajouter 300 ul de milieu par puits. Le volume de milieu par puits soit optimale en une couche de ménisque étant formée entre le liquide et la partie inférieure de l'insert de membrane.
Remarque: le milieu au fond du puits se diffuse à travers la nitrocellulose membrane former la couche de ménisque comme représenté dans les schémas de la figure 1B (panneau inférieur).
- Vous pouvez également utiliser une plaque de 24 puits et ajouter 300 ul de milieu par puits. Le volume de milieu par puits soit optimale en une couche de ménisque étant formée entre le liquide et la partie inférieure de l'insert de membrane.
3. tissus installation de culture de tissus Préparation et ex vivo
Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.
- Transférer la partie des nodules du cordon du tube de 50 ml sur un plat 100 mm Petri et ajouter 10 ml d'préchauffé (37 ° C) moyenne. Assurez-vous que le tissu est en contact avec le liquide pendant toute la procédure.
- Retirer la couche de graisse périnodulaire l'aide des ciseaux de Metzenbaum. Jeter le tissu adipeux. Avec l'utilisation de forceps et les ciseaux courbes lame, couper transversalement le tissu en petits morceaux (épaisseur maximale de 200 um).
- Transférer la plaque à 12 puits à partir de l'incubateur dans la hotte laminaire. Vérifiez que la membrane de l'insert est devenu transparent (humide) et est donc en contact avec le milieu.
- En utilisant des pincessoulevez délicatement une partie des tissus en touchant la couche externe (ne pas appliquer la tension sur le tissu). Placer une pièce de tissu sur la membrane de l'insert de culture cellulaire de sorte que le tissu reste à l'interphase air-milieu. Culture un maximum de deux pièces de tissu sur le même insert / puits.
- Assurez-vous que le tissu est placé à plat sur la membrane, en contact avec le milieu longitudinal de telle sorte que le tissu ne glisse de la membrane ne est entièrement couvert par le milieu. Éviter les bulles d'air.
Remarque: A ce stade, il est possible d'ajouter des facteurs de croissance ou des inhibiteurs d'intérêt pour les médias; par exemple, les composés d'essai (A, B, C, D, E) à répétitions et / ou en courbe de concentration. Inclure au moins deux pièces de contrôle (non traitées) de tissu dans des conditions de croissance normales pour se assurer que l'expérience a été mis en place correctement. Incuber les tissus pendant 3-7 jours dans un incubateur de culture de tissu. - Infecter le tissu avec soit lentiviral construction ou adénoviral si la surexpression ou assommer eXperiments d'un besoin gène d'intérêt à effectuer (Figure 2). Transférer une partie de tissu à partir de la plaque à 12 puits dans une boîte de 35 mm en utilisant une pince.
- Utiliser un volume maximum de 10 ul de virus à titre élevé.
- Effectuer l'injection sous un microscope à dissection avec une seringue à insuline chargé avec 50 pl de PBS contenant 10 ul de virus sélectionné. Placez l'aiguille perpendiculaire au centre du tissu.
- Lentement injecter le contenu de la seringue. Ne pas rentrer directement l'aiguille. Quand la perforation du tissu, ne pas laisser passer l'aiguille à travers l'autre côté mais à maintenir l'aiguille dans le tissu lui-même (autour du centre du tissu).
- Transférer le tissu de nouveau dans la plaque de 12 puits, fermer la plaque de culture et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2).
4. totalité montage immunofluorescence et de la reconstruction 3D
Remarque: Tous les proprocédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire. Le protocole pour toute immunocoloration montage et l'imagerie décrit ci-dessous est une adaptation des méthodes utilisées précédemment rapportées pour d'autres tissus 16-19. Tampons et matériaux sont décrits dans le Tableau 1 et la liste des matériaux.
- tissus de transfert de la plaque de culture à 2 ml microtubes contenant du PBS. Laver 2x pendant 5 min dans une solution de PBS sur une plate-forme tournante. Fixer tissus dans 4% PFA tamponnée (1,5 ml de solution par le tissu dans 2 ml microtubes), O / N à 4 ° C sur une plate-forme tournante.
