培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Abstract

光学的マッピングは、心臓をエクスビボ無傷で培養筋細胞単層の心臓の電気的活動を検出するための有益な手法であることが証明された。 HL-1細胞は、広く、心臓生理機能の多様な側面を研究するための2次元細胞モデルとして使用されてきた。しかし、それは培養されたHL-1心房細胞単層において同じ視野から同時に光学的にマップカルシウム（Ca）過渡と活動電位に大きな課題となっている。特別な取り扱いや注意が電気的捕獲および光学マッピングすることができる健康な細胞を調製するために必要とされるためである。したがって、我々は、デュアルチャネル光学マッピングのための最適な作業プロトコルを開発した。この原稿では、デュアルチャネル光学マッピング実験を実行する方法を詳細に説明してきた。このプロトコルは、不整脈の開発における活動電位の伝播およびCa動態の理解を高めるための便利なツールです。

Introduction

ユニークなカルシウム（Ca）と電圧（V _m）のデュアルチャネル光マッピング技術^1-5は、同時に完全な心と、培養細胞単層の両方でV _mとCaの信号を記録するための効率的なツールとして浮上している。この技術は、より良好な心不整脈の基礎となる電気生理学的メカニズムを理解するために、カルシウムトランジェントと活動電位との間の関係についての強力な情報を得ることができる。

培養された細胞単層は、心臓電気生理学および不整脈の基礎となるメカニズムを研究するための有用な細胞モデルであることが判明している^。4,6-8 HL-1細胞を、十分に特徴付けられた心房筋細胞培養株である。 HL-1細胞は、成人の心房筋細胞の形態学、電気生理学的、および薬理学的特性を備えて独自に差別化遺伝子型と表現型を維持する。これらの細胞は、importa含む心臓遺伝子やタンパク質を発現心臓のイオンチャネル（ すなわち 、L-およびT型カルシウムチャネル^）9と、通常、他の成人心房筋細胞に見出され、我々が以前に報告したサルコメアの収縮タンパク質の成熟アイソフォームのnt ^10〜13に加えて、HL-1細胞とすることができる2次元（2-D）筋細胞の単層を形成するために培養。従って、培養されたHL-1を使用することの利点は、単分子層は、1）比較的低いコストと一次新生筋細胞を単離し、培養するよりも、筋細胞培養株を維持しやすくする。 2）細胞のコンフルエントな単層は、心臓の3次元構造に起因する構造の複雑さを低減する。 3）細胞単層は、無傷の中心部に発生した間質性線維症の干渉を排除することができます。これは、線維芽細胞および間質マトリックスの干渉を受けることなく筋のグループの特定の電気生理学的機能を分析するために使用することができる。 CULにおける薬理学的または遺伝子操作から機能的な結果の4）評価tured細胞単層を効果的に達成することができる。したがって、HL-1細胞は筋細胞生理学の多様な側面だけでなく、ペーシング誘発性の異常な電気的活動を研究するために広く使用されている細胞モデルとなっている。外部に反応する^13〜16ただし、特別な取り扱いやケアは文化に必要とされる健康的な細胞単層光学マッピング研究のための電気的ペーシング。また、二重の蛍光色素染色手順は、簡単に培養されたコンフルエント細胞単層の完全性を破損する恐れがあります。このように、培養されたHL-1単層で行うのV _M / CAデュアルチャネル光学マッピングは、大きな課題となっている。

この方法の目的は、成功して培養されたHL-1単層においてデュアルチャネル光学マッピングを実行するための重要なステップを提供することです。ここでは、HL-1細胞単層の調製、培養細胞単層のデュアルチャネル光学マッピング、マッピングデータ処理のために最適化されたプロトコルに広範囲の詳細を提供している。

Protocol

1.溶液の調製

1. ノルエピネフリン（NP）溶液
   1. 精製されたミリQ（MQ）の水25ミリリットルで30 mMのアスコルビン酸（0.1475グラムのアスコルビン酸の25ミリリットルにNPの40 mgの溶かす。ノルエピネフリン（NP）は、光に敏感であるため、この解決策の準備中に直接光暴露を避ける。
   2. 0.22μmのシリンジフィルターとNPソリューションをフィルタリングします。 -20℃で1ミリリットルの滅菌マイクロチューブやストアにソリューションをアリコート。凍結したら、NPは1ヶ月安定である。
2. 増補ウォッシュと決勝Claycombメディア
   1. 最終補充しClaycomb培地50mlを作るために100希釈L-グルタミン：ウシ胎児血清（FBS）を5 mlのClaycomb培地および補充43.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、0.5 mlのNP 1を0.5mlを開始する。 Claycomb媒体は光に敏感であるため、この解決策の準備中に直接光暴露を避ける。
   2. SUPと同じレシピを使用しウォッシュClaycomb媒体を準備除くplemented Claycomb培地は、5％FBSを追加し、NPおよびL-グルタミンのコンポーネントを省略します。
      注：直接光露出せずに4℃で保存した場合補足決勝とウォッシュClaycombメディアは二週間のために良いです。
3. 大豆トリプシン抑制性ソリューション
   1. カルシウムフリー及びMgフリーのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100ml中の大豆トリプシン阻害剤25mgを溶解する。
   2. 0.22μmのシリンジフィルターを用いて溶液を濾過する。
      注：4℃で保存したときに滅菌溶液1ヶ月間安定である。
4. ゼラチン/フィブロネクチンディッシュコーティング溶液
   1. 0.02％ゼラチンを作るためにMQ水500ml中にゼラチンを0.1g溶解する。
   2. オートクレーブを、その後0.02％ゼラチン199ミリリットルにフィブロネクチンの1ミリリットルを希釈し、穏やかに混合する。
   3. アリコートを-20℃でゼラチン別々のチューブへの溶液と店の6ミリリットル。
5. ハンクス塩溶液
   1. 波紋を使用してプレート、MQ水（ミリモル/ L）で、次の塩を溶解、塩化ナトリウム（136.9）、塩化カリウム（5.366）、KH ₂ PO _{4（0.4409）、}のNaH ₂ PO _{4（0.4000）}し、MgSO _{4（0.8142）、D-Glc}を（5.051）、 _炭酸水素ナトリウム（4.162）、HEPES（5.042）、 _塩化カルシウム（1.261）。
6. カルシウム感受性色素（Rhod2）ソリューション
   1. -20℃でRhod2色素ストック溶液およびストアを作るために、DMSO中の20％プルロニックF-127400μlのRhod2乾燥粉末1mgを希釈する。
   2. 実験を開始する前に、最後の作業溶液を作るためにハンクス塩溶液で千：この原液1を希釈する。
7. 電位感受性色素（Rh237）ソリューション
   1. -20℃のストック溶液およびストアを作成するDMSO 2mlのRh237 5mgを希釈する。実験を開始する前に、最後の作業溶液を作るために千ハンクス塩溶液：原液1を希釈する。

＆＃160。 NOTE：1-4溶液はわずかな変更とClaycomb HL-1細胞培養プロトコルに基づいている。

2.継代培養HL-1心房筋細胞カバースリップ上に

注：HL-1細胞は、Dr Claycomb（ルイジアナ州立大学）から入手することができます。

1. T25フラスコ中のHL-1細胞を増殖し、毎日補充しClaycomb培地5mlを養う。継代T25中の細胞（後述）Claycomb HL-1細胞培養プロトコール¹⁰に従って5日毎フラスコ。
2. T25フラスコ中の細胞を前に12ウェル培養プレートに置き、ラウンドカバースリップ（直径20mm）の24時間は完全にコンフルエントで継代される準備ができて、その後37℃で一晩、ゼラチン/フィブロネクチンでカバースリップをカバーする。
3. 翌日、吸引と培養プレートからゼラチン/フィブロネクチンを破棄して、各ウェルの補足最終Claycomb培地の1.5ミリリットルと交換してください。
4. T25のculturからセルの分割コンフルエント文化を含むT25フラスコから5日目を吸引除去で培地を完全合流に達した後、37℃でPBSで簡単に文化をすすぎ、電子フラスコ。
5. PBSを吸引除去し、細胞との直接接触を避けるために、T25フラスコの底部に、トリプシン/ EDTAをピペッティングすることにより、37℃で、0.05％トリプシン/ EDTAを3mlを加える。 1分間37℃でインキュベートする。
6. 吸引により、トリプシン/ EDTAを外し、T25フラスコあたりのトリプシン/ EDTAの別の1.3ミリリットルを追加。 1分間、室温でインキュベートする。顕微鏡下で調べ、細胞がまだフラスコに接続されている場合、完全に残っている細胞を取り除くために、タップします。
7. 15mlの遠心管にフラスコからの細胞を、転送細胞に大豆トリプシンインヒビター1.3 mlを加え。ウォッシュClaycomb培地5mlで空のフラスコをすすぐ。を15ml遠心管中の細胞にリンスを追加する。 5分間500×gで遠心分離する。
8. 遠心分離後、上清を静かに再懸濁細胞ペレットを吸引補充した最終Claycomb培地6mlの中。
9. 細胞継代からの細胞懸濁液0.5mlを12ウェルプレートの各ウェルに播種する。毎日新鮮な増補最終Claycomb培地で細胞を養う。
   注：密接細胞の成長を監視する、一般的に、細胞単層を、4日目にコンフルエント状態に達し、自発的な活動が表示されたまま。その後、培養された単分子層は、一日4-5に光学マッピングのための準備が整います。

細胞へ3.ローディングカルシウムと電位感受性色素

1. 光学的マッピング研究のために、穏やかに12ウェル細胞培養プレートからカバースリップを除去し、ハンクス塩溶液ですすぐ。
2. カルシウム感受性色素Rhod2で細胞を染色し、3mlのカバースリップ上の細胞単層をインキュベート酸素で30分間水浴中で37℃でRhod2ワーキング溶液（5％CO _{2/95％O 2}ガスでバブリング） 。
3. V _mの感受性色素で細胞を染色するために、Rh237は、さらに15分間、水浴中で37℃で酸素Rh237ワーキング溶液3mlにRhod2負荷細胞単層を浸す。

4.デュアルチャネル光マッピング

1. 倒立蛍光顕微鏡上で循環チャンバ内に、V _mおよびカルシウム色素を用いて二重染色で細胞単層を配置する。 35±1℃で細胞チャンバの温度を維持するために加熱された循環システムを使用する。注意深くチャンバーを横切って0.3°Cの勾配を避けるために、チャンバを通って循環流の速度を調整することにより、灌流液の温度を制御する。
   1. V _mは / Caの信号を記録する前に、前の染色工程から残存する色素を除去し、約5分間、新鮮なハンクス溶液で細胞単層を洗浄する。
2. ハンクス塩溶液とSILVを充填したガラスピペットで構成される双極電極を使用してペース健全な細胞単層以前に^12,17を説明したように、ピペットチップの周りにコイル状のERワイヤー。
3. 約1 Mvでペーシング閾値を期待して2ミリ秒の200〜500ミリ秒とパルス幅のサイクル長でのペース健全な細胞単層、。
   注：単層培養の各バッチについて、少なくとも2つの非処理単層細胞バッチの状態をテストするために使用されるべきである。健常対照単層は200〜500ミリ秒のサイクル長で電気的ペーシングによって捕獲することができるはずです。コントロール単層を電気的にペーシングすることができない場合、これは、セル全体のバッチは、光学マッピング実験には適していないことを示唆している。
4. V _m及びカルシウム感受性色素の両方を励起するため、励起フィルター（510ナノメートル/ 40）と、ダイクロイックミラー（561 nm）を用いて結合されたLED光源（波長520nm）を使用する。
   1. Vの_M成分とCa成分にダイクロイックミラー（594 nm）を持つ40Xの目的とスプリットを介して細胞によって放出される蛍光シグナルを収集します。バンドパスフィルタ（40分の585 nm）を用いてCaチャネルでロングパスフィルター（700 nm）で放出された光とV _{mのチャネル}で放射された光をフィルタリングする。
   2. 2台のCCDカメラ使用して濾過した蛍光光を集める（80×80ピクセル、千FPSを、留年選手イメージング）。
   3. 色素の光退色を避けるために、露光時間を制限するために各視野で2秒未満のための記録を行う。ここでは、典型的には、画像各単層のための4つの異なる領域。

5. V _mのデータ処理またはCaレコーディング

1. V _mとCaの信号（80×80ピクセル）の両方について25枚（5×5）の強度値は、バックグラウンドノイズを低減するために、異なる記録時点に一つの強度値に画素を隣接平均。
   NOTE：データ平均化した後、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの各記録時点が16×16を含むデータ行列は強度値を平均化し得（平均化50μmの空間分解能を持つデータ·チャネル）。
2. 記録されたV _mまたはCaの信号の活性化時間（AT）を定義する。
   1. 前述のように、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの起動時間（AT）を定義するために、V _mまたはカスタムメイドのMATLABベースのアルゴリズムを使用してCaの信号のピーク振幅の50％の時間を決定する^。12
   2. 手動でプログラム解析中に発生する可能性のあるエラーを排除するために分析のATを校正。
   3. マトリックスATに定義店は使用されるソフトウェアで、それぞれ記録活動電位およびカルシウムトランジェントの（16×16は、データチャネルの平均）。
3. 以前に軽微な変更^12,18で説明したようにベクトル場解析法を用いたAT行列に活動電位またはカルシウムトランジェント伝導速度（CV）のベクトルを計算する。
   1. そのデータポイントAT周囲のデータチャネルに対するCVベクトルを算出する（5×。 5隣接）は、MATLABプログラム^12,18内で、最小二乗アルゴリズムを使用して）表面AT（活性化時間の滑らかな多項式表面をシミュレートするために、データ·チャネルを平均した。
   2. 以下の式を使用して伝導ベクトルを計算する
      式1：
      
      式2：
      θ=逆正接[（dyは/ dTの）/（dxの/ dTの）]
      NOTE：Veのは、x軸とy軸に投影されたCVベクトルである。 dxは/ dTが、x軸におけるCVベクトルの投影である。 dyは/ dTがy軸におけるCVベクトルの投影である。 Tは、AT面である。 xは、yが2-D座標を指す。 T _X =∂T/∂Xxに関するTの部分的な誘導体である。 Tの_Y =∂T/∂Yはyに関するTの部分的な誘導体である。 θは、CVベクトルの最後の方向である。
   3. グループコンパス上の10度のセクターをカバーしてそれぞれが36の経路にAT行列のすべてのベクトル、。</ LI>
   4. 36伝導経路間のCVベクトルの最大の人口を含む経路を選択します。単分子層のCVを表すために、この経路の平均CVを計算します。

ウェーブフロント伝播の6.可視化

1. MATLABソフトウェアを使用して、そのピーク値に対して異なる記録の時点で、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの信号強度を正規化する。
2. 一時的に使用MATLABソフトウェアでは16×16強度マトリックスにすべての記録された時点の正規化強度データを格納します。
3. surf.m関数を使用して各記録時点の記憶された強度マトリックスからの色分けされた強度マップを構築する。
   NOTE：強度マップでは、赤V _mまたはCaの信号の高強度を表し、そして青色の蛍光信号の低強度を反映する。
4. avifile.m機能を使用して.aviファイルを作成します。
5. すべてのIを保存するaddframe.m関数を使用して活動電位またはカルシウムトランジェントの異なる記録の時点でntensityマップ。
   注：この時点で、V _m及びCaの伝播の二つの別々のAVIファイルが生成される。

Representative Results

ムービー1で示したように培養し、コンフルエントな単層は、通常の本質的なリズムを発揮する。私たちは、その後、完全にコンフルエントHL-1単層でのV _M / Caのデュアルチャネル光学マッピングを行った。 図1（a）は、記録されたシングルからV _mとCaの信号の例のトレースを示しているビート。デュアルチャネル光学マッピングシステムを使用して均一に伝播V _mとCaの信号の代表的な等時性マップは、 図1Bおよび1Cに示されている。均一に伝播活動電位およびカルシウムトランジェントの代表的な時系列画像は、同一のHL-1培養単層から得た。最後に、 映画2と3は、HL-1融合性単層で均一に伝播する活動電位（ 動画2）、カルシウムトランジェント（ 動画3）のアニメーション例を提供する。

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図1： （A）500ミリ秒の周期長（CL）で電気的にペーシングされたビートからV _mと（青）およびCa（赤）の例トレース。 （B）HL-1単層のための私達の光学マッピングシステムのイメージ。 （C）全体の視野全体で同じペースビートから活動電位の伝播の等時マップ。 （D）視野全体で同じペースビートからのCaトランジェント伝播の等時マップ。両方の等時のマップでは、時間の経過は、50ミリ秒で開始し、暗赤色などのダークブルーで始まる、色で表現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2： （A）60におけるV _mの分布の一連のマップ、80、140、200ミリ秒の記録が開始された後。 （B）60でのCa分布のマップ、80、140、200ミリ秒の記録が開始された後。

映画1：対物レンズ40倍で、光学顕微鏡下で、培養5日目にコンフルエントHL-1単層から記録された代表のムービー。

映画2 ：500ミリ秒のCLでペーシングビートから伝播活動電位の代表映画。

映画3 ：PACから伝播のCaトランジェントの代表映画EDは500ミリ秒のCLで破った。

Discussion

この記事では、カルシウムや電位感受性蛍光色素で染色した培養されたHL-1心房筋細胞の単層で光学マッピングの重要な側面を説明しています。これは、最適なHL-1細胞単層、マッピング装置のセットアップを培養し、培養単層をマッピングし、データ分析を含む。

成功した培養細胞をマップするには、キーが均一に分布細胞単層を準備することです。カバーガラスの上に細胞を播種すると、細胞を均一に分散させるようにしてください。これらは最高の電気的ペーシングに応答する、いつものように、完全に成長し、完全にコンフルエント細胞単層をマップ。これは、染料のロード中に酸素化細胞を維持することも重要ですが、酸素の泡が、これはカバースリップからそれらを殺すか、外れるおそれがあり、細胞に直接接触しないようにしてください。色素concentratiを増加させながら、色素濃度を低下させ、信号の大きさを減少させ、信号対雑音比を低下させる光の強度を低減オン信号の大きさを増加させるだけでなく、ノイズを増加させる光の強度を高める。したがって、蛍光色素濃度と励起光強度の最適なバランスは、記録信号の信号対雑音比を向上させるために決定されなければならない。これは光露光領域内の光力学的細胞の損傷を引き起こす可能性がある。また、光学マッピング記録中、集中光の長時間露光に細胞単層を曝露を避けるようにしてください。最後に、記録信号の高時間的及び空間的分解能を提供し、光学マッピングシステムは、高品質のデータを得るために必要とされる。

無傷の心臓におけるデュアルチャネル光学マッピングによる同時収集電圧及びカルシウムシグナルの能力に心臓電気生理学を研究するための大きな可能性を有しているが、ある制限は、この技術は、2次元投影マップとして3-D表面から情報を収集することである。 3-Dのcurvatの無視情報無傷心臓からの2-Dで得られたデータ心のUREは、特に伝導速度の解析では、データの分析でエラーが発生する可能性があります。培養された2-D HL-1細胞モデルを使用する利点は、我々は、規則的および不規則なリズムを視覚化カルシウムトランジェントと活動電位の動態を評価するため、伝導速度を決定し、Caおよび活動電位の伝播パターン（均一または不を特徴付けすることができる無傷の心臓の3-D構造からの妨害のない均一な伝播）。したがって、成功裏に無料のアプローチとして培養HL-1心房筋細胞単層におけるカルシウムトランジェントと活動電位の両方をマッピングすることは非常に心房筋細胞の電気生理学的特性や心房不整脈の基礎となるメカニズムの理解を高めることができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rhod2 dry powder	AAT Bioquest	21062
pluronic	AAT Bioquest	20050
DMSO	Sigma	276855
Rh237	Invitrogen	S-1109
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P3911
KH2PO4	Sigma	P0662
NaH2PO4	Sigma	S9638
MgSO4	Sigma	M7506
D-Glucose	Sigma	G8270
NaHCO3	Sigma	S6014
CaCl2	Sigma	C3881
HEPEs	Sigma	H3375