Abstract
光学映射已被证明是有价值的技术来检测心电活动上都完好体外心和在培养的心肌细胞单层。的HL-1细胞已被广泛地用作用于研究心脏生理学的各个方面的2维细胞模型。但是，它已经受到了极大的挑战光学地图钙（Ca）瞬态和动作电位同时从相同的视野中培养HL-1心房细胞单层。这是因为特殊的处理和护理，需要准备一个可以电捕获并光学映射健康细胞。因此，我们已开发了一种最佳的工作协议进行双通道光学测绘的。在这个手稿中，我们已经详细介绍了如何进行双通道光的映射实验。这个协议是一个有用的工具，以提高动作电位传播和Ca动力学心律失常发展的理解。
Introduction
独特的钙（Ca）和电压（V M）双通道光映射技术1-5正在成为一种有效的工具，同时记录V M和钙信号在两个完整的心和培养细胞单层。该技术使得有可能获得关于钙瞬变和动作电位之间的关系，以便更好地理解心律失常的底层电机制有力的信息。
培养的细胞单层已被证明是研究心脏电生理和心律失常的基本机制的有用的细胞模型。4,6-8的HL-1细胞是充分表征的心房肌细胞培养线。 HL-1细胞也保持着独特的差异化基因型和表现型，包括形态，电生理和成人心房肌细胞的药理特性。这些细胞表达心肌基因和蛋白质，包括性重要nt的心脏离子通道（ 即 ，L和T型钙通道）9和肌节收缩蛋白的成熟异构体通常在成人心房肌细胞作为其他人发现，我们以前曾报道10-13此外，HL-1细胞可以是培养，以形成一个2维（2-D）的肌细胞单层。因此，使用培养的HL-1单层的优点包括：1）较低的成本，更容易保持一个心肌细胞培养系不是分离和培养原代新生心肌细胞; 2）细胞的汇合单层减少而导致的心脏的3-D结构的结构的复杂性; 3）细胞单层可以消除间质纤维化的发生在完整心脏的干扰。这可以用来解剖一组肌细胞的特定电功能，而不成纤维细胞和间质基质的干扰; 4）药物或基因操纵的小路评估功能的后果捕获的原始图像的细胞单层，可以有效地实现。因此，HL-1细胞已经成为研究肌细胞生理学的各个方面以及起搏诱导的异常电活动的一个广泛使用的细胞模型13-16然而，特殊的处理和护理需要培养健康细胞单层，为了响应外部电起搏光学定位研究。此外，双荧光染料染色过程可能会很容易损坏的培养融合细胞单层的完整性。因此，在执行V 米/ CA双通道培养HL-1单层光学标测受到了极大的挑战。
该方法的目标是提供的关键步骤为在培养的HL-1单层成功执行双通道光学测绘的。在这里，我们提供了大量具体的细节上的优化协议HL-1细胞单层的准备，培养的细胞单层双通道光学测绘，测绘数据处理。
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Protocol
1.溶液制备
- 去甲肾上腺素（NP）溶液
- 溶解40毫克的NP的成将25ml 30mM的抗坏血酸（0.1475克抗坏血酸在25ml纯化的Milli-Q（MQ）水。该溶液在制备过程中避免直接光照，因为去甲肾上腺素（NP）是光敏感的。
- 过滤用0.22μm注射器滤器对NP溶液。分装，在-20℃下将溶液在1ml无菌微量管和存储。一旦冻结，NP为稳定一个月。
- 辅以洗净，最后Claycomb媒体
- 先从43.5毫升Claycomb培养基和补充用5毫升胎牛血清（FBS），0.5 ml的青霉素/链霉素，0.5毫升的NP和1：100稀释的L-谷氨酰胺，使50最后补充Claycomb培养基中。这种溶液的制备过程中应避免直射光照射，因为Claycomb介质对光敏感。
- 使用相同的配方为SUP准备洗Claycomb媒体除了执行完成Claycomb中添加5％FBS和省略NP和L-谷氨酰胺的组件。
注：存放于4℃无直射光照射时，最后的补充和冲洗Claycomb媒体是很好的两周。
- 大豆胰蛋白酶抑制解决方案
- 溶解的大豆胰蛋白酶抑制剂25毫克到100ml无钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 过滤用0.22微米注射器过滤该溶液。
注：储存在4℃下时，灭菌溶液是稳定一个月。
- 明胶/盘纤连蛋白涂液
- 将0.1g明胶到500ml MQ水中，使0.02％的明胶。
- 反应釜，然后稀释1毫升纤维连接蛋白进入199毫升0.02％的明胶，轻轻混匀。
- 等分6毫升的明胶溶液成单独的管中并储存在-20℃。
- 汉克斯'盐溶液
- 使用搅拌板，溶解在MQ水中（毫摩尔/升）以下的盐类，氯化钠（136.9），氯化钾（5.366），KH 2 PO 4（0.4409），将NaH 2 PO 4（0.4000），硫酸镁 （0.8142），D-葡萄糖（5.051）， 碳酸氢钠 （4.162），HEPES（5.042）， 氯化钙 （1.261）。
- 钙敏感染料（Rhod2）解决方案
- 稀释的1mg Rhod2干粉在400微升20％的Pluronic F-127的DMSO作Rhod2染料原液并储存在-20℃。
- 这种稀释原液1：1000用Hanks'盐溶液在实验开始前，作最后的工作方案。
- 电压敏感染料（Rh237）解决方案
- 稀释5毫克Rh237的用2毫升DMSO中，使储液并储存在-20℃。稀释原液1：1000用Hanks'盐溶液在实验开始前，作最后的工作方案。
＆＃160;注：1-4的解决方案是基于Claycomb HL-1细胞培养协议轻微修改。
2.传代培养和HL-1心房肌细胞到盖玻片
注：HL-1细胞可以从Claycomb博士（路易斯安娜州立大学）获得。
- 生长的HL-1细胞在T25烧瓶和饲料用5ml补充Claycomb中等每日。通道中的细胞在T25根据Claycomb HL-1细胞培养物的协议（以下描述）10烧瓶每五天。
- 地方圆形盖玻片（20毫米直径）到12孔培养板中之前24小时，将细胞在T25烧瓶中完全汇合，并准备进行传代，然后盖上明胶/纤连蛋白过夜，在37℃的盖玻片。
- 第二天，吸出并丢弃从培养板中的明胶/纤连蛋白和替换用1.5ml在每个补充最终Claycomb介质的井。
- 从T25文化性拆分单元格Ë烧瓶中，在5天达到完全汇合后，弃从含有汇合培养的T25烧瓶中的培养基和冲洗培养简要地用PBS在37℃。
- 抽吸PBS并且加入3毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA，在37℃吹打的胰蛋白酶/ EDTA到T25烧瓶的底部，避免与细胞直接接触。孵育在37℃下1分钟。
- 通过抽吸除去胰蛋白酶/ EDTA，并添加每个T25烧瓶另一个1.3毫升胰蛋白酶/ EDTA中。在室温下孵育1分钟。检查在显微镜下，如果细胞仍然附着在烧瓶中，点击要充分打跑剩余的细胞。
- 添加1.3毫升大豆胰蛋白酶抑制剂，从烧瓶内的细胞和细胞转移到15ml离心管中。冲洗用5毫升洗净Claycomb介质的空烧瓶中。漂洗添加到细胞中，在15ml离心管中。离心，在500×g离心5分钟。
- 离心，吸出上清液，并轻轻后重新悬浮细胞沉淀6毫升补充决赛Claycomb介质。
- 种子在12孔平板的每个孔用0.5ml从细胞传代细胞悬浮液。每天喂细胞新鲜辅以最终Claycomb媒介。
注：密切监测细胞的生长，通常细胞单层达到汇合状态在第4天，并自发活动保持可见。然后，将培养的单层将准备在4-5天的光学测绘的。
3.装载钙和电压敏感染料的细胞
- 用于光学作图研究，轻轻地从12孔细胞培养板除去盖玻片和冲洗用Hanks'盐溶液。
- 染色的细胞用钙敏感染料Rhod2，孵育在盖玻片的细胞单层用3ml的充氧，在37℃的水浴中30分钟Rhod2工作溶液（用5％的CO 2/95％O 2气鼓泡） 。
- 染色的细胞在V 米敏感的染料Rh237，浸入Rhod2加载细胞单层分为3毫升含氧Rh237工作溶液，在37℃的水浴中另外15分钟。
4.双通道光映射
- 将单层细胞，这是双沾满V M和钙染料，插入一个倒置荧光显微镜循环室。使用加热的循环体系，以保持细胞室的温度在35±1℃。小心通过调节循环流的速度通过腔室，以避免超过0.3℃，在整个腔室的梯度控制所述灌流液的温度。
- 记录V M /钙信号之前，用新鲜的Hanks液洗细胞单层约5分钟，以从先前的染色步骤除去剩余的染料。
- 使用双极电极的玻璃吸移管填充用Hanks'盐溶液和SILV组成步伐健康细胞单层呃丝枪头周围卷绕如前所述12,17。
- 吴佩慈健康的细胞单层在200-500毫秒，脉冲2毫秒宽度的周期长，期待起搏阈值约为1毫伏。
注：对于每一批培养单层的，至少有两个非处理单层应当用于测试细胞批次的状态。健康对照单层应当能够被电起搏在200-500毫秒周期长度捕获。如果控制单层不能被电节奏，这表明，整个细胞批次可能不适合用于光学测绘实验。 - 激励两个V M和钙敏感性染料，可使用的LED光源（520纳米波长）加上一个激励滤光器（510纳米/ 40）和一个二向色镜（561纳米）。
- 收集通过40X物镜和分割用分色镜（594纳米）成V 米组分和Ca成分由细胞发出的荧光信号。过滤在V 米通道的发射光具有长通滤波器（700纳米），发射的光中的钙通道有一个带通滤波器（四十分之五百八十五纳米）。
- 收集用两台CCD照相机（80×80像素，1000 fps的;红衫成像）将过滤的荧光。
- 为了避免染料光漂白，使录音为小于2秒上的每个视场限制光曝光的时间。这里，典型的图像的每个单层四个不同的区域。
的V M或Ca录音5.数据处理
- 为V M和Ca信号（80×80像素），平均的25（5×5）的强度值的相邻像素成在不同的记录时间点的一个强度值以减少背景噪声。
注：该数据平均后，个人动作电位和钙瞬变每次录制时间点产生含有16×16的平均亮度值的数据矩阵（平均数据信道）为50微米的空间分辨率。 - 定义的记录，V M或Ca信号激活时间（AT）。
- 以限定的单个动作电位或钙瞬变的激活时间（AT），确定的在V m或者使用一个基于MATLAB定做算法钙信号的峰值幅度的50％的时间，如前所述。12
- 手动校对所分析的AT来消除程序分析期间可能发生的任何错误。
- 存储所述所定义的AT矩阵（16×16平均数据信道）分别记录动作电位和钙瞬变，在所使用的软件。
- 计算上使用矢量场分析方法如先前稍作修改12,18中描述的AT矩阵动作电位或钙瞬变传导速度（CV）的载体。
- 计算数据信道相对于其周围的AT的数据点的CV载体（5×; 5相邻平均数据信道），使用中的MATLAB程序12,18最小二乘算法，模拟的激活时间（AT表面光滑多项式表面）。
- 使用以下公式计算传导矢量
式1：
配方2：
θ=反正切[（DY / DT）/（DX / DT）]
注：Ve为在x轴和y轴投射在简历矢量; DX / DT是在X轴上的CV矢量的投影; DY / DT是在y轴的CV向量的投影。 T是所述AT表面上;的x，y指的是2-D坐标为的T x =∂T/狓是T的关于x的偏导数; ŤY =∂T/狔是T的相对于y的偏导数; θ是一个简历矢量的最终方向。 - 所述AT矩阵的组中的所有矢量成36通路，其每一个覆盖指南针上的10度扇区。</ li>
- 选择包含36传导通路之间的CV向量的人口最多的途径。计算这个途径的平均CV代表单层的CV。
6.可视化的波前传播
- 正常化的在相对于利用MATLAB软件其峰值不同的记录时间点的单个动作电位或Ca瞬态信号的强度。
- 每记录的时间点的归一化强度数据暂时存储到在所使用的MATLAB软件一个16×16的强度矩阵。
- 构造从使用surf.m函数的每个记录时间点的存储的强度矩阵的彩色编码强度地图。
注：在强度图，红色代表的V 米或钙信号强度高，蓝色体现的荧光信号的强度低。 - 创建使用avifile.m功能的.avi文件。
- 保存所有的I在动作电位或Ca瞬态不同的记录时间点使用addframe.m函数ntensity地图。
注意：在这一点上，将产生的V M和Ca传播两个独立的AVI文件。
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Representative Results
有文化的融合单层呈现有规律的内在节奏表现在电影1。然后，我们执行的V 米/钙双通道光映射在一个完全融合的HL-1的单层。 图1A显示了V M和钙信号的例子痕迹从记录单击败。均匀地传播V M和使用该双通道光学测绘系统的Ca信号代表等时的地图显示在图1B和1C。均匀地传播动作电位和钙瞬变代表时间顺序的图像是从同一的HL-1培养单层获得。最后， 影2和3提供的均匀传播动作电位（ 电影2）和在所述的HL-1融合单层钙瞬变（ 电影3）动画的例子。
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图1： （A），从电的节奏跳动V M（蓝色）和钙（红色）在500毫秒的周期长度（CL）示例痕迹。 （B）我们的光学标测系统的HL-1单层的图像。 （C）动作电位传播从整个视场相同的节奏跳动的等时的地图。 （D）钙瞬变传播从整个视场相同的节奏跳动的等时的地图。在这两个等时的地图，时间的推移表示颜色，从深蓝色的启动和暗红色，在50毫秒。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2： 在60（A）中的一系列的V M分布图，80，140，和记录开始后200毫秒。钙分布的（B）的地图，在60，80，140，和记录开始后200毫秒。
电影1：记录从融合HL-1的单层文化日5，光学显微镜下用40X的目标代表的电影。
电影2 ：从一个节奏跳动传播的动作电位在500毫秒的CL代表电影。
电影3 ：传播的钙瞬变从PAC代表电影ED击败在500毫秒的CL。
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Discussion
本文介绍了培养HL-1心房肌细胞单层染色钙和电压敏感的荧光染料的光映射的关键方面。它包括培养的最佳的HL-1细胞单层，设置的映射设备，映射培养单层，和数据分析。
要成功映射培养细胞，关键是要准备一个均匀分布的单层细胞。当播种到盖玻片细胞，一定要均匀地分散细胞。始终映射完全长大，完全融合细胞单层，因为这些将最好的电起搏回应。同样重要的是，保持在加载染料氧化的细胞，但该氧气泡不应该接触到的细胞，因为这可能会杀死或从盖玻片撞出它们直接接触。降低染料浓度，减少光强度将降低信号幅度和降低信噪比，同时增加染料concentrati并提高光的强度会增加信号幅度也增加噪音。因此，荧光色素的浓度和激发光的强度的最佳平衡，必须确定以增强信号，以记录信号的信噪比。此外，光映射录制过程中，一定要避免暴露单层细胞，以集中光长时间曝光，因为这可能会导致光暴露区域内的光动力细胞损伤。最后，光学测绘系统，提供的记录信号的高的时间和空间分辨率，需要用于获得高质量的数据。
而在完整心脏双通道光学测绘具有用于研究心脏电生理由于它能够同时收集电压和钙信号的潜力很大，一个限制是该技术收集作为二维投影图，从一个三维表面信息。从完整心脏获得的2-D数据与三维curvat忽略信息心脏的URE可能会导致错误的数据分析，尤其是传导速度的分析。利用培养的2-D HL-1细胞模型的优点，我们能够形象化定期和不定期的节奏，评估钙瞬变和动作电位动力学，确定传导速度和表征Ca和动作电位传播的模式（均匀或非均匀传播），而不从完整心脏的3-D结构的干扰。因此，在培养的HL-1心房肌细胞单层作为一个免费的方式成功地映射两种钙瞬变和动作电位可以大大提高心房肌细胞的电生理特性和心房心律失常的基本机制的理解。
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Acknowledgments
我们要感谢Claycomb博士提供HL-1细胞和详细的维护协议。我们还要感谢埃琳娜·卡里略女士和赛斯Robia博士为他们与产生细胞电影和皮特卡隆先生的协助做一些配件为双通道光学标测系统的援助。
这项工作是由美国心脏协会（10GRNT3770030＆12GRNT12050478为XA），国立卫生研究院（HL113640到XA），和Loyola大学的研究发展基金（以XA）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
References
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