Abstract
Mapeamento Optical tem provado ser uma técnica valiosa para detectar a atividade elétrica cardíaca em ambos intacta ex vivo corações e em monocamadas miócitos em cultura. Células HL-1 têm sido amplamente utilizados como um modelo celular de 2-dimensional para o estudo de diversos aspectos da fisiologia cardíaca. No entanto, tem sido um grande desafio para o mapa opticamente cálcio (Ca) transientes e potenciais de ação simultaneamente a partir do mesmo campo de visão em um HL-1 monocamada de células cultivadas atrial. Isto porque manuseio e cuidado especial é necessário para preparar as células saudáveis que podem ser eletricamente capturados e opticamente mapeadas. Por conseguinte, foi desenvolvido um protocolo de trabalho óptima para o mapeamento óptico de canal duplo. Neste manuscrito, temos descrito em detalhes como realizar o experimento mapeamento óptico de canal duplo. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da propagação do potencial de ação e cinética de Ca no desenvolvimento de arritmia.
Introduction
A única cálcio (Ca) e tensão (V m) técnica de mapeamento óptico de canal duplo 1-5 está a emergir como uma ferramenta eficiente para gravar simultaneamente sinais V m e Ca em ambos os corações intactos e monocamadas de células em cultura. Esta técnica torna possível obter informações poderoso sobre a relação entre transientes de cálcio e os potenciais de acção para compreender melhor os mecanismos subjacentes electrofisiológicas de arritmias cardíacas.
As monocamadas de células cultivadas têm provado ser um modelo útil para estudar celular electrofisiologia cardíaca e o mecanismo subjacente de arritmias. 4,6-8 células HL-1 são uma linha de cultura dos miócitos atriais bem caracterizado. Células HL-1 também manter um genótipo e fenótipo diferenciado com exclusividade, que inclui morfológica, eletrofisiológico, e as características farmacológicas dos miócitos atriais adultos. Estas células expressam genes e proteínas cardíacas, incluindo important canais iónicos cardíacos (ou seja, L e canais de cálcio do tipo T) 9 e isoformas de proteínas maduras contrácteis sarcoméricas normalmente encontrado nos miócitos atriais adultos como os outros e que têm relatado anteriormente. 10-13 Além disso, as células HL-1 pode ser cultivadas para formar uma 2-dimensional (2-D) monocamada de miócitos. Assim, as vantagens de usar cultivadas monocamadas de HL-1 incluem: 1) custo relativamente mais baixo e mais fácil de manter uma linha de cultura de miócitos de isolar e cultivar os miócitos neonatais primários; 2) uma monocamada confluente de células reduz as complexidades estruturais que resultam da estrutura 3-D do coração; 3) uma monocamada de células pode eliminar a interferência de fibrose intersticial que ocorre no coração intacto. Isto pode ser utilizado para dissecar funções específicas electrofisiológicas de um grupo de miócitos, sem interferência de fibroblastos e da matriz intersticial; 4) avaliação das consequências funcionais a partir de manipulação farmacológica ou genética na culmonocamadas de células Tured pode ser efetivamente alcançado. Portanto, HL-1 células tornaram-se um modelo celular amplamente utilizado para estudar diversos aspectos da fisiologia dos miócitos, bem como atividades elétricas anormais induzida por estimulação. 13-16 No entanto, manuseio e cuidados especiais são necessários para a cultura monocamadas de células saudáveis que respondem a externo A estimulação eléctrica para estudos de mapeamento óptico. Além disso, o processo de coloração do corante fluorescente dupla pode facilmente danificar a integridade de monocamadas confluentes de células cultivadas. Assim, a realização V m / CA dual channel mapeamento óptico no cultivadas HL-1 monocamadas tem sido um grande desafio.
O objetivo deste método é fornecer os principais passos para a realização com êxito mapeamento óptico de canal duplo em cultivadas HL-1 monocamadas. Aqui nós fornecemos detalhes abrangentes sobre um protocolo otimizado para preparação monocamada HL-1 celular, mapeamento óptico de canal duplo de uma monocamada de células cultivadas, e processamento de dados de mapeamento.
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Protocol
1. Preparação de Solução
- Solução Norepinefrina (NP)
- Dissolver 40 mg de NP em 25 ml de ácido ascórbico 30 mM (0,1475 g de ácido ascórbico em 25 ml de água purificada Milli-Q (MQ). Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque norepinefrina (NP) é sensível à luz.
- Filtra-se a solução de NP com um filtro de seringa de 0,22? M. Alíquota da solução em 1 ml microtubos estéreis e armazenar a -20 ° C. Uma vez congelado, NP é estável durante um mês.
- Meios suplementados Lave e Final Claycomb
- Comece com 43,5 ml de meio Claycomb e suplementar com 5 ml de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ml de penicilina / estreptomicina, 0,5 ml de NP e de 1: 100 diluído L-glutamina para fazer 50 ml de meio suplementado Claycomb final. Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque médio Claycomb é sensível à luz.
- Preparar o meio de lavagem Claycomb usando a mesma receita que a supmédio mentado Claycomb exceto adicionar 5% FBS e omitir o NP e componentes L-glutamina.
NOTA: A mídia Final e Wash Claycomb complementado são boas por duas semanas, quando armazenado a 4 ° C, sem exposição à luz direta.
- Soja solução inibidora de tripsina
- Dissolve-se 25 mg de inibidor de tripsina de soja em 100 ml de Ca e Mg livre-livre de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS).
- Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M.
NOTA: A solução esterilizada é estável durante vários meses, quando armazenada a 4 ° C.
- Solução de gelatina / Fibronectina revestimento prato
- Dissolve-se 0,1 g de gelatina em 500 ml de água para fazer MQ 0,02% de gelatina.
