Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجهد والكالسيوم مزدوجة القناة البصرية رسم خرائط مثقف HL-1 الرجفان العضلية واحد رقائق

Published: March 23, 2015 doi: 10.3791/52542
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Bioengineering, Clemson University
* These authors contributed equally

Abstract

وقد ثبت رسم الخرائط الضوئية لتكون تقنية قيمة للكشف عن النشاط الكهربائي في القلب على حد سواء سليمة خارج الحي قلوب والطبقات الوحيدة العضلية مثقف. وقد استخدمت على نطاق واسع خلايا HL-1 كنموذج الخلوي 2-الأبعاد لدراسة الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء القلب. ومع ذلك، فقد كان تحديا كبيرا لخريطة بصريا الكالسيوم (الكالسيوم) العابرين وإمكانات العمل في وقت واحد من نفس مجال الرؤية في تربيتها HL-1 خلية الأذيني أحادي الطبقة. هذا هو لأنه مطلوب معالجة خاصة والرعاية لإعداد الخلايا السليمة التي يمكن أن يتم القبض كهربائيا وتعيين بصريا. لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول العمل الأمثل لالمزدوج رسم الخرائط البصرية القناة. في هذه المخطوطة، التي وصفناها بالتفصيل كيفية تنفيذ القناة التجربة رسم الخرائط الضوئية المزدوجة. هذا البروتوكول هو أداة مفيدة لتعزيز مفهوم العمل نشر المحتملين وحركية الكالسيوم في التنمية عدم انتظام ضربات القلب.

Introduction

والكالسيوم فريد (كاليفورنيا) والجهد (V م) المزدوج رسم الخرائط الضوئية قنوات تقنية 1-5 يبرز بوصفه أداة فعالة لتسجيل وقت واحد V م والكالسيوم إشارات في كل من قلوب سليمة والطبقات الوحيدة الخلية مثقف. هذا الأسلوب يجعل من الممكن الحصول على معلومات قوية بشأن العلاقة بين العابرين الكالسيوم وإمكانات العمل لفهم أفضل للآليات الكهربية الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب.

وقد أثبتت الطبقات الوحيدة خلايا مستنبتة لتكون نموذجا الخلوي المفيد دراسة الكهربية القلب وآلية الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب. 4،6-8 HL-1 الخلايا العضلية هي الأذيني خط ثقافة تتميز بشكل جيد. خلايا HL-1 أيضا الحفاظ على النمط الجيني متباينة بشكل فريد والنمط الظاهري الذي يتضمن المورفولوجي، الكهربية، والخصائص الدوائية من myocytes الأذيني الكبار. هذه الخلايا تعبر عن الجينات والبروتينات القلب، بما في ذلك importaالإقليم الشمالي القنوات الأيونية القلب (أي L- وقنوات الكالسيوم T-نوع) 9 و الإسوية ناضجة من البروتينات مقلص الساركومير توجد عادة في myocytes الأذيني الكبار مثل الآخرين ولقد ذكرت سابقا. 10-13 وبالإضافة إلى ذلك، يمكن HL-1 خلايا يكون مثقف لتشكيل 2-الأبعاد (2-D) العضلية أحادي الطبقة. وهكذا، فإن مزايا استخدام مثقف الطبقات الوحيدة HL-1 ما يلي: 1) أقل نسبيا من حيث التكلفة وأسهل للحفاظ على خط الثقافة العضلية من عزل وزراعة myocytes حديثي الولادة الأولية؛ 2) أحادي الطبقة متموجة من الخلايا يقلل من التعقيدات الهيكلية التي تنجم عن هيكل 3-D من القلب؛ 3) يمكن أحادي الطبقة خلية القضاء على التدخل من التليف الخلالي الذي يحدث في قلب سليمة. وهذا يمكن أن تستخدم لتشريح وظائف الكهربية محددة من مجموعة من myocytes دون تدخل من الخلايا الليفية ومصفوفة الخلالي. 4) تقييم عواقب وظيفية من التلاعب الدوائي أو الوراثي في ​​طريق مسدودالطبقات الوحيدة الخلية بناءه من جديد يمكن أن يتحقق على نحو فعال. لذلك، أصبحت HL-1 خلايا نموذجا الخلوية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء العضلية وكذلك الأنشطة الكهربائية غير الطبيعية الناجمة عن سرعة. 13-16 ومع ذلك، لا بد من معالجة خاصة ورعاية للثقافة الطبقات الوحيدة الخلية الصحيحة التي تستجيب للخارجية سرعة الكهربائية للدراسات رسم الخرائط البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، قد المزدوج الفلورسنت الإجراء صبغ تلطيخ تلف بسهولة على سلامة مثقف الطبقات الوحيدة الخلية متموجة. وهكذا، فقد كان أداء V م / CA قناة مزدوجة رسم الخرائط البصرية في تربيتها HL-1 الطبقات الوحيدة تحديا كبيرا.

