Abstract
Mappatura ottico ha dimostrato di essere una tecnica utile per rilevare l'attività elettrica cardiaca sia cuori intatta ex vivo e in monostrati miociti in coltura. Cellule HL-1 sono stati ampiamente utilizzati come un modello cellulare 2-dimensionale per studiare diversi aspetti della fisiologia cardiaca. Tuttavia, è stata una grande sfida per la mappa otticamente calcio (Ca) transienti e potenziali d'azione contemporaneamente dallo stesso campo visivo in una colta HL-1 monostrato cellulare atriale. Questo perché è necessario trattamento e la cura speciale per preparare le cellule sane che possono essere catturati elettricamente e otticamente mappate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di lavoro ottimale per la doppia mappatura ottica del canale. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire l'esperimento di mappatura ottica doppio canale. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione del potenziale d'azione propagazione e cinetica Ca in sviluppo aritmia.
Introduction
Un calcio unico (Ca) e la tensione (V m) doppia mappatura ottica del canale tecnica 1-5 sta emergendo come uno strumento efficace per registrare simultaneamente i segnali V m e Ca sia cuori intatti e monostrati di cellule in coltura. Questa tecnica permette di ottenere informazioni potenti sul rapporto tra transienti di calcio e potenziali di azione per meglio comprendere i meccanismi elettrofisiologici sottostanti di aritmie cardiache.
Monostrati di cellule in coltura hanno dimostrato di essere un modello cellulare utile per studiare elettrofisiologia cardiaca e il meccanismo alla base di aritmie. 4,6-8 HL-1 le cellule sono una linea di cultura myocyte atriale ben caratterizzato. Cellule HL-1 mantengono anche un genotipo e fenotipo differenziato in modo univoco che include morfologica, elettrofisiologico, e le caratteristiche farmacologiche di miociti atriali adulti. Queste cellule esprimono geni e proteine cardiache, tra cui important canali ionici cardiaci (ie, L- e canali del calcio di tipo T) 9 e isoforme maturi di proteine contrattili sarcomeriche normalmente presenti nei miociti atriali adulti come gli altri e ci hanno già segnalato. 10-13 Inoltre, HL-1 le cellule possono essere colta per formare un 2-dimensionale (2-D) miociti monostrato. Così, i vantaggi dell'utilizzo di colture monostrato HL-1 sono: 1) il costo relativamente più basso e più facile da mantenere una linea di cultura miociti di isolare e coltura miociti neonatali primarie; 2) un monostrato confluente di cellule riduce la complessità strutturale che derivano dalla struttura 3-D del cuore; 3) un monostrato di cellule in grado di eliminare l'interferenza della fibrosi interstiziale che si verifica nel cuore intatta. Questo può essere utilizzato per analizzare specifiche funzioni elettrofisiologiche di un gruppo di miociti senza interferenze di fibroblasti e matrice interstiziale; 4) valutazione delle conseguenze funzionali di manipolazione farmacologica o genetica in culmonostrati cellulari turati possono essere efficacemente raggiunti. Pertanto, HL-1 le cellule sono diventate un modello cellulare ampiamente utilizzato per studiare diversi aspetti della fisiologia miociti e attività elettriche anormali stimolazione indotta. 13-16 Tuttavia, la gestione e la cura speciale è richiesto per la cultura monostrati di cellule sane che rispondono a esterni La stimolazione elettrica per gli studi di mappatura ottica. Inoltre, la doppia procedura di tintura colorazione fluorescente potrebbe facilmente danneggiare l'integrità della coltura monostrati di cellule confluenti. Pertanto, l'esecuzione di V m / CA a doppio canale di mappatura ottica in coltura HL-1 monolayers è stata una grande sfida.
L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire i passaggi chiave per l'esecuzione con successo doppia mappatura ottica del canale in coltura HL-1 monostrati. Qui abbiamo fornito ampi dettagli su un protocollo ottimizzato per la preparazione monostrato HL-1 cellule, doppia mappatura ottica canale di un monostrato di cellule in coltura, e l'elaborazione dei dati di mappatura.
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Protocol
1. Soluzione Preparazione
- Soluzione noradrenalina (NP)
- Sciogliere 40 mg di NP in 25 ml di 30 mM acido ascorbico (0,1475 g di acido ascorbico in 25 ml di Milli-Q (MQ) acqua depurata. Evitare l'esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché noradrenalina (NP) è sensibile alla luce.
- Filtrare la soluzione NP con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aliquota della soluzione in 1 ml microtubi sterile e conservare a -20 ° C. Una volta congelato, NP è stabile per un mese.
- Integrata Lavare e Final Claycomb supporti
- Iniziare con 43,5 ml di Claycomb medio e integrare con 5 ml di siero bovino fetale (FBS), 0,5 ml di penicillina / streptomicina, 0,5 ml di NP e 1: 100 diluito L-Glutammina fare 50 ml di mezzo finale Claycomb integrato. Evitare l'esposizione alla luce diretta durante la preparazione della soluzione perché Claycomb mezzo è sensibile alla luce.
- Preparare il supporto Lavare Claycomb utilizzando la stessa ricetta del supsere realizzata Claycomb media tranne aggiungere 5% FBS e omettere la NP e componenti L-glutammina.
NOTA: I media finale e Wash Claycomb integrati sono buoni per due settimane se conservato a 4 ° C senza l'esposizione alla luce diretta.
- Soia soluzione inibitorio tripsina
- Sciogliere 25 mg di inibitore della tripsina di soia in 100 ml di tampone fosfato salino Ca-free e Mg-libera di Dulbecco (PBS).
- Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron.
NOTA: La soluzione sterilizzata è stabile per un mese se conservato a 4 ° C.
- Gelatina / fibronectina soluzione di rivestimento piatto
- Sciogliere 0.1 g di gelatina in 500 ml di acqua per fare MQ 0,02% di gelatina.
- Autoclave, quindi diluire 1 ml di fibronectina in 199 ml di 0,02% gelatina e mescolare delicatamente.
- Aliquota 6 ml di soluzione di gelatina in tubi separati e conservare a -20 ° C.
- Soluzione Salt Hanks '
- Utilizzando scalporepiastra, sciogliere i seguenti sali in acqua MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0.4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1.261).
- Soluzione di calcio di colorante sensibile (Rhod2)
- Diluire 1 mg di polvere secca Rhod2 in 400 ml di 20% Pluronic F-127 in DMSO per fare un Rhod2 colorante soluzione madre e conservare a -20 ° C.
- Diluire questa soluzione 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks 'per ottenere una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l'esperimento.
- Soluzione Tensione dye sensibili (Rh237)
- Diluire 5 mg di Rh237 con 2 ml di DMSO per rendere soluzione stock e conservare a -20 ° C. Diluire soluzione madre 1: 1000 con la soluzione Salt Hanks 'per fare una soluzione di lavoro finale prima di iniziare l'esperimento.
& #160; NOTA: 1-4 soluzioni sono basate sul HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb con lievi modifiche.
2. Passaging e Coltura HL-1 atriale miociti su vetrini
NOTA: Le cellule HL-1 possono essere ottenuti dal Dr. Claycomb (Louisiana State University).
- Grow HL-1 le cellule in fiasche T25 e mangimi con 5 ml di integrazioni Claycomb media quotidiana. Passage le cellule T25 flaconi ogni cinque giorni secondo la HL-1 protocollo coltura cellulare Claycomb (descritto di seguito) 10.
- Coprioggetto tondo Luogo (diametro 20 mm) in 12 pozzetti piastre di coltura 24 ore prima che le cellule del pallone T25 sono completamente confluenti e pronto per essere diversi passaggi, e quindi coprire i vetrini con gelatina / fibronectina notte a 37 ° C.
- Il prossimo giorno, aspirare e scartare la gelatina / fibronectina dalle piastre di coltura e di sostituirlo con 1,5 ml di integrare media finale Claycomb in ogni pozzetto.
- Cellule Spalato da una cultur T25e pallone dopo aver raggiunto piena confluenza al giorno 5. Aspirare il mezzo dal pallone T25 contenente la cultura confluenti e sciacquare la cultura brevemente con PBS a 37 ° C.
- Aspirare PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C pipettando la tripsina / EDTA sul fondo del pallone T25 per evitare il contatto diretto con le cellule. Incubare a 37 ° C per 1 min.
- Rimuovere tripsina / EDTA tramite aspirazione e aggiungere un altro 1,3 ml di tripsina / EDTA per bombola T25. Incubare a temperatura ambiente per 1 min. Esaminare al microscopio e se le cellule sono ancora attaccate al pallone, toccare per rimuovere completamente le cellule rimanenti.
- Aggiungere 1,3 ml di inibitore della tripsina di soia per le cellule e le cellule di trasferimento del pallone in un tubo da centrifuga da 15 ml. Lavare il pallone vuoto con 5 ml di Wash Claycomb media. Aggiungere il risciacquo delle cellule nella provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 500 g per 5 min.
- Dopo centrifugazione, aspirare il surnatante e delicatamente risospendere il pellet cellularein 6 ml di mezzo integrato finale Claycomb.
- Seme ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti con 0,5 ml di sospensione cellulare da passaging cellulare. Alimentare le cellule con fresca INTEGRAZIONI media finale Claycomb quotidiana.
NOTA: Strettamente monitorare la crescita delle cellule, tipicamente i monostrati cellulari raggiungere stato confluenti il giorno 4 e le attività spontanee rimangono visibili. Poi, il monostrato colta sarà pronto per la mappatura ottica giorno 4-5.
3. Caricamento di calcio e di tensione coloranti sensibili alle cellule
- Per gli studi di mappatura ottica, rimuovere delicatamente il vetrino dalla piastra di coltura cellulare 12-bene e risciacquare con la soluzione Salt Hanks '.
- Per colorare le cellule con Ca colorante sensibile Rhod2, incubare il monostrato di cellule sul vetrino con 3 ml della ossigenato (gorgogliare con 5% di CO 2/95% O 2 gas) soluzione Rhod2 lavorare a 37 ° C a bagnomaria per 30 min .
- Per colorare le cellule con V m colorante sensibiliRh237, immergere il Rhod2 caricata monostrato cellulare in 3 ml di soluzione di lavoro Rh237 ossigenata a 37 ° C in un bagno d'acqua per altri 15 min.
Mappatura 4. Dual Channel Optical
- Posizionare il monostrato cellulare, che è doppio macchiato con V m e coloranti Ca, in una camera di circolazione su un microscopio a fluorescenza invertito. Utilizzare un sistema di circolazione riscaldata per mantenere la temperatura della camera di cella a 35 ± 1 ° C. Controllare accuratamente la temperatura del perfusato regolando la velocità del flusso che circola attraverso la camera per evitare un gradiente di più di 0,3 ° C attraverso la camera.
- Prima di registrare V m / segnali Ca, lavare il monostrato cellulare con la soluzione Hanks fresco per circa 5 minuti per eliminare il colorante residuo dalle operazioni di colorazione precedenti.
- Pace monostrati cellulari sano utilizzando un elettrodo bipolare costituito da una pipetta di vetro riempita con una soluzione di Salt Hanks 'e silver fili avvolti intorno alla punta della pipetta come descritto in precedenza 12,17.
- Pace monostrati di cellule sane in una durata del ciclo di 200-500 msec e polso larghezza di 2 ms, che prevedono una soglia di stimolazione a circa 1 mV.
NOTA: per ogni lotto di monostrati coltivate, almeno due monostrati non trattati devono essere utilizzati per verificare la condizione del lotto cella. Monostrati di controllo sani dovrebbero essere in grado di essere catturato da una stimolazione elettrica a durata del ciclo di 200-500 msec. Se i monostrati di controllo non riescono a essere elettricamente ritmo, questo suggerisce che l'intero lotto delle cellule non può essere adatto per esperimenti di mappatura ottica. - Per eccitare sia V m e Ca coloranti sensibili, utilizzare una sorgente di luce LED (520 nm) accoppiato con un filtro di eccitazione (510 nm / 40) e uno specchio dicroico (561 nm).
- Raccogliere i segnali fluorescenti emessi dalle cellule mediante un obiettivo 40X e split con uno specchio dicroico (594 nm) in un componente V m ed una componente Ca.Filtrare la luce emessa nel canale m V con un filtro passaggio lungo (700 nm) e la luce emessa nel canale Ca con un filtro passa banda (585/40 nm).
- Raccogliere la luce fluorescente filtrata con due telecamere CCD (80 x 80 pixel, 1.000 fps; redshirt Imaging).
- Per evitare dye photobleaching, effettuare registrazioni per meno di 2 secondi su ogni campo di vista di limitare il tempo di esposizione alla luce. Qui, l'immagine tipicamente quattro aree diverse per ogni monostrato.
5. Elaborazione dati di V mo Ca Recordings
- Per entrambi V m e segnali Ca (80 x 80 pixel), la media dei valori di intensità di venticinque (5 x 5) confinanti pixel in un valore di intensità in diversi momenti della registrazione per ridurre il rumore di fondo.
NOTA: Dopo la media dei dati, ogni punto del tempo di registrazione di un potenziale d'azione individuale o Ca transitoria produce una matrice di dati contenente 16 x 16 in media valori di intensità (mediacanali dati) con una risoluzione spaziale di 50 micron. - Definire tempo di attivazione (AT) di registrazione V m o segnali Ca.
- Per definire un tempo di attivazione (AT) di un potenziale d'azione singola o Ca transitorio, determinare il tempo del 50% di ampiezza di picco V mo segnali Ca utilizzando un algoritmo basato su MATLAB misura come precedentemente descritto. 12
- Revisionare manualmente l'ATS analizzato per eliminare eventuali errori che possono verificarsi durante l'analisi del programma.
- Conservare la definita AT matrice (16 x 16 in media i canali di dati) del potenziale d'azione registrata e transitori di calcio, rispettivamente, nel software utilizzato.
- Calcola potenziale d'azione o di calcio transitori velocità di conduzione (CV) vettori sulla matrice AT utilizzando il metodo di analisi campo vettoriale, come descritto in precedenza, con piccole modifiche 12,18.
- Calcolare il vettore CV di un canale dati relativi al suo circostante AT punti dati (5 ×; 5 vicina media canali dati) per simulare una superficie polinomiale liscia di tempi di attivazione (AT superficie) utilizzando un algoritmo di minimi quadrati all'interno del programma MATLAB 12,18.
- Calcolare la conduzione di vettore utilizzando le formule seguenti
Formula 1:
Formula 2:
θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)]
NOTA: Ve è un vettore CV proiettata a xey assi; dx / dt è la proiezione del vettore CV in asse x; dy / dt è la proiezione del vettore CV in asse y. T è la superficie AT; x, y riferiscono alla 2-D coordinate; T x = ∂T / ∂x è la derivata parziale di T rispetto ax; T y = ∂T / ∂y è la derivata parziale di T rispetto a y; θ è la direzione finale di un vettore CV. - Gruppo tutti i vettori della matrice AT in 36 percorsi, ciascuno dei quali copre un settore di dieci gradi sulla bussola. </ Li>
- Selezionare il percorso che contiene la più grande popolazione dei vettori CV tra le 36 vie di conduzione. Calcolare il CV medio di questa via per rappresentare il CV del monostrato.
6. Visualizzazione della propagazione delle onde anteriore
- Normalizzare l'intensità di un potenziale d'azione individuale o Ca transitoria a differenti tempi di registrazione relativi al suo valore di picco utilizzando il software MATLAB segnale.
- Temporaneamente memorizzare i dati di intensità normalizzate di ogni punto di tempo registrato in una matrice di 16 x 16 intensità nel software MATLAB utilizzato.
- Costruire una mappa di intensità codice colore dalla matrice intensità memorizzato di ogni punto di tempo di registrazione utilizzando la funzione surf.m.
NOTA: Nella mappa intensità, rosso rappresenta elevata intensità del V mo segnali Ca, e blu riflette bassa intensità dei segnali di fluorescenza. - Creare un file .avi utilizzando la funzione avifile.m.
- Salva tutto l'imappe ntensity in diversi momenti della registrazione del potenziale d'azione o Ca transitoria con la funzione addframe.m.
NOTA: A questo punto, verranno generati due file avi separati di V m e Ca propagazione.
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Representative Results
Un confluenti monostrato colto presenta un ritmo intrinseco regolare come dimostrato in Movie 1. Abbiamo quindi effettuato V m / Ca doppia mappatura ottica del canale in una completamente confluenti HL-1 monostrato. Figura 1A mostra esempi di tracce di V m e segnali Ca da una registrazione singola battere. Mappe isocrone rappresentativi di propagazione uniforme V m e segnali Ca utilizzando il sistema duale mappatura ottica canale sono mostrate nelle figure 1B e 1C. Immagini cronologici rappresentativi di potenziali d'azione propagate in modo uniforme e transienti Ca sono stati ottenuti dallo stesso HL-1 coltura monostrato. Infine, Movies 2 e 3 forniscono esempi di animazione di un potenziale propagazione uniforme azione (Movie 2) e transitorie del calcio (Movie 3) nella HL-1 confluenti monostrato.
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Figura 1: (A) Esempio tracce di V m (blu) e Ca (rosso) da un battito stimolato elettricamente ad una durata del ciclo (CL) di 500 msec. (B) L'immagine del nostro sistema di mappatura ottico per HL-1 monostrati. (C) Una mappa isocrona di azione potenziale propagazione dallo stesso ritmo ritmo per tutto il campo tutta la visione. (D) Una mappa isocrona di Ca propagazione transitoria dallo stesso ritmo ritmo per tutto il campo visivo. In entrambe le mappe isocrone, lasso di tempo è rappresentato con i colori, a partire da blu scuro come iniziazione e rosso scuro a 50 msec. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: (A) Una serie di mappe di distribuzione m V a 60, 80, 140, e 200 msec dopo l'inizio della registrazione. A 60 (B) Mappe di distribuzione Ca, 80, 140, e 200 msec dopo l'inizio della registrazione.
Movie 1: Un film rappresentante registrato da un confluenti HL-1 monostrato a cultura quinto giorno, sotto un microscopio ottico con un obiettivo 40X.
Movie 2 : Un film rappresentante di un potenziale d'azione propagato da un battito stimolato a CL di 500 msec.
Movie 3 : Un film rappresentante di un transitorio Ca propagato da un paced ha battuto in un CL di 500 msec.
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Discussion
Questo articolo descrive gli aspetti chiave della mappatura ottica in una colta HL-1 atriale myocyte monostrato colorati con coloranti fluorescenti sensibili di calcio e di tensione. Esso comprende coltura un ottimo HL-1 monostrato cellulare, l'installazione delle apparecchiature di mappatura, mappando un monostrato colta, e l'analisi dei dati.
Per mappare con successo cellule in coltura, la chiave è quello di preparare un monostrato cellulare uniformemente distribuito. Quando la semina le celle per i coprioggetti, assicurarsi per disperdere in modo uniforme le cellule. Mappa sempre monostrati cellulari adulto e completamente confluenti, in quanto questi saranno meglio rispondere alle stimolazione elettrica. E 'anche importante mantenere le cellule ossigenati durante il caricamento dei coloranti, ma le bolle di ossigeno non deve entrare in contatto diretto con le celle come puo uccidere o toglieteglieli dal coprioggetto. Abbassamento concentrazione di colorante e ridurre l'intensità della luce diminuirà segnale ampiezza e ridurre rapporto segnale rumore, aumentando concentrazi tinturasulla valorizzazione e l'intensità della luce aumenterà segnale grandezza, ma anche aumentare il rumore. Pertanto, un equilibrio ottimale di concentrazione colorante fluorescente e la forza della luce di eccitazione deve essere determinata per migliorare rapporto segnale-rumore di segnali di registrazione. Inoltre, durante la registrazione mappatura ottica, essere sicuri di evitare di esporre il monostrato cellulare per lunghe esposizioni di luce concentrata in quanto ciò potrebbe causare danni alle cellule fotodinamica all'interno dell'area luce esposta. Infine, un sistema di mappatura ottica che offre alta risoluzione temporale e spaziale dei segnali di registrazione è necessaria per ottenere dati di alta qualità.
Mentre doppia mappatura ottica canale cuori intatti ha un grande potenziale per lo studio elettrofisiologico cardiaco dovuto alla sua capacità di segnali di tensione e di calcio raccolga simultanee, una limitazione è che questa tecnica raccoglie informazioni da una superficie 3-D come 2-D di proiezione mappa. Ottenuto 2-D dati da cuori intatti con informazioni ignorato di 3-D curvature del cuore potrebbe causare errori nelle analisi di dati, in particolare in analisi velocità di conduzione. Con i vantaggi dell'utilizzo di un 2-D HL-1 modello cellulare colta, siamo in grado di visualizzare i ritmi regolari e irregolari, valutare Ca transitoria e azione potenziali cinetica, determinare la velocità di conduzione e caratterizzare Ca e del potenziale d'azione le modalità di propagazione (uniforme o non propagazione uniforme) senza interferire dalla struttura 3-D di un cuore intatto. Pertanto, la mappatura con successo sia transienti di calcio e potenziali d'azione in una colta HL-1 atriale miociti monostrato come approccio omaggio può migliorare notevolmente la comprensione delle proprietà elettrofisiologiche dei miociti atriali e i meccanismi alla base di insorgenza di aritmie atriali.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott Claycomb per la fornitura di cellule HL-1 e protocollo dettagliato di manutenzione. Vorremmo anche ringraziare la signora Elena Carrillo e il Dr. Seth Robia per la loro assistenza con la generazione di film cellulare e Mr. Pete Caron per la sua assistenza con fare alcuni accessori per il nostro sistema duale mappatura ottica del canale.
Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 a XA), National Institutes of Health (HL113640 a XA), e Loyola University Development Fund Research (a XA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
References
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