- Autoclave, então diluir 1 ml de fibronectina em 199 ml de 0,02% de gelatina e misture delicadamente.
- Aliquota 6 ml de solução de gelatina em tubos separados e armazenar a -20 ° C.
- Solução de sal de Hanks
- Usando um rebuliçoplaca, dissolver os seguintes sais em água MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4 mil), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5.042), CaCl 2 (1,261).
- Solução corante sensível ao cálcio (Rhod2)
- Dilui-se 1 mg de pó seco Rhod2 em 400 ul de 20% de Pluronic F-127 em DMSO para fazer uma solução estoque Rhod2 tingir e armazenar a -20 ° C.
- Dilui-se esta solução de reserva de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência.
- Solução de corante sensível Tensão (Rh237)
- Dilui-se 5 mg de Rh237 com 2 ml de DMSO para fazer uma solução estoque e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a solução stock de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência.
& #160; NOTA: 1-4 soluções baseiam-se no protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb com pequenas modificações.
2. Passaging e Cultivo HL-1 atriais miócitos em lamelas
NOTA: As células HL-1 pode ser obtido a partir de Dr. Claycomb (Louisiana State University).
- Crescer HL-1 células em frascos T25 e alimentar com 5 ml de suplementado Claycomb Medium diárias. Passagem as células em frascos T25 de cinco em cinco dias de acordo com o protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb (descrito abaixo) 10.
- Coloque as lamelas circulares (20 mm de diâmetro) em 12 placas de cultura de 24 horas antes das células no frasco T25 confluente são totalmente e pronto para ser passado, e então cobrir as lamelas com gelatina / fibronectina durante a noite a 37 ° C.
- No dia seguinte, aspirado e descartar a gelatina / fibronectina a partir das placas de cultura e substitua com 1,5 ml de meio suplementado Claycomb final em cada poço.
- Dividir células de uma cultur T25e após atingir confluência balão cheio no dia 5. Aspirar o meio do frasco T25 contendo a cultura confluente e enxaguar a cultura brevemente com PBS a 37 ° C.
- Aspirar PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C por pipetagem a tripsina / EDTA para o fundo do frasco T25 para evitar o contacto directo com as células. Incubar a 37 ° C durante 1 min.
- Remover tripsina / EDTA por aspiração e adicionar outros 1,3 ml de tripsina / EDTA por frasco T25. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Examinar ao microscópio e se as células que ainda estão presos ao balão, toque para desalojar completamente as células restantes.
- Adicionar 1,3 ml de inibidor de tripsina de soja para as células e as células de transferência de balão para um tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar o balão vazio com 5 ml de meio de lavagem Claycomb. Adicionar a água para as células no tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
- Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celularem 6 ml de meio suplementado Claycomb final.
- Semente cada poço de uma placa de 12 poços com 0,5 ml de suspensão de células a partir de passagens em células. Alimente as células com meio suplementado final Claycomb fresca diariamente.
NOTA: Estreitamente monitorar o crescimento das células, tipicamente as monocamadas de células confluentes atingir o estatuto no dia 4 e as actividades espontâneas permanecem visíveis. Em seguida, a monocamada cultivadas estará pronto para mapeamento óptico no dia 4-5.
3. Carregamento de cálcio e de tensão Corantes sensíveis às células
- Para os estudos de mapeamento de óptica, remova cuidadosamente a lamela do 12-placa de cultura de células e enxaguar com solução salina de Hanks.
- Para corar as células com o corante sensível ao Ca Rhod2, incubar a monocamada de células na lamela com 3 ml da oxigenado (borbulhar com 5% de CO 2/95% O 2 gás) a solução de trabalho Rhod2 a 37 ° C em banho-maria durante 30 min .
- Para manchar as células com corante sensível V mRh237, imergir o Rhod2 monocamada celular carregado em 3 ml de solução de trabalho de Rh237 oxigenada a 37 ° C num banho de água durante mais 15 min.
Mapeamento 4. Dual Channel Optical
- Coloque a monocamada de células, que é o dobro-coradas com corantes V m e Ca, em uma câmara de circulação de um microscópio de fluorescência invertido. Usar um sistema de circulação aquecido para manter a temperatura da câmara da célula, a 35 ± 1 ° C. Controlar cuidadosamente a temperatura do perfusado, ajustando a velocidade do fluxo que circula através da câmara, para evitar um gradiente de mais do que 0,3 ° C ao longo da câmara.
- Antes de gravar V m / sinais de Ca, lava-se a monocamada de células com solução de Hanks fresco durante aproximadamente 5 minutos para remover o corante que permanece nos passos anteriores de coloração.
- Pace monocamadas de células saudáveis, usando um eletrodo bipolar composta de uma pipeta de vidro preenchido com solução salina de Hanks e um silver fio espiral ao redor da ponta da pipeta, como descrito anteriormente 12,17.
- Pace monocamadas de células saudáveis em um comprimento de ciclo de 200-500 ms e pulso largura de 2 ms, à espera de um limiar de estimulação em aproximadamente 1 mV.
NOTA: Para cada lote de monocamadas de cultura, pelo menos, duas monocamadas não tratadas devem ser utilizados para testar o estado do lote de células. As monocamadas de controlo saudáveis deve ser capaz de ser capturada por estimulação eléctrica em comprimentos de ciclo de 200-500 ms. Se as monocamadas de controlo falhar para ser electricamente estimulado, isto sugere que o lote de célula inteira pode não ser adequado para as experiências de mapeamento óptico. - Para excitar tanto V m e corantes sensíveis Ca, use uma fonte de luz LED (520 nm de comprimento de onda), acoplado com um filtro de excitação (510 nm / 40) e um espelho dicróico (561 nