This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
מיפוי אופטי הוכיח להיות טכניקה יקרה כדי לזהות פעילות חשמלית של הלב על שני לבבות לשעבר שלם vivo ובmonolayers myocyte התרבותי. תאי HL-1 היו בשימוש נרחב כמודל סלולארי 2 ממדים ללימוד היבטים שונים של פיזיולוגיה של לב. עם זאת, זה כבר אתגר גדול לסידן המפה אופטי ארעיים (Ca) ופוטנציאל פעולה בו זמנית מאותו שדה הראייה בשכבת תא פרוזדורים תרבותית HL-1. סיבה לכך הוא טיפול וטיפול מיוחדים נדרש כדי להכין את התאים בריאים שיכול לנפול בפח חשמלי וממופים אופטי. לכן, פיתחנו פרוטוקול עבודה אופטימלי למיפוי אופטי ערוץ כפול. בכתב היד הזה, שתארנו בפירוט כיצד לבצע את ניסוי מיפוי אופטי ערוץ הכפול. פרוטוקול זה הוא כלי שימושי שנועד לשפר את ההבנה של התפשטות פוטנציאל פעולה וקינטיקה Ca בפיתוח הפרעות קצב.
סידן ייחודי (Ca) ומתח (מ 'V) טכניקת מיפוי אופטי ערוץ כפול 1-5 מתגלה ככלי יעיל כדי להקליט בו זמנית אותות מ' V וCa בשני לבבות שלמים וmonolayers תאים בתרבית. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע רב עוצמה ביחס למערכת היחסים בין ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה כדי להבין טוב יותר את מנגנוני אלקטרו הבסיסיים של הפרעות בקצב לב.
monolayers תאים בתרבית הוכיח להיות מודל סלולארי שימושי ללמוד electrophysiology לב ואת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב. 4,6-8 HL-1 תאים קו תרבות myocyte פרוזדורים מאופיינים היטב. תאי HL-1 גם לשמור על גנוטיפ מובחן באופן ייחודי ופנוטיפ הכולל מורפולוגיים, אלקטרו, ומאפיינים תרופתיים של myocytes פרוזדורים המבוגר. תאים אלה מבטאים גני לב וחלבונים, כולל importaNT יון לב ערוצים (כלומר, L- וערוצי סידן T-סוג) 9 וisoforms הבוגר של חלבוני התכווצות sarcomeric בדרך כלל נמצא בmyocytes פרוזדורים מבוגר כמו אחרים ויש לנו שדווח בעבר. 10-13 בנוסף, HL-1 תאים יכולים להיות בתרבית כדי ליצור monolayer myocyte 2 ממדים (2-D). לפיכך, היתרונות של שימוש monolayers HL-1 התרבותי כוללים: 1) עלות וקלה יותר יחסית נמוכות כדי לשמור על קו תרבות myocyte מאשר הבידוד וculturing myocytes ילוד הראשוני; 2) monolayer ומחוברות של תאים מפחיתה את המורכבות המבניות הנובעות ממבנה 3-D של הלב; 3) monolayer תא יכול לחסל את ההפרעה של סיסטיק ביניים המתרחשת בלב שלם. זה יכול לשמש כדי לנתח פונקציות אלקטרו ספציפיות של קבוצה של myocytes ללא התערבות של fibroblasts ומטריצת ביניים; 4) הערכה של השלכות תפקודיות ממניפולציה תרופתית או גנטית ברחוב ללא מוצאmonolayers תא tured ניתן להשיג ביעילות. לכן, HL-1 תאים הפכו למודל סלולארי בשימוש נרחב ללימוד היבטים שונים של הפיסיולוגיה myocyte כמו גם פעילויות חשמליות חריגות מושרה צעדה. 13-16 monolayers תא בריא עם זאת, טיפול וטיפול מיוחד נדרש לתרבות המגיבים לחיצוני צעדה חשמלית ללימודי מיפוי אופטיים. בנוסף, הליך מכתים צבע ניאון כפול עשוי בקלות לגרום נזק לשלמות monolayers תא ומחוברות בתרבית. לפיכך, מ 'V ביצוע / מיפוי אופטי ערוץ כפול CA בmonolayers HL-1 בתרבית היה אתגר גדול.
מטרתה של שיטה זו היא לספק את השלבים העיקריים לביצוע בהצלחה מיפוי אופטי ערוץ כפול בmonolayers HL-1 בתרבית. כאן יש לנו סיפקנו פרטים רבים על פרוטוקול מותאם להכנת monolayer HL-1 התא, מיפוי אופטי ערוץ כפול של monolayer תאים בתרבית, ועיבוד נתוני מיפוי.
מאמר זה מתאר את ההיבטים המרכזיים של מיפוי אופטי בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 מוכתמת בצבעי ניאון רגישים סידן ומתח. זה כולל culturing monolayer אופטימלי HL-1 תא, התקנה של ציוד המיפוי, מיפוי monolayer תרבותי, וניתוח נתונים.
כדי למפות בהצלחה תאים ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לד"ר Claycomb למתן תאי HL-1 ופרוטוקול תחזוקה מפורט. כמו כן, אנו רוצים להודות לגב 'אלנה קאריו וד"ר סת Robia על סיועם ביצירת סרט התא ומר פיט קארון לעזרתו בהכנה כמה אבזרים למערכת הערוץ הכפולה שלנו מיפוי אופטי.
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 לXA), המכונים הלאומי לבריאות (HL113640 לXA), וויולה אוניברסיטת מחקר קרן לפיתוח (לXA).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
DMSO | sigma | 276855 | |
Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
NaCl | sigma | S7653 | |
KCl | sigma | P3911 | |
KH2PO4 | sigma | P0662 | |
NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
MgSO4 | sigma | M7506 | |
D-Glucose | sigma | G8270 | |
NaHCO3 | sigma | S6014 | |
CaCl2 | sigma | C3881 | |
HEPEs | sigma | H3375 |