والهدف من هذه الطريقة هو توفير الخطوات الرئيسية لأداء بنجاح المزدوج رسم الخرائط الضوئية القنوات في تربيتها HL-1 الطبقات الوحيدة. نحن هنا قدمت تفاصيل واسعة على بروتوكول الأمثل لإعداد أحادي الطبقة HL-1 خلية، المزدوج رسم الخرائط البصرية قناة أحادي الطبقة خلايا مستنبتة، ومعالجة البيانات ورسم الخرائط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحل

  1. بافراز (NP) حل
    1. حل 40 ملغ من NP إلى 25 مل من 30 ملي حمض الاسكوربيك (0.1475 جم حمض الاسكوربيك في 25 مل من الملة النقى-Q (MQ) المياه. تجنب التعرض للضوء المباشر خلال هذا المستحضر حل لبافراز (NP) هو خفيف حساسة.
    2. تصفية الحل NP مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. قسامة الحل في 1 مل microtubes العقيمة وتخزينها في -20 ° C. مرة واحدة المجمدة، NP غير مستقر لمدة شهر.
  2. تستكمل غسل والنهائي Claycomb وسائل الإعلام
    1. تبدأ مع 43.5 مل من Claycomb المتوسطة وتكملة مع 5 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5 مل من البنسلين / الستربتومايسين، و 0.5 مل من NP و 1: 100 المخفف L-الجلوتامين لجعل 50 مل من النهائي تستكمل المتوسطة Claycomb. تجنب التعرض للضوء المباشر خلال هذا المستحضر حل لClaycomb المتوسطة خفيف الحساس.
    2. إعداد المتوسطة غسل Claycomb باستخدام نفس الوصفة كما سوبplemented Claycomb المتوسطة باستثناء إضافة 5٪ FBS وتغفل NP-L والمكونات الجلوتامين.
      ملاحظة: تستكمل وسائل الاعلام النهائي وغسل Claycomb جيدة لمدة أسبوعين عند تخزينها في 4 درجات مئوية دون التعرض للضوء المباشر.
  3. فول الصويا التربسين حل المثبطة
    1. حل 25 ملغ من مثبط التربسين فول الصويا إلى 100 مل من خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(PBS).
    2. تصفية الحل باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
      ملاحظة: الحل تعقيمها مستقر لمدة شهر واحد عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. الجيلاتين / [فيبرونكتين حل طلاء صحن
    1. حل 0.1 غرام من الجيلاتين إلى 500 مل من الماء MQ لجعل 0.02٪ الجيلاتين.
    2. الأوتوكلاف، ثم تمييع 1 مل من فبرونيكتين إلى 199 مل من 0.02٪ الجيلاتين وتخلط بلطف.
    3. قسامة 6 مل من محلول الجيلاتين في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 ° C.
  5. محلول الملح هانكس "
    1. باستخدام ضجةلوحة، وإذابة الأملاح التالية في MQ المياه (مليمول / لتر)، كلوريد الصوديوم (136.9)، بوكل (5.366)، KH 2 PO 4 (0.4409)، ناه 2 PO 4 (0.4000)، MgSO 4 (0.8142)، D-GLC (5.051)، NaHCO 3 (4.162)، HEPES (5.042)، CaCl 2 (1.261).
  6. الكالسيوم صبغة حساسة (Rhod2) حل
    1. تمييع 1 ملغ من مسحوق جاف Rhod2 في 400 ميكرولتر من 20٪ Pluronic F-127 في DMSO لجعل Rhod2 صبغ حل الأسهم وتخزينها في -20 ° C.
    2. تمييع هذا الحل الأسهم 1: 1،000 بمحلول الملح هانكس "لجعل الحل النهائي العمل قبل بدء التجربة.
  7. الجهد صبغة حساسة (Rh237) حل
    1. تمييع 5 ملغ من Rh237 مع 2 مل من DMSO لجعل حل الأسهم وتخزينها في -20 ° C. تمييع الحل الأسهم 1: 1،000 بمحلول الملح هانكس "لجعل الحل النهائي العمل قبل بدء التجربة.

& #160؛ تستند 1-4 الحلول على Claycomb HL-1 بروتوكول زراعة الخلايا مع تعديل طفيف: ملاحظة.

2. الركض والتثقيف HL-1 الرجفان Myocytes على coverslips

ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا HL-1 من الدكتور Claycomb (جامعة ولاية لويزيانا).

  1. تنمو HL-1 الخلايا في قوارير T25 وتغذية مع 5 مل من استكمال Claycomb متوسطة يوميا. مرور الخلايا في T25 قارورة كل خمسة أيام وفقا لClaycomb HL-1 بروتوكول زراعة الخلايا (موضح أدناه) 10.
  2. coverslips جولة مكان (20 مم) في لوحات ثقافة 12-جيدا 24 ساعة قبل الخلايا في قارورة T25 هي متكدسة بالكامل وجاهزة للpassaged، ومن ثم تغطية لل coverslips مع الجيلاتين / فبرونيكتين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي، نضح وتجاهل الجيلاتين / فبرونيكتين من لوحات ثقافة واستبدالها مع 1.5 مل من استكمال المتوسطة النهائي Claycomb في كل بئر.
  4. تقسيم الخلايا من الثقافيه T25البريد قارورة بعد الوصول إلى نقطة التقاء كامل في اليوم 5. نضح في والمتوسطة من القارورة T25 التي تحتوي على ثقافة متكدسة وشطف ثقافة لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني في 37 ° C.
  5. نضح PBS وإضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية قبل pipetting التربسين / EDTA على الجزء السفلي من القارورة T25 لتجنب الاتصال المباشر مع الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  6. إزالة التربسين / EDTA بواسطة الطموح وإضافة 1.3 مل من التربسين / EDTA آخر في T25 القارورة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. فحص تحت المجهر وإذا لا تزال تعلق الخلايا إلى قارورة، انقر لطرد بالكامل الخلايا المتبقية.
  7. إضافة 1.3 مل من فول الصويا مثبط التربسين إلى الخلايا والخلايا نقل من القارورة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. شطف قارورة فارغة مع 5 مل من غسل Claycomb المتوسطة. إضافة إلى شطف الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
  8. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف وبلطف إعادة تعليق بيليه الخليةفي 6 مل من استكمال المتوسطة النهائي Claycomb.
  9. البذور كل بئر من لوحة 12-جيدا مع 0.5 مل من تعليق خلية من الركض الخلية. تغذية الخلايا مع الطازجة تستكمل المتوسطة النهائي Claycomb يوميا.
    ملاحظة: تراقب عن كثب نمو الخلايا، عادة الطبقات الوحيدة الخلية تصل إلى وضع متموجة في يوم 4 وتبقى أنشطة عفوية مرئية. ثم، فإن أحادي الطبقة المثقفة تكون جاهزة لرسم الخرائط البصرية في يوم 4-5.

3. الكالسيوم التحميل والجهد الأصباغ الحساسة للخلايا

  1. للدراسات رسم الخرائط البصرية، وإزالة بلطف ساترة من 12 جيدا لوحة زراعة الخلايا وشطف مع الحل الملح هانكس ".
  2. وصمة عار الخلايا مع الكالسيوم صبغة حساسة Rhod2، واحتضان أحادي الطبقة خلية في ساترة مع 3 مل من الأكسجين (محتدما مع 5٪ CO 2/95٪ O 2 الغاز) Rhod2 الحل تعمل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة .
  3. وصمة عار على الخلايا مع صبغة حساسة V مRh237، تزج Rhod2 تحميل أحادي الطبقة الخلية إلى 3 مل من الأكسجين Rh237 الحل تعمل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة أخرى.

رسم الخرائط 4. مزدوجة القناة البصرية

  1. وضع أحادي الطبقة خلية، وهو الملون مزدوجة مع V م والأصباغ الكالسيوم، في غرفة التداول على مجهر مضان مقلوب. استخدام نظام تداول ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الغرفة خلية في 35 ± 1 ° C. السيطرة بعناية على درجة حرارة سائل الإرواء عن طريق ضبط سرعة تدفق من خلال تعميم الغرفة لتجنب الانحدار أكثر من 0.3 درجة مئوية في جميع أنحاء الغرفة.
    1. قبل تسجيل إشارات الكالسيوم V م /، وغسل أحادي الطبقة الخلية مع حل هانكس العذبة لحوالي 5 دقائق لإزالة الصبغة المتبقية من الخطوات تلطيخ السابقة.
  2. وتيرة الطبقات الوحيدة الخلية الصحيحة باستخدام القطب ثنائي القطب تتألف من ماصة زجاجية مملوءة هانكس "محلول الملح والفضهإيه سلك ملفوف حول الطرف ماصة كما سبق وصفه 12،17.
  3. وتيرة الطبقات الوحيدة الخلية الصحيحة في طول دورة 200-500 ميللي ثانية والنبض عرض 2 ميللي ثانية، وتتوقع عتبة سرعة في حوالي 1 بالسيارات.
    ملاحظة: للحصول على كل دفعة من الطبقات الوحيدة مثقف، وينبغي أن تستخدم اثنين على الأقل من الطبقات الوحيدة غير المعالجة إلى اختبار حالة من الدفعة الخلية. وينبغي أن تكون قادرة على أن تكون استولت عليها سرعة الكهربائية في أطوال دورة 200-500 ميللي ثانية الطبقات الوحيدة السيطرة صحية. إذا فشلت الطبقات الوحيدة التحكم ليتم الخطى كهربائيا، وهذا يشير إلى أن الدفعة الخلية بأكملها قد لا تكون مناسبة لإجراء التجارب رسم الخرائط البصرية.
  4. لتثير كل من V م والأصباغ الحساسة الكالسيوم، استخدام مصدر ضوء LED (520 نانومتر الطول الموجي) إلى جانب عامل تصفية الإثارة (510 نانومتر / 40) ومرآة مزدوج اللون (561 نانومتر).
    1. جمع إشارات الفلورية المنبعثة من الخلايا عن طريق هدف 40X والانقسام مع مرآة مزدوج اللون (594 نانومتر) إلى عنصر V م ومكون الكالسيوم.تصفية الضوء المنبعث في م قناة V مع فلتر طويل تمرير (700 نانومتر) والضوء المنبعث في قناة الكالسيوم مع مرشح تمرير الفرقة (585/40 نانومتر).
    2. جمع ضوء الفلورسنت تصفيتها باستخدام اثنين من كاميرات CCD (80 × 80 بكسل، 1،000 إطارا في الثانية، القميص الأحمر التصوير).
    3. لتجنب صبغ photobleaching من، وجعل التسجيلات لمدة أقل من 2 ثانية على كل مجال الرؤية للحد من وقت التعرض للضوء. هنا، وعادة صورة أربعة مجالات مختلفة لكل أحادي الطبقة.

5. معالجة البيانات من V م أو الكالسيوم تسجيلات

  1. لكل من V م وإشارات الكالسيوم (80 × 80 بكسل)، ومتوسط ​​قيم الكثافة من خمسة وعشرين (5 × 5) بكسل المجاورة إلى قيمة كثافة واحد على مختلف النقاط وتسجيل الوقت للحد من الضوضاء الخلفية.
    ملاحظة: بعد المتوسط ​​البيانات، كل نقطة زمنية تسجيل من إمكانات العمل الفردية أو الكالسيوم عابرة ينتج مصفوفة البيانات التي تحتوي على 16 × 16 وبلغ متوسط ​​قيم الكثافة (المتوسطقنوات البيانات) مع القرار المكانية من 50 ميكرون.
  2. تحديد الوقت تفعيل (AT) المسجلة V م أو إشارات الكالسيوم.
    1. لتحديد وقت تفعيل (AT) من إمكانات العمل الفردية أو الكالسيوم عابرة، تحديد الوقت من 50٪ من السعة القصوى للم V أو إشارات الكالسيوم باستخدام خوارزمية مقرها MATLAB-حسب الطلب كما هو موضح سابقا. 12
    2. تدقيق يدويا المنشطات تحليلها للقضاء على أية أخطاء قد تحدث أثناء تحليل البرنامج.
    3. تخزين محددة AT مصفوفة (16 × 16 متوسط ​​قنوات البيانات) من إمكانات العمل المسجلة وعابرة الكالسيوم، على التوالي، في البرمجيات المستخدمة.
  3. حساب إمكانات العمل أو الكالسيوم عابرة سرعة التوصيل (CV) ناقلات على مصفوفة AT باستخدام طريقة التحليل الميداني الموجه كما هو موضح سابقا مع تعديلات طفيفة 12،18.
    1. حساب ناقلات CV قناة البيانات المتعلقة محيطها AT نقاط البيانات (5 ×. وبلغ متوسط ​​5 المجاورة قنوات البيانات) لمحاكاة سطح أملس متعدد الحدود المرات تفعيل (AT السطح) باستخدام خوارزمية الأقل مربع ضمن برنامج MATLAB 12،18.
    2. حساب ناقلات التوصيل باستخدام الصيغ أدناه
      الفورمولا 1:
      المعادلة 1
      الفورمولا 2:
      θ = ظل الزاوية القوسي [(دى / DT) / (DX / DT)]
      ملاحظة: هاء هي ناقلات CV المتوقعة في X- و y محاور؛ DX / دينارا هو الإسقاط من متجه CV في محور س. دى / دينارا هو الإسقاط من متجه CV في المحور ص. T هو سطح AT. س، ص الرجوع إلى 2-D ينسق. T س = ∂T / ∂x هو مشتق جزئية من T فيما يتعلق س؛ T ذ = ∂T / ∂y هو مشتق جزئية من T فيما يتعلق ذ. θ هو الاتجاه النهائي للناقل CV.
    3. المجموعة جميع ناقلات مصفوفة AT إلى 36 مسارات، كل منها يغطي قطاع عشرة درجة على البوصلة. </ لى>
    4. حدد المسار الذي يحتوي على أكبر عدد من ناقلات CV بين مسارات التوصيل 36. حساب متوسط ​​السيرة الذاتية لهذا المسار لتمثيل السيرة الذاتية للأحادي الطبقة.

6. التصور للنشر جبهة الموجة

  1. تطبيع كثافة إشارة من إمكانات العمل الفردية أو الكالسيوم عابرة في مختلف نقاط وقت التسجيل النسبية لقيمة ذروته باستخدام برنامج MATLAB.
  2. مؤقتا تخزين البيانات كثافة تطبيع كل نقطة زمنية المسجلة في كثافة مصفوفة 16 × 16 في برنامج MATLAB المستخدمة.
  3. بناء خريطة مرمزة كثافة من مصفوفة كثافة المخزنة من كل نقطة زمنية تسجيل باستخدام وظيفة surf.m.
    ملاحظة: في خريطة كثافة والأحمر يمثل كثافة عالية من م V أو إشارات الكالسيوم، ويعكس اللون الأزرق كثافة منخفضة من إشارات مضان.
  4. إنشاء ملف افي باستخدام وظيفة avifile.m.
  5. حفظ جميع طخرائط ntensity في مختلف نقاط وقت التسجيل من إمكانات العمل أو الكالسيوم عابرة باستخدام وظيفة addframe.m.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، سيتم إنشاء ملفين افي منفصلة من V م ونشر الكالسيوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ومتموجة أحادي الطبقة المثقفة المعارض إيقاع جوهري منتظم كما هو موضح في الفيلم 1. نحن ثم يقوم V م / كا المزدوج رسم الخرائط البصرية القناة في متموجة بشكل كامل HL-1 أحادي الطبقة. الشكل 1A معارض سبيل المثال آثار V م وإشارات الكالسيوم من تسجيل واحدة فوز. وتظهر الخرائط متساوي الزمن التمثيلية للنشر موحد V م وإشارات الكالسيوم باستخدام نظام رسم الخرائط البصرية قناة مزدوجة في أرقام 1B و1C. تم الحصول على الصور الزمني تمثيلية من إمكانات العمل بشكل موحد ونشر العابرين الكالسيوم من نفس HL-1 ثقافة أحادي الطبقة. وأخيرا، أفلام 2 و 3 أمثلة للرسوم المتحركة من إمكانية نشر موحد العمل (فيلم 2) وعابرة الكالسيوم (فيلم 3) في متموجة أحادي الطبقة HL-1.

-page = "دائما"> الشكل (1)
الشكل (1): (A) آثار مثال V م (الأزرق) والكالسيوم (أحمر) من ضربات الخطى كهربائيا بطول دورة (CL) من 500 مللي ثانية. (ب) صورة من نظام رسم الخرائط البصرية لدينا لHL-1 الطبقات الوحيدة. (ج) خريطة متساوي الزمن للعمل نشر محتمل من نفس الخطى ضربات طوال مجال الرؤية كله. (D) إن خريطة متساوي الزمن من الكالسيوم نشر عابرة من نفس الخطى ضربات طوال مجال الرؤية. في كل الخرائط متساوي الزمن، ويمثل الفاصل الزمني مع الألوان، بدءا من الأزرق الداكن كما بدء والأحمر الداكن في 50 ميللي ثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
الشكل 2: (A) سلسلة من خرائط V توزيع م بسعر 60، 80، 140، و 200 ميللي ثانية بعد بدء التسجيل. (ب) خرائط توزيع الكالسيوم في 60، 80، 140، و 200 ميللي ثانية بعد بدء التسجيل.

فيلم 1: فيلم تمثيلي المسجلة من متكدسة HL-1 أحادي الطبقة في يوم الثقافة الخمس، تحت المجهر الخفيفة مع الهدف 40X.

فيلم 2 : فيلم تمثيلي من إمكانات العمل نشر من فوز الخطى في CL 500 ميللي ثانية.

فيلم 3 : فيلم تمثيلي من الكالسيوم عابرة نشر من باكفاز إد في CL 500 ميللي ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه المقالة الجوانب الرئيسية لرسم الخرائط البصرية في تربيتها HL-1 الأذيني العضلية أحادي الطبقة ملطخة الكالسيوم والجهد الأصباغ الفلورية الحساسة. يشمل ذلك زراعة والأمثل HL-1 أحادي الطبقة الخلية، والإعداد للمعدات رسم الخرائط، ورسم خرائط أحادي الطبقة المثقفة، وتحليل البيانات.

لرسم خريطة بنجاح الخلايا المستزرعة المفتاح، هو إعداد أحادي الطبقة خلية موزعة بشكل متجانس. عندما البذر الخلايا على للل coverslips، تأكد لتفريق بالتساوي الخلايا. خريطة دائما الطبقات الوحيدة الخلية نمت بشكل كامل ومتموجة تماما، حيث أن هذه سترد الأفضل لسرعة الكهربائية. ومن المهم أيضا للحفاظ على الخلايا بالأكسجين أثناء تحميل الأصباغ، ولكن ينبغي فقاعات الأكسجين لا تتلامس مباشرة مع الخلايا لأن هذا قد قتل أو طرد منهم من ساترة. خفض تركيز الصبغة والحد من شدة الضوء سيقلل حجم إشارة وتقليل إشارة إلى نسبة الضوضاء، مع زيادة concentrati صبغعلى تعزيز وشدة الضوء وزيادة حجم إشارة ولكن أيضا زيادة الضوضاء. لذلك، لا بد من تحديد التوازن الأمثل للتركيز صبغة الفلورسنت والإثارة قوة ضوء لتعزيز إشارة إلى نسبة الضوضاء من الإشارات التسجيل. وعلاوة على ذلك، أثناء تسجيل رسم الخرائط البصرية، تأكد من تجنب تعريض أحادي الطبقة الخلية إلى التعرض الطويل للضوء مركزة لأن هذا قد يسبب تلف الخلايا الضوئي داخل منطقة الضوء عرضة للخطر. وأخيرا، لا بد من وضع نظام رسم الخرائط البصرية التي توفر قرار الزمني والمكاني عال من إشارات تسجيل للحصول على بيانات عالية الجودة.

في حين المزدوج رسم الخرائط الضوئية القنوات في قلوب سليمة لديها امكانات كبيرة لدراسة الكهربية القلب نظرا لقدرتها على الجهد والكالسيوم إشارات جمع في وقت واحد، واحد الحد هو أن هذه التقنية بجمع المعلومات من سطح 3-D باعتباره 2-D خريطة الإسقاط. التي تم الحصول عليها 2-D البيانات من قلوب سليمة مع المعلومات تجاهلها من 3-D curvatلدى عودتهم من القلب يمكن أن يؤدي إلى أخطاء في تحليل البيانات، وخاصة في تحليل سرعة التوصيل. مع مزايا استخدام 2-D HL-1 نموذج الخلوي مثقف، ونحن قادرون على تصور الإيقاعات المنتظمة وغير المنتظمة، وتقييم الكالسيوم عابرة والعمل حركية المحتملة، وتحديد سرعة التوصيل وتوصيف الكالسيوم والعمل المحتملين أنماط الانتشار (الزي الرسمي أو غير نشر موحد) دون التدخل من هيكل 3-D من قلب سليمة. لذلك، ورسم خرائط بنجاح على حد سواء العابرين الكالسيوم وإمكانات العمل في تربيتها HL-1 الأذيني العضلية أحادي الطبقة كنهج مجاني يمكن أن يعزز إلى حد كبير فهم الخصائص الكهربية من myocytes الأذيني والآليات الكامنة وراء arrhythmogenesis الأذيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونود أن نشكر الدكتور Claycomb لتوفير خلايا HL-1 و بروتوكول مفصل صيانة. كما نود أن نشكر السيدة ايلينا كاريو والدكتور سيث Robia على المساعدة التي قدموها مع توليد الفيلم الخلية والسيد بيت كارون لمساعدته مع جعل بعض الملحقات لدينا مزدوج نظام رسم الخرائط البصرية القناة.

وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (10GRNT3770030 و12GRNT12050478 إلى XA)، المعاهد الوطنية للصحة (HL113640 إلى XA)، وصندوق لويولا جامعة بحوث التنمية (لXA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
  3. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  4. Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
  5. Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
  6. Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
  7. Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
  8. Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
  9. Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
  10. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  11. Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
  12. Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
  13. White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
  14. Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
  15. Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
  16. Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
  17. Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
  18. Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 97، ورسم الخرائط البصرية الخلوي، أحادي الطبقة الأذيني مثقف، إمكانات العمل، عابرة الكالسيوم، حساسة الجهد صبغ، صبغ الكالسيوم
الجهد والكالسيوم مزدوجة القناة البصرية رسم خرائط مثقف HL-1 الرجفان العضلية واحد رقائق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W.,… More

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter