Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Published: March 23, 2015 doi: 10.3791/52542
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Bioengineering, Clemson University
* These authors contributed equally

Abstract

מיפוי אופטי הוכיח להיות טכניקה יקרה כדי לזהות פעילות חשמלית של הלב על שני לבבות לשעבר שלם vivo ובmonolayers myocyte התרבותי. תאי HL-1 היו בשימוש נרחב כמודל סלולארי 2 ממדים ללימוד היבטים שונים של פיזיולוגיה של לב. עם זאת, זה כבר אתגר גדול לסידן המפה אופטי ארעיים (Ca) ופוטנציאל פעולה בו זמנית מאותו שדה הראייה בשכבת תא פרוזדורים תרבותית HL-1. סיבה לכך הוא טיפול וטיפול מיוחדים נדרש כדי להכין את התאים בריאים שיכול לנפול בפח חשמלי וממופים אופטי. לכן, פיתחנו פרוטוקול עבודה אופטימלי למיפוי אופטי ערוץ כפול. בכתב היד הזה, שתארנו בפירוט כיצד לבצע את ניסוי מיפוי אופטי ערוץ הכפול. פרוטוקול זה הוא כלי שימושי שנועד לשפר את ההבנה של התפשטות פוטנציאל פעולה וקינטיקה Ca בפיתוח הפרעות קצב.

Introduction

סידן ייחודי (Ca) ומתח (מ 'V) טכניקת מיפוי אופטי ערוץ כפול 1-5 מתגלה ככלי יעיל כדי להקליט בו זמנית אותות מ' V וCa בשני לבבות שלמים וmonolayers תאים בתרבית. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע רב עוצמה ביחס למערכת היחסים בין ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה כדי להבין טוב יותר את מנגנוני אלקטרו הבסיסיים של הפרעות בקצב לב.

monolayers תאים בתרבית הוכיח להיות מודל סלולארי שימושי ללמוד electrophysiology לב ואת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב. 4,6-8 HL-1 תאים קו תרבות myocyte פרוזדורים מאופיינים היטב. תאי HL-1 גם לשמור על גנוטיפ מובחן באופן ייחודי ופנוטיפ הכולל מורפולוגיים, אלקטרו, ומאפיינים תרופתיים של myocytes פרוזדורים המבוגר. תאים אלה מבטאים גני לב וחלבונים, כולל importaNT יון לב ערוצים (כלומר, L- וערוצי סידן T-סוג) 9 וisoforms הבוגר של חלבוני התכווצות sarcomeric בדרך כלל נמצא בmyocytes פרוזדורים מבוגר כמו אחרים ויש לנו שדווח בעבר. 10-13 בנוסף, HL-1 תאים יכולים להיות בתרבית כדי ליצור monolayer myocyte 2 ממדים (2-D). לפיכך, היתרונות של שימוש monolayers HL-1 התרבותי כוללים: 1) עלות וקלה יותר יחסית נמוכות כדי לשמור על קו תרבות myocyte מאשר הבידוד וculturing myocytes ילוד הראשוני; 2) monolayer ומחוברות של תאים מפחיתה את המורכבות המבניות הנובעות ממבנה 3-D של הלב; 3) monolayer תא יכול לחסל את ההפרעה של סיסטיק ביניים המתרחשת בלב שלם. זה יכול לשמש כדי לנתח פונקציות אלקטרו ספציפיות של קבוצה של myocytes ללא התערבות של fibroblasts ומטריצת ביניים; 4) הערכה של השלכות תפקודיות ממניפולציה תרופתית או גנטית ברחוב ללא מוצאmonolayers תא tured ניתן להשיג ביעילות. לכן, HL-1 תאים הפכו למודל סלולארי בשימוש נרחב ללימוד היבטים שונים של הפיסיולוגיה myocyte כמו גם פעילויות חשמליות חריגות מושרה צעדה. 13-16 monolayers תא בריא עם זאת, טיפול וטיפול מיוחד נדרש לתרבות המגיבים לחיצוני צעדה חשמלית ללימודי מיפוי אופטיים. בנוסף, הליך מכתים צבע ניאון כפול עשוי בקלות לגרום נזק לשלמות monolayers תא ומחוברות בתרבית. לפיכך, מ 'V ביצוע / מיפוי אופטי ערוץ כפול CA בmonolayers HL-1 בתרבית היה אתגר גדול.

מטרתה של שיטה זו היא לספק את השלבים העיקריים לביצוע בהצלחה מיפוי אופטי ערוץ כפול בmonolayers HL-1 בתרבית. כאן יש לנו סיפקנו פרטים רבים על פרוטוקול מותאם להכנת monolayer HL-1 התא, מיפוי אופטי ערוץ כפול של monolayer תאים בתרבית, ועיבוד נתוני מיפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פתרון הכנה

  1. נוראפינפרין פתרון (NP)
    1. לפזר 40 מ"ג של NP ל -25 מיליליטר של 30 מ"מ חומצה אסקורבית (חומצה אסקורבית .1475 g ב -25 מיליליטר מים מטוהרים מילי- Q (MQ). הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל נוראפינפרין (NP) הוא רגיש לאור.
    2. סנן את פתרון NP עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot הפתרון לmicrotubes סטרילי 1 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C. ברגע שהוקפא, NP יציב למשך חודש אחד.
  2. תקשורת בתוספת לשטוף וסופי Claycomb
    1. התחל עם 43.5 מיליליטר של מדיום Claycomb ולהשלים עם 5 מיליליטר של סרום שור העוברי (FBS), 0.5 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין, 0.5 מיליליטר של NP ו -1: 100 בדילול מלא L-גלוטמין לעשות 50 מיליליטר של מדיום Claycomb בתוספת סופי. הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל בינוני Claycomb הוא רגיש לאור.
    2. הכן את המדיום לשטוף Claycomb משתמש באותו המתכון כמו supבינוני ליישמם Claycomb מלבד להוסיף 5% FBS ולהשמיט את NP ורכיבי L-גלוטמין.
      הערה: התקשורת הסופית ולשטוף Claycomb תוספת טובה לשבועיים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס ללא חשיפה לאור ישירה.
  3. פתרון מעכב טריפסין סויה
    1. לפזר 25 מ"ג של מעכבי טריפסין סויה לתוך של פוספט Ca-חופשי וMg-חופשי של Dulbecco שנאגרו 100 מיליליטר (PBS).
    2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
      הערה: הפתרון מעוקר הוא יציב למשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.
  4. ג'לטין / פתרון ציפוי צלחת פיברונקטין
    1. ממיסים 0.1 גרם של ג'לטין לתוך 500 מיליליטר של מים MQ לעשות ג'לטין 0.02%.
    2. החיטוי, ואז לדלל 1 מיליליטר של פיברונקטין לתוך 199 מיליליטר של ג'לטין 0.02% ומערבבים בעדינות.
    3. Aliquot 6 מיליליטר של תמיסת הג'לטין לתוך צינורות נפרדים ולאחסן ב -20 ° C.
  5. פתרון מלח 'הנקס
    1. באמצעות מערבביםצלחת, לפזר את מלחי הבאים במי MQ (mmol / L), NaCl (136.9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (.4409), Nah 2 PO 4 (.4000), MgSO 4 (.8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (סך של 5.042), CaCl 2 (1.261).
  6. צבע רגיש סידן פתרון (Rhod2)
    1. לדלל 1 מ"ג של אבקה יבשה Rhod2 ב400 μl של 20% pluronic F-127 בDMSO לעשות Rhod2 לצבוע פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C.
    2. לדלל את הפתרון הזה מניית 1: 1,000 בפתרון מלח 'הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי.
  7. צבע רגיש מתח פתרון (Rh237)
    1. לדלל 5 מ"ג של Rh237 עם 2 מיליליטר של DMSO לעשות פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C. לדלל את מניות הפתרון 1: 1,000 בפתרון מלח 'הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי.

& #160; הערה: 1-4 פתרונות מבוסס על פרוטוקול תרבית תאי Claycomb HL-1 עם שינוי קל.

2. Passaging וCulturing HL-1 myocytes פרוזדורים על Coverslips

הערה: ניתן להשיג תאי HL-1 מד"ר Claycomb (אוניברסיטת מדינת לואיזיאנה).