- Retirer PFA et laver 3x dans du PBS pendant 5 min chacun.
- Déshydrater les tissus par immersion dans une solution de methanol à 25% pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante. Augmenter le pourcentage de méthanol progressivement (50%, 75%, 100%) avec les tissus immergés à chaque solution pendant 2 heures à la température ambiante sur une plate-forme tournante.
- tissus de transfert dans du DMSO / solution méthanolique (étape de perméabilisation) pendant 3 semaines à 4 ° C,18 comme décrit précédemment.
Remarque: A ce stade, les tissus peuvent être stockés à long terme à 100% de methanol à -20 ° C. - Passez à la procédure 16, 17 coloration; réhydrater progressivement les tissus (75% -50% -25% -0% de la série de méthanol). Effectuez chaque étape de réhydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C, sous agitation constante.
- Incuber les échantillons avec des anticorps primaires dans du PBS contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 20% de DMSO O / N à 4 ° C. Utilisation des anticorps selon les rapports suivants en utilisant les stocks commerciaux de PBS: anti-α actine de muscle lisse (1: 500, souris), de type anti-collagène de type I (1: 500, de chèvre) anti-collagène de type III (1: 500, chèvre).
- Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 4 ° C (solution PBS changement de 3 à 4 fois).
- Diluer anticorps secondaire approprié (Alexa 555 anti-souris, Alexa 488 anti-chèvre) à 1: 250 dilution dans du PBS contenant 1% (BSA) et 20% de DMSO. Incuber O / N à 4 ° C.
- Laver abondamment dans du PBS pendant 48 heures à 476; C et incuber avec contre-coloration nucléaire, TO-PRO-3 dilué à 1: 500 dans du PBS à l'étape de lavage final.
Remarque: TO-PRO-3 est une émission rouge lointain colorant d'ADN (avec une ligne laser 633 nm He-Ne) et est combiné pour l'imagerie simultanée avec d'autres canaux; dans ce type de type cas collagène I / collagène III (488 nm), α actine musculaire lisse (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Transférer les tissus à une série de methanol (25% -50% -75%) à déshydrater lentement le tissu; exécuter chaque étape de déshydratation pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C sous agitation constante.
- tissus de transfert dans des tubes en polypropylène. Tissus clairs dans le salicylate de méthyle (de poignée sous hotte chimique) 18 ou une utilisation alternative de solution BABB 19. Incuber à température ambiante sous agitation constante jusqu'à ce que les tissus deviennent transparents. Mont entre lame et une lamelle scellé avec jeu dur milieu de montage (figure 1C, panneau supérieur).
- échantillons d'images sur une micro confocal inverséportée équipée avec une grande NA 63X et / ou 100X objectifs à immersion d'huile (figure 1C).
- Nettoyez l'objectif avec une solution de nettoyage fournies par le fabricant de microscope.
- Appliquer une goutte d'huile sur la lentille d'objectif. Placez la lame avec l'échantillon sur la platine du microscope et de se concentrer sur l'échantillon.
- Définissez les configurations sur le microscope pour l'imagerie simultanée de la fluorescence à trois canaux avec des lignes laser 488 nm, 514 nm et 633 nm.
- Acquérir des images simples ou multiples XY images plan focal (Z) de la pile (Figure 3A). Utilisez augmentation de la largeur de la pile Z pour effectuer la reconstruction 3D. Pour obtenir une image à haute résolution utilise à faible vitesse de balayage, nombre de balayages moyenne (≥ 3) et acquérir des images 16 bits de résolution 1024 x 1024 pixels.
- Analyser les images Z pile acquis: d'abord renommer et sauvegarder le fichier d'image (xyz). En utilisant le programme logiciel du microscope confocal, configurer une intensité maximale de projection des images Z de la pile dans un 3D reconstruite image.
- Sélectionnez le fichier xyz, dans les "Outils de process", cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D". Entrez "Maximum" dans la méthode de projection (ou "moyenne" si le signal fluorescent est saturé). Pour une seule projection ne changent pas l'X, Y et Z avions, et appliquer l'outil de projection (figure 3B, r1).
- Utilisez les images de la pile Z pour créer une projection 3D avec animation (logiciel confocal) aux fins de visionnement. Sélectionnez le fichier xyz, dans les outils de traitement, cliquez sur la rubrique «Visualisation» et «Projection 3D".
- Cliquez sur "Créer un film". Saisissez l'angle de rotation Démarrer en degrés (par exemple, 0 ° que le point du film, de l'axe Y départ) et cliquez sur "Démarrer Set". Saisissez l'angle de rotation en degrés End (axe Y) comme point de fin du film (par exemple, 180 ° ou 3606; pour une rotation complète) et cliquez sur "Fin Set".
- Sélectionnez "Maximum" comme une méthode de projection (ou "moyenne" si le signal fluorescent est saturé). Entrez le «Number of Frames» pour la rotation de la reconstruction 3D (par exemple, 20 rotations ou plus pour réduire la vitesse de rotation). Cliquez sur "Appliquer". Exporter le film en tant que fichier visuelle (par exemple, "avi") (Movie supplémentaire 1) ou à l'exportation comme des fichiers "tiff" qui crée un fichier image pour chaque angle de rotation (figure 3B; rotation r4, r10, r18).
5. valant deuxième génération d'harmoniques (collagène) et à deux photons de fluorescence excité (élastine) imagerie ex vivo sur des tissus au cours Culture
Remarque: Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante sauf indication contraire.
- Retirer les plaques transwell de l'incubateur et placer un seul (non fixée) tiquest partie dans une plaque de culture cellulaire de 35 mm contenant 500 ul de milieu.
- Placez le tissu de sorte que le grand axe est à plat sur la plaque. Gardez tissu humide à tout moment cependant, pas flottante.
- Passer objectif immergé dans l'eau du microscope multiphoton directement en contact avec le tissu (Figure 1C).
- Obtenir des images avec une longueur d'onde d'excitation de 800 nm et de recueillir la lumière émise entre 371 à 425 nm (SHG, le collagène) et de 474 à 532 nm (autofluorescence, élastine) (figure 3C). Effectuer microscopie à deux photons dans un microscope confocal verticale équipé d'un laser femtoseconde au moyen d'un objectif eau d'immersion 20X / NA 1.0. Processus confocale empile avec le logiciel du fabricant.
Remarque: Excitation avec un laser infrarouge proche des molécules de collagène crée des images de contraste élevé de structures de collagène natif à différentes profondeurs.
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Representative Results
La méthode de l'ex vivo, la culture 3D de tissu conjonctif est un ensemble en place un système robuste et facile à comprendre la relation entre l'ECM et les autres composants de cellules constituant le tissu DD et potentiellement d'autres types de fibrose ainsi. En outre, ce système permet une méthode fiable pour tester les effets de composés sur différents types de cellules et de leurs effets sur la charge fibrotique 20.
Les étapes de la collection des déchets chirurgicale dérivé de la fibrose de Dupuytren, l'ensemble de la chambre de culture et des exemples d'outils d'analyse sont présentés dans la figure 1. Comme le montre la figure 1, cette méthode fournit un outil expérimental pour les grands écrans écrans de drogue, par exemple, antifibrotiques composés médicamenteux ainsi que l'étude de modélisation ECM en temps réel et de façon reproductible. Pièces nodulaires du cordon fibreux sont aussi tranchés et placés dans des plaques de transwell; chaque partie de tissu (1De 00 à 200 pm) est mis en culture sur le dessus de la membrane d'un insert de culture (0,45 um de taille de pores, diamètre 12 mm). Le milieu de culture est ajouté à la chambre inférieure, ce qui permet le contact avec le tissu à travers la membrane. En moyenne 30 à 40 pièces de tissu peuvent être obtenues à partir d'un seul échantillon de résection, ce qui permet un dépistage à grande échelle de drogues; des composés, de petites molécules ou des facteurs de croissance. Des expériences portant sur la concentration et / ou à effets dépendant du temps de la drogue sont réalisables.
Comme le montre la Figure 2, l'expression du gène peut être manipulé (surexpression / abattre) par l'utilisation d'adénovirus / lentivirus injectés directement dans le tissu. Fluorescence transduction virale marquée est effectuée dans des échantillons de tissus frais épais par injection. Tissue reste en culture pendant 24 à 48 heures après l'injection et est ensuite fixé, intégré et sectionné 0,7 um cryosections. En outre, pour analyser l'effet de différents composés ou des conditions de culture de la partie de tissus sont fixés ensemble et soumis à une immunofluorescence de montage comme représenté sur la figure 3. imagerie 3D de tissus d'épaisseur est effectuée par microscopie confocale (figure 3A-B). Une autre méthode est l'imagerie 3D en direct sur les tissus maintenues en culture; remodelage du collagène endogène est étudiée en temps réel dans fraîchement disséqués, pièces de tissu non-fixés par génération de second harmonique (SHG) (figure 3C). L'effet des médicaments anti-fibrotiques potentiels est également suivie en parties d'un même tissu à différents points dans le temps. structures de collagène de tissu épais sont imagées par SHG dans un multiphotonique microscope droit. Au cours de l'imagerie, des échantillons de tissus sont placés dans un milieu et sont imagés avec un objectif immersion dans l'eau. Après l'imagerie, les tissus peuvent être transférées vers le système de culture. Les effets peuvent être étudiés au niveau de l'environnement cellulaire et extracellulaire fournir un avantage sur les essais in vitro à base de cellules. Il ya plusieurs possibilités pour analyse des effets biologiques tels que l'histologie des coupes de tissus fixés, l'ensemble de montage et immunofluorescence reconstruction 3D imagerie par microscopie confocale, et SHG fluorescence à deux photons excités imagerie de collagène et d'élastine endogène. Certains des avantages de l'imagerie par SHG sont l'utilisation de tissus frais, non fixée, qu'aucun anticorps préparation de coloration est nécessaire et que le même tissu peut être reproduite plusieurs fois (au cours de déroulement dans le temps des conditions de culture). SHG et deux photons de fluorescence excitée imagerie a été décrit précédemment pour le muscle et le tissu conjonctif et 21-23 artérielle tache structure de la paroi 24, cependant, nous rapportons ici une autre application pour l'étude de la fibrose de Dupuytren.
Figure 1. Schéma de système 3D ex vivo de culture de tissu. (A) DD contracture de flexion permanente dans la main d'un patient avant l'ablation chirurgicale. Ce chiffre a été modifié depuis 5 étude précédente. (B) Exemple de culture ex vivo mis en place. (C) des exemples d'approches expérimentales qui peuvent être utilisés pour l'analyse de dépôt ECM. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.
Figure 2. Preuve de principe ex vivo à médiation virale gène modulation de l'expression dans les tissus toute la montagne. (A) Les noyaux sont visualisés avec TO-PRO-3 colorant (bleu). Bars 75 um. (B) de la visualisation directe de la fluorescenceDsRed colorant (rouge), post-injection avec adénovirus exprimant-DsRed. Bars 75 um. (C) de image fusionnée (de coloration nucléaire en bleu, en rouge DsRed). Localisation cytoplasmique de DsRed indiquant livraison adénoviral dans les cellules dans les 24 heures. Bars 75 um. (DF) Lentiviral transduction. (D) Les noyaux sont visualisés avec TO-PRO-3 colorant (bleu). Bars 25 um. (E) de la visualisation directe de la GFP dans des coupes de tissus (vert), après l'injection de particules lenti-GFP. Bars 25 um. (F) image fusionnée de D et E indiquant la localisation intracellulaire de Lenti-GFP. Bars 25 um (GH) Exemple d'effet de choc de lentivirus médiée par contre gène d'intérêt (désigné par "A"); séquence shRNA brouillés (G) mise en Lentivirus.ex vivo a été injecté dans le tissu. Immunofluorescence pour la protéine d'intérêt (désigné comme "A") apparaît en rouge. Bars 75 um. Une séquence portant le gène-shRNA (H) ont été injectés Lentivirus ex vivo dans le tissu. La coloration par immunofluorescence de la protéine "A". Noyaux sont colorés avec TO-PRO-3 colorant. Bars 75 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. reconstruction imagerie 3D, génération de second harmonique et deux photons de fluorescence excitée imagerie. (A) imagerie 3D par microscopie confocale. (XY) Images en plans focaux long différentes profondeurs de tissu (z = 50-200 de um). Toute la montagne IMMUnofluorescence coloration; marqueurs myofibroblastes α-actine musculaire lisse (αSMA, rouge), la coloration nucléaire (TO-PRO-3, bleu). Bars:. 500 um (B) 3D image reconstruite (Z pile 389 um) des images brutes, comme indiqué dans le panneau A à différentes rotations 3D indiquée comme "r1", "r4", "R10", "r18". Bars 500 um. (C) la modélisation de la teneur en collagène endogène par l'imagerie de seconde harmonique (SHG) dans certaines parties de tissus frais, épais (panneau de gauche, vert). Deux photons de fluorescence excité (TPF) de structures d'élastine de l'ECM a été capturé par microscopie multiphotonique (panneau du milieu, rouge). Image fusionnée de collagène (vert) et d'élastine (rouge) (panneau de droite). Bars:. 100 um Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film supplémentaire 1. Représenrepré- 3D du film de reconstruction de tout le tissu de montage de Dupuytren imagerie confocale de tissu DD a été réalisée après sept jours culture ex vivo et le traitement pour toute immunofluorescence montage. marqueurs myofibroblastes α-actine musculaire lisse (αSMA, rouge), la coloration nucléaire (TO-PRO-3, bleu). Barre d'échelle = 500 um. Cadres = 20. Z = 389 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
| PBS (solution saline tamponnée au phosphate) | 8,00 g de NaCl (0,137 M) 0,20 g KCl (2,7 mM) 0,20 g KH 2 PO 4 (1,1 mM) 0,10 g de MgCl 2 · 6H 2 O (0,5 mM) 2,16 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mM) 0,10 g de CaCl2 anhydre (0,9 mM) H 2 O de 1 L |
| Dissoudre 4 g de paraformaldéhyde dans une fiole contenant 100 ml tampon phosphate salin (PBS) dans la hotte, couvrir le ballon. Placer le ballon sur un / bloc agitation de chauffage et remuer doucement la solution. Surveiller la température de sorte que soit atteint un maximum 65 ° C. Eviter la surchauffe. Une fois que le paraformaldéhyde est dissous et la solution semble claire, éteignez la chaleur mais laisser à remuer. Ne pas manipuler pour des raisons de sécurité. Laisser refroidir. Une fois refroidi, aliquote la solution et stocker à long terme -20 ° C dans un congélateur ou un réfrigérateur à 4 ° C pendant une semaine au maximum. | |
| BSA (albumine de sérum bovin), 10% (p / v) | Dissoudre 10 g de BSA dans 100 ml de H 2 O. Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 contraignant-um faible teneur en protéines. Conserver à 4 ° C. |
| DMSO / méthanol (20%) de solution de perméabilisation | Mélanger avec Dimethyl SulfoxideMéthanol (1: 4 analogies, volume total 100 ml). |
Tableau 1. Les solutions tampons.
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Discussion
Les étapes les plus critiques de la culture ex vivo du tissu conjonctif humain sont l'utilisation immédiate du tissu après l'ablation chirurgicale pour assurer la viabilité; le tissu doit rester en solution à moyen ou une solution saline en tout temps; maintenir une culture stérile; des coupes transversales de tissu doivent avoir une épaisseur maximale de 200 um; mise en place du système ex vivo de culture est optimale lorsque le tissu est en contact avec le milieu, mais non totalement immergée. Moyen convient d'ajouter que sur la chambre à l'extérieur du Transwell dans un petit volume (par exemple, 500 à 600 pi par 12 puits plaque de surface).
Le tissu conjonctif dérivé de Dupuytren de est empêtré dans une structure robuste à haute teneur en protéines ECM tels que le collagène, les protéoglycanes, et d'élastine; Grâce à ces propriétés et en outre en raison de myofibroblastes contracture il peut être difficile de couper à travers le tissu. Il est important d'utiliser des outils chirurgicales appropriées; incurvée blAded ciseaux Mayo pour couper des pièces plus grandes dans une égale épaisseur et petits ciseaux chirurgicaux pour couper les pièces de tissu plus petites (par exemple, si plusieurs parties de tissus sont nécessaires plaques utilisation de 24 puits).
Méthodes pour l'étude de DD sont des analyses histopathologiques de l'échantillon fibrotiques excisées, ou dérivation de fibroblastes primaires. Cellulaire dérivée de la matière du patient qui est fait est de deux façons; dans l'une des méthodes, des pièces de tissu sont mis en culture dans des plaques de culture en matière plastique pour un certain nombre de semaines jusqu'à ce que l'excroissance de fibroblastes. Le second procédé est un traitement enzymatique du tissu avec de la collagénase et de trypsine. La première méthode prend du temps, les propriétés fibroblastes sont modifiés en raison de conditions de culture et il ya passage dépendant de la variabilité entre les passages de la même lignée cellulaire. La méthode enzymatique est plus rapide et il peut être utilisé pour le tri de cellules dosages, cependant, le maintien in vitro de ces cellules sur la innée ECM ne reflète pas in vivo 25 (à savoir mechanoregulation et mécanotransduction). Perte des résultats de tension dans le démontage de fibres αSMA dans MFB en peu de temps 26. L'abondance de αSMA dans l'ex vivo 27, 28. En ce qui concerne la variabilité technique et biologique, notre méthode est reproductible (viabilité, réseau ECM) et moins sujettes à l'altération des tissus en raison de la brève durée de la culture. Par exemple, le procédé de fibroblastes excroissance nécessite plusieurs semaines, ce qui peut entraîner des changements biochimiques (par exemple, l'accumulation de mutations génétiques, de la sénescence réplicative). Cependant, les caractéristiques génétiques spécifiques aux patients et la variabilité biologique sont en soi des défis dans le domaine de la recherche DD et ne peuvent être abordées avec l'une des méthodes actuelles.
Comme indiqué dans ce protocole, des spécimens DD fibrotiques après ablation chirurgicale sont directement cultivées en ex vivo système 3D et / ou congélation instantanée. En fonction de la question scientifique, la modification du tissu est possible par addition de facteurs de croissance, des composés chimiques, virus médiée par la délivrance de gènes, d'oligonucléotides antisens et miARN. Composés peuvent être livrés dans les médias ou avec des micro-injections locales du tissu dans la chambre de culture 3D. Après trois et jusqu'à 7 jours de culture le tissu peut soit être homogénéisés pour l'isolement des cellules et analyse par FACS ou l'isolement de l'ARN total et les protéines pour l'analyse de profil d'expression, ainsi que pour l'analyse histologique traité. L'état de l'expression des protéines fibreuses (collagène de type αSMA, I et II, la fibronectine), l'architecture des tissus de la partie de nodule de la corde et la cohérence du réseau fibreux est évaluée avant et après les traitements. Afin de surveiller les réarrangements d'ECM pendant la culture, nous avons combiné le SHG (collagène) et deux photons de fluorescence excité (élastine) imagerie.
Les réarrangements extracellulaires peuvent ensuite être quantifiés ou modélisées en utilisant le logiciel d'image de quantification. Ces paramètres donnent une indication des effets des médicaments sur la fibrose ou molecUlar modifications qui ont été induites pendant la culture. En outre tableaux ECM peuvent également être effectuées sur des tranches simples pour générer une meilleure vue d'ensemble des effets. Globalement, nous avons établi un système robuste qui permet l'étude de la fibrose ex vivo.
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Disclosures
Les auteurs ont déposé une demande de brevet pour de Dupuytren la maladie: la culture d'organes 3D. # GB1307200. Contrats de licence et de services commerciaux sont disponibles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
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