Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Optische mapping heeft bewezen een waardevolle techniek cardiale elektrische activiteit te detecteren op zowel intacte ex vivo hart en in gekweekte myocyten monolagen zijn. HL-1-cellen zijn op grote schaal gebruikt als een 2-dimensionale cellulaire model voor het bestuderen van verschillende aspecten van cardiale fysiologie. Echter, is het een grote uitdaging om optisch kaart calcium (Ca) transiënten en actiepotentialen tegelijkertijd uit hetzelfde gezichtsveld in een beschaafde HL-1 atriale celmonolaag. Dit is omdat speciale behandeling en zorg nodig gezonde cellen die elektrisch kunnen worden vastgelegd en optisch gekoppeld bereiden. Daarom hebben wij een optimale werking protocol voor dual channel optische mapping ontwikkeld. In dit manuscript, hebben we in detail beschreven hoe de dual channel optische mapping experiment uit te voeren. Dit protocol is een nuttig instrument om het begrip van de actiepotentiaal vermeerdering en Ca kinetiek in aritmie ontwikkeling te vergroten.
Introduction
Een uniek calcium (Ca) en spanning (V m) dual channel optische mapping techniek 1-5 is in opkomst als een efficiënt instrument om tegelijkertijd op te nemen V m en Ca-signalen in zowel intacte hart en gekweekte celmonolagen. Deze techniek maakt het mogelijk om krachtige informatie over de relatie tussen calcium transiënten en actiepotentialen beter inzicht in de onderliggende elektrofysiologische mechanismen van cardiale aritmieën verkrijgen.
Gekweekte cel monolagen heeft bewezen een geschikte cellulaire model cardiale elektrofysiologie en het onderliggende mechanisme van aritmieën bestuderen. 4,6-8 HL-1-cellen zijn een goed gekarakteriseerde atriale myocyt cultuur lijn. HL-1 cellen houden ook een unieke, gedifferentieerde genotype en fenotype dat morfologische, elektrofysiologische en farmacologische karakteristieken van volwassen atriale myocytes omvat. Deze cellen brengen cardiale genen en eiwitten, waaronder important cardiale ionenkanalen (bijvoorbeeld L- en T-type calciumkanalen) 9 en volwassen isovormen van sarcomeer contractiele eiwitten normaal bij volwassen atriale myocyten zoals anderen en we hebben eerder gemeld. 13/10 Bovendien kan HL-1 cellen gekweekt om een 2-dimensionaal (2-D) myocyt monolaag vormen. Aldus, de voordelen van gekweekte HL-1 monolagen omvatten: 1) relatief goedkoper en gemakkelijker om myocyten cultuur lijn dan isoleren en kweken van primaire neonatale myocyten handhaven; 2) een confluente monolaag van cellen vermindert de structurele complexiteit als gevolg van de 3-D structuur van het hart; 3) een cel monolaag kan de interferentie van interstitiële fibrose die optreedt in het intacte hart elimineren. Dit kan worden gebruikt om specifieke elektrofysiologische functies van een groep myocyten ontleden zonder tussenkomst van fibroblasten en interstitiële matrix; 4) de beoordeling van de functionele gevolgen van farmacologische of genetische manipulatie in culreerde celmonolagen effectief worden bereikt. Daarom hebben HL-1 cellen een veelgebruikt cellulair model voor de studie diverse aspecten van myocyten fysiologie evenals stimulatie geïnduceerde abnormale elektrische activiteiten. 13-16 echter speciale behandeling en zorg nodig cultuur gezonde cel monolagen die reageren op externe elektrische pacing voor optische mapping studies. Bovendien kunnen duale fluorescente kleurstof kleuring procedure gemakkelijk de integriteit van gekweekte confluente celmonolagen beschadigen. Zo, het uitvoeren van V m / CA dual channel optische mapping in gekweekte HL-1 monolagen is een grote uitdaging.
Het doel van deze methode is om de sleutel te stappen bieden voor het succesvol uitvoeren van dual channel optische mapping in gekweekte HL-1 monolagen. Hier hebben we uitgebreide informatie verstrekt over een geoptimaliseerd protocol voor HL-1 celmonolaag voorbereiding, dual channel optische kaart brengen van een gekweekte cel monolaag, en in kaart brengen dataverwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de belangrijkste aspecten van de optische kaart brengen in een beschaafde HL-1 atriale myocyt monolaag gekleurd met calcium en spanning gevoelige fluorescerende kleurstoffen. Het omvat het kweken van een optimale HL-1 celmonolaag, setup van het in kaart brengen van apparatuur, in kaart brengen van een beschaafde monolaag, en data-analyse.
Om gekweekte cellen succesvol kaart, de sleutel is om een gelijkmatig verdeelde monolaag bereiden. Wanneer zaaien de cellen op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dr. Claycomb bedanken voor het verstrekken van de HL-1 cellen en gedetailleerde onderhoud protocol. We willen ook graag mevrouw Elena Carrillo en Dr Seth Robia bedanken voor hun hulp bij het genereren van de cel film en Mr. Pete Caron voor zijn hulp bij het maken van een aantal accessoires voor onze dual channel optische mapping systeem.
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 aan XA), National Institutes of Health (HL113640 aan XA), en Loyola University Research Development Fund (XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