  1. לגדול HL-1 תאים בצלוחיות T25 ולהאכיל עם 5 מיליליטר של Claycomb בינוני בתוספת יומית. מעבר התאים בT25 צנצנות בחמישה ימים על פי פרוטוקול Claycomb HL-1 תרבית תאים (שיפורט להלן) 10.
  2. coverslips המקום העגול (קוטר 20 מ"מ) לתוך צלחות תרבות 12 גם 24 שעות לפני תאי בקבוק T25 הם מחוברות באופן מלא ומוכן לpassaged, ולאחר מכן לכסות את coverslips עם ג'לטין / פיברונקטין הלילה בשעה 37 ° C.
  3. היום, לשאוב והבא זורק את הג'לטין / פיברונקטין מצלחות התרבות ולהחליף גם 1.5 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb תוספת בכל אחד.
  4. פיצול תאים מcultur T25בקבוק דואר לאחר שהגיע למפגש מלא ביום 5. לשאוב בינוני מהבקבוק T25 המכיל את התרבות ומחוברות ולשטוף את התרבות קצרה עם PBS על 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס ידי pipetting טריפסין / EDTA על החלק התחתון של בקבוק T25 כדי למנוע מגע ישיר עם התאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
  6. הסר טריפסין / EDTA על ידי שאיפה ולהוסיף עוד 1.3 מיליליטר של טריפסין / EDTA לכל בקבוק T25. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1 דקה. בדוק תחת מיקרוסקופ ואם תאים עדיין מחוברים לבקבוק, הקש כדי לסלק באופן מלא תאים הנותרים.
  7. להוסיף 1.3 מיליליטר של מעכבי טריפסין הסויה לתאים ותאי העברה מהבקבוק לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. יש לשטוף את הבקבוק הריק עם 5 מיליליטר של מדיום לשטוף Claycomb. להוסיף את לשטוף את התאים בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות.
  8. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ועדינות מחדש להשעות את התא גלולהב 6 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb בתוספת.
  9. זרעים היטב בכל צלחת 12 גם עם 0.5 מיליליטר של השעיה תא מתאי passaging. להאכיל את התאים עם מדיום הסופי Claycomb טרי בתוספת יומית.
    הערה: באופן קרוב לפקח על הצמיחה של התאים, בדרך כלל monolayers התא להגיע למעמד ומחוברות ביום 4 והפעילויות הספונטניות יישארו גלויות. לאחר מכן, monolayer התרבותי יהיה מוכן למיפוי אופטי ביום 4-5.

3. סידן טעינה ומתח צבעים רגישים לתאים

  1. ללימודי מיפוי אופטיים, להסיר בעדינות את coverslip מצלחת תרבית תאי 12 גם ולשטוף עם תמיסת מלח 'הנקס.
  2. כדי להכתים תאים עם הצבע רגיש Ca Rhod2, דגירה monolayer התא על coverslip עם 3 מיליליטר של חומץ (מבעבע עם 5% CO גז O 2 2/95%) פתרון Rhod2 עובד על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות .
  3. כדי להכתים את התאים עם צבע רגיש מ 'VRh237, לטבול את monolayer התא הטעון Rhod2 ל 3 מיליליטר של תמיסת חומץ Rh237 עובדת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות נוספות.

מיפוי 4. ערוץ כפול האופטי

  1. הנח את monolayer התא, שהוא כפול מוכתם במ 'V וצבעים Ca, לחדר מחזור במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השתמש במערכת דם מחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה של החדר בתא C ° 35 ± 1. לשלוט בזהירות את הטמפרטורה של perfusate על ידי התאמת מהירות הזרימה במחזור דרך החדר כדי להימנע משיפוע של יותר מ -0.3 מעלות צלזיוס פני התא.
    1. לפני ההקלטה מ 'V / אותות Ca, לשטוף את monolayer התא עם פתרון הנקס טרי לכ 5 דקות כדי להסיר את הצבע שנותר ממדרגות הצביעה הקודמות.
  2. monolayers תא בריא קצב באמצעות אלקטרודה דו קוטבית המורכבת מפיפטה זכוכית מלאה בתמיסת מלח 'הנקס וsilvאה החוט הכרוך סביב קצה פיפטה כמו בעבר תאר 12,17.
  3. monolayers קצב הבריא של תאים באורך מחזור של 200-500 רוחב msec ודופק של 2 אלפיות שניים, מצפה לסף צעדה בכ 1 mV.
    הערה: לכל אצווה של monolayers התרבותי, יש להשתמש בלפחות שני monolayers שאינם מטופלים על מנת לבחון את מצבו של התא אצווה. monolayers שליטה הבריא צריך להיות מסוגל להיות שנתפס על ידי קיצוב חשמל באורכי מחזור של 200-500 אלפיות שני. אם monolayers השליטה לא מצליח להיות בקצב חשמלי, זה מצביע על כך שכל התא אצווה עשוי שלא להיות מתאים לניסויי מיפוי אופטיים.
  4. כדי לעורר את שני מ 'V וצבעים רגישים Ca, שימוש במקור אור LED (520 ננומטר אורך גל) בשילוב עם מסנן עירור (510 ננומטר / 40) ומראה dichroic (561 ננומטר).
    1. לאסוף את אותות ניאון הנפלטים על ידי התאים באמצעות אובייקטיבי 40X ופיצול עם מראה dichroic (594 ננומטר) לרכיב מ 'V ומרכיב Ca.סנן את האור הנפלט בערוץ מ 'V עם מסנן ארוך לעבור (700 ננומטר) והאור הנפלט בערוץ Ca עם מסנן לעבור להקה (585/40 ננומטר).
    2. לאסוף את אור הניאון המסונן באמצעות שתי מצלמות CCD (80 x 80 פיקסלים, 1,000 תמונות בשניה; חולצה אדומה הדמיה).
    3. כדי להימנע photobleaching צבע, לבצע הקלטות בפחות מ 2 שניות על כל שדה הראייה להגביל את הזמן של חשיפה לאור. כאן, בדרך כלל תמונה ארבעה תחומים שונים לכל שכבה.

5. עיבוד נתונים של m V או הקלטות Ca

  1. לשניהם מ 'V ואותות Ca (80 x 80 פיקסלים), ממוצע ערכי העצמה של עשרים וחמש (5 x 5) פיקסלים שכנים לערך עוצמה אחד בנקודות זמן הקלטה שונות כדי להפחית את רעש רקע.
    הערה: לאחר מיצוע הנתונים, כל נקודת זמן הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca מניבה מטריצת נתונים המכילה 16 x 16 בממוצע ערכי עוצמה (בממוצעערוצי נתונים) עם רזולוציה מרחבית של 50 מיקרומטר.
  2. להגדיר זמן הפעלה (AT) של מטר V מוקלט או אותות Ca.
    1. כדי להגדיר זמן הפעלה (AT) של פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca, לקבוע את הזמן של 50% משיא של משרעת מ 'V או אותות Ca באמצעות אלגוריתם המבוסס על MATLAB מחוייט כפי שתואר לעיל. 12
    2. ידני להגיה ATS ניתח לחסל את כל שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ניתוח התכנית.
    3. חנות המוגדר במטריקס (16 x 16 בממוצע נתוני ערוצים) של פוטנציאל פעולה נרשם וחולף סידן, בהתאמה, בתוכנה בשימוש.
  3. לחשב פוטנציאל פעולה או וקטורי סידן חולפים מהירות הולכה (CV) במטריצת AT תוך שימוש בשיטת ניתוח שדה וקטורים כפי שתואר לעיל עם שינויים קלים 12,18.
    1. לחשב את וקטור קורות החיים של ערוץ נתונים ביחס לסביבתו בנקודות נתונים (5 ×; 5 שכנים בממוצע ערוצי נתונים) כדי לדמות משטח חלק פולינום פעמים הפעלה (על פני שטח) באמצעות אלגוריתם לפחות מרובע בתכנית MATLAB 12,18.
    2. לחשב וקטור הולכה תוך שימוש בנוסחות שלהלן
      פורמולה 1:
      משוואת 1
      פורמולה 2:
      θ = arctan [(dy / DT) / (DX / DT)]
      הערה: Ve היא וקטור קורות חיים המוקרנים בקואורדינטות x ו- y צירים; dx / dt היא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר X; dy / dT הוא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר y. T הוא משטח AT; x, y מתייחס ל2-D מרכז; T x = ∂T / ∂x הוא נגזר החלקית של T ביחס לx; y T = ∂T / ∂y הוא נגזר החלקית של T ביחס לy; θ הוא הכיוון הסופי של וקטור קורות חיים.
    3. קבוצה כל הווקטורים של מטריצת AT ל -36 מסלולים, כל אחד מהם מכסים מגזר עשר מעלות במצפן. </ Li>
    4. בחר את המסלול המכיל את האוכלוסייה הגדולה ביותר של וקטורי קורות החיים בין מסלולי ההולכה 36. לחשב את קורות החיים הממוצע של מסלול זה לייצג את קורות החיים של השכבה.

6. ויזואליזציה של התפשטות גלים הפתוחה

  1. לנרמל את עוצמת האות של פוטנציאל אישי פעולה או חולף Ca בנקודות זמן הקלטה שונות ביחס לשווי השיא שלה באמצעות תוכנת MATLAB.
  2. באופן זמני לאחסן את נתוני עוצמת המנורמל של כל נקודת זמן שנרשם למטריצת עוצמה 16 x 16 בתוכנת MATLAB בשימוש.
  3. לבנות מפת עוצמה בצבעים ממטריצת העצמה מאוחסנת של כל נקודת זמן הקלטה באמצעות פונקצית surf.m.
    הערה: במפת העצמה, אדום מייצגת בעוצמה גבוהה של מטר V או אותות Ca, וכחולה משקפת בעצימות נמוכות של אותות הקרינה.
  4. צור קובץ .avi באמצעות פונקצית avifile.m.
  5. שמור את כל iמפות ntensity בנקודות זמן הקלטה שונות של פוטנציאל הפעולה או חולף Ca באמצעות פונקצית addframe.m.
    הערה: בשלב זה, שני קבצי avi נפרדים של m V והתפשטות Ca יופקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monolayer ומחוברות תרבותית מציגה קצב פנימי רגיל, כפי שהודגמה בסרט 1. לאחר מכן, אנו מבוצעים מ 'V מיפוי אופטי ערוץ כפול / Ca בשכבה HL-1 ומחוברות באופן מלא. איור 1 א מציג עקבות דוגמא מ' V ואותות Ca מנרשם בודד הכה. מפות isochronal נציג מ 'V מופץ באופן אחיד ואותות Ca באמצעות מערכת המיפוי אופטי ערוץ הכפולה מוצגות ב1B דמויות ו1C. תמונות כרונולוגי נציג של פוטנציאל פעולה מופץ באופן אחיד וארעיים Ca התקבלו מאותה התרבות monolayer HL-1. לבסוף, סרטים 2 ו -3 לספק דוגמאות אנימציה של פוטנציאל מופץ באופן אחיד פעולה (סרט 2) וסידן חולף (סרט 3) בשכבה ומחוברות HL-1.

-page = "תמיד"> איור 1
איור 1: () עקבות דוגמה למ 'V (כחול) וCa (אדום) מפעימה חשמלית בקצב באורך מחזור (CL) של 500 אלפיות שניים. (ב) תמונה של מערכת המיפוי האופטית שלנו לHL-1 monolayers. מפת isochronal של התפשטות פוטנציאל פעולה מאותו הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (C). מפת isochronal של התפשטות חולפת Ca מאותה הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (D). בשתי מפות isochronal, זמן לשגות מיוצג עם צבעים, מתחיל בכחול כהה ייזום ואדום כהה ב 50 אלפיות שניים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
איור 2: (א) בסדרת מפות של הפצה מ 'V של 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה. (ב) מפות של הפצת Ca ב 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה.

סרט 1: סרט נציג נרשם ממחוברות monolayer HL-1 ביום תרבות חמש, תחת מיקרוסקופ אור עם מטרת 40X.

סרט 2: סרט מייצג של פוטנציאל פעולה מופץ מפעימה בקצב בCL של 500 אלפיות שניים.

