Напряжение и кальция Dual Channel Оптический Картирование Искусственный HL-1 мерцательной миоцитов монослоя
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Оптический отображение оказался ценный метод для обнаружения сердечной электрической активности на обоих нетронутыми экс естественных сердца и в культуре миоцитов монослоев. HL-1 клетки были широко использованы в качестве 2-мерных клеточной модели для изучения различные аспекты физиологии сердца. Тем не менее, она была большой проблемой для оптического карту кальция (Ca) переходных процессов и потенциалов действия одновременно с одной и той же поле зрения культурно HL-1 предсердий клеточного монослоя. Это потому, что специальная обработка и уход требуется подготовить здоровые клетки, которые могут быть электрически захваченных и оптически карту. Таким образом, мы разработали оптимальное рабочего протокола для двухканального оптического картирования. В этой рукописи, мы подробно описали, как выполнить двухканальный эксперимент оптический отображения. Этот протокол является полезным инструментом для улучшения понимания распространения потенциала действия и Ca кинетики в развитии аритмий.
Introduction
Уникальный кальция (Ca) и напряжения (V м) техника двухканальный оптический отображение 1-5 становится эффективным инструментом одновременно записывать V м и Ca сигналы в обоих интактных сердцах и культурных монослоев клеток. Эта методика дает возможность получить мощный информацию о взаимосвязи между переходных кальция и потенциалов действия, чтобы лучше понять основные электрофизиологические механизмы аритмий сердца.
Искусственный монослоя клеток оказались полезными сотовой моделью для изучения сердечной электрофизиологии и основной механизм развития аритмий. 4,6-8 HL-1 клетки хорошо характеризуется предсердий миоцитов культура линия. HL-1 клетки также поддерживать однозначно дифференцированные генотип и фенотип, который включает в себя морфологические, электрофизиологические и фармакологические характеристики взрослых предсердий миоцитов. Эти клетки экспрессируют кардиальные гены и белки, в том числе IMPORTANT сердца ионные каналы (т.е. L- и Т-типа кальциевых каналов) 9 и зрелые изоформы саркомерных белков сократительных обычно находятся у взрослых предсердий миоцитов, как другие, и мы уже ранее сообщали. 10-13 Кроме того, HL-1 клетки могут быть культивируют для формирования 2-мерный (2-D) миоцитов монослой. Таким образом, преимущества использования культивируемых HL-1 монослои включают: 1) относительно низкую стоимость и проще поддерживать миоцитов культуры линии, чем выделение и культивирование первичных новорожденных миоцитов; 2) сливная монослой клеток снижает структурные сложности, которые возникают при 3-D структуры сердца; 3) монослой клеток может устранить интерференцию интерстициального фиброза, что происходит в интактной сердца. Это может быть использован для анализировать конкретные электрофизиологические функции группы миоцитов без вмешательства фибробластов и интерстициальных матрицы; 4) оценка функциональных последствий от фармакологической или генетической манипуляции в кульКлеточные монослои тывается может быть эффективно достигнуты. Таким образом, HL-1 клетки стали широко использоваться сотовой моделью для изучения различных аспектов миоцитов физиологии, а также стимуляции, вызванной аномальные электрические деятельности. 13-16 Тем не менее, специальная обработка и уход, необходимые для культуры здорового монослоя клеток, которые реагируют на внешние электрическое стимуляции для изучения оптических отображение. Кроме того, двойной флуоресцентный процедура окрашивания красителем может легко повредить целостность культивируемых сливающихся монослоев клеток. Таким образом, выполняя V м / CA двухканальный оптический отображение в культуре HL-1 монослоя была большой проблемой.
Цель этого метода состоит в том, чтобы обеспечить основные этапы для успешного выполнения двухканальный оптический отображение в культуре HL-1 монослоя. Здесь мы в подробностях на оптимизированного протокола для подготовки HL-1 монослой клеток, в двухканальном оптического картирования культурно монослоя клеток и обработки картографических данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описывает основные аспекты оптического картирования культурно HL-1 предсердий миоцитов монослоя окрашенных кальция и напряжения чувствительных флуоресцентных красителей. Она включает в себя культивирование оптимальный HL-1 монослой клеток, настройку отображения оборудова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Клейкомб для обеспечения HL-1 клетки и подробный протокол на техническое обслуживание. Мы также хотели бы поблагодарить г-жу Елену Каррильо и доктора Сета Робия за помощь в создании клеток кино и Мистер Пит Карон за помощь за некоторые аксессуары для нашей двухканальной оптической системы отображения.
Эта работа была поддержана американской ассоциации сердца (10GRNT3770030 и 12GRNT12050478 к XA), Национальные институты здоровья (HL113640 для XA), и Университета Лойолы фонда исследований в области развития (в Ха).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