סרט 3: סרט מייצג של חולף Ca מופץ מpaced הכה בCL של 500 אלפיות שניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר את ההיבטים המרכזיים של מיפוי אופטי בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 מוכתמת בצבעי ניאון רגישים סידן ומתח. זה כולל culturing monolayer אופטימלי HL-1 תא, התקנה של ציוד המיפוי, מיפוי monolayer תרבותי, וניתוח נתונים.

כדי למפות בהצלחה תאים בתרבית, המפתח הוא להכין monolayer תא מפוזר באופן אחיד. כאשר זריעת התאים לcoverslips, להיות בטוח כדי לפזר באופן שווה את התאים. תמיד מפת monolayers תא מלאה גדל ומחוברות לחלוטין, כמו אלה יגיבו הטובים ביותר לצעדה חשמלית. כמו כן, חשוב לשמור על התאים מחומצן בעת ​​טעינת הצבעים, אבל בועות החמצן לא צריכה לבוא במגע ישיר עם התאים כמו זה עלול להרוג או לסלק אותם מcoverslip. הפחתת ריכוז לצבוע והפחתת עוצמת אור יקטן גודל אות ולהפחית יחס אות לרעש, תוך הגדלת concentrati צבעובשיפור עוצמת אור יגדל עוצמת אות, אלא גם להגדיל את הרעש. לכן, איזון אופטימלי של ריכוז צבע ניאון וכוח אור העירור צריך להיקבע על מנת לשפר את יחס האות לרעש של אותות הקלטה. יתר על כן, בעת הקלטת מיפוי אופטית, להיות בטוח כדי למנוע חשיפה של monolayer התא לחשיפות של אור מרוכז כל עוד זה עלול לגרום לניזק לתאים פוטודינמי בתחום האור חשוף. לבסוף, מערכת מיפוי אופטית המספקת רזולוציה של זמן ומרחב גבוהה של אותות הקלטה נדרשת לקבלת נתונים באיכות גבוהה.

בעוד מיפוי אופטי ערוץ כפול בלב שלם יש פוטנציאל גדול ללימוד electrophysiology לב בשל יכולתו לאותות מתח וסידן לאסוף בו-זמנית, מגבלה אחת היא שטכניקה זו אוספת מידע משטח 3-D כמפת הקרנת 2-D. הנתונים שהתקבלו 2-D מלב שלם עם מידע התעלם מcurvat 3-Dיור של הלב יכול לגרום לשגיאות נתונים בניתוחים, במיוחד בניתוח מהירות הולכה. עם היתרונות של שימוש HL-1 מודל 2-D בתרבית תאי, אנו מסוגלים לדמיין מקצבים קבועים וסדירים, להעריך חולף Ca וקינטיקה פוטנציאל פעולה, לקבוע מהירות הולכה ולאפיין Ca ודפוסי התפשטות פוטנציאל פעולה (אחיד או שאינה התפשטות אחידה) בלי להתערב ממבנה 3-D של לב שלם. לכן, מיפוי בהצלחה שני ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 כגישה חינם יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של מאפייני אלקטרו של myocytes פרוזדורים והמנגנונים של arrhythmogenesis פרוזדורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר Claycomb למתן תאי HL-1 ופרוטוקול תחזוקה מפורט. כמו כן, אנו רוצים להודות לגב 'אלנה קאריו וד"ר סת Robia על סיועם ביצירת סרט התא ומר פיט קארון לעזרתו בהכנה כמה אבזרים למערכת הערוץ הכפולה שלנו מיפוי אופטי.

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 לXA), המכונים הלאומי לבריאות (HL113640 לXA), וויולה אוניברסיטת מחקר קרן לפיתוח (לXA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
  3. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  4. Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
  5. Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
  6. Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
  7. Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
  8. Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
  9. Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
  10. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  11. Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
  12. Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
  13. White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
  14. Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
  15. Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
  16. Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
  17. Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
  18. Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 97 מיפוי אופטי סלולרי monolayer פרוזדורים תרבותי פוטנציאל פעולה חולף סידן מתח רגיש לצבוע צבע סידן
מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W.,… More

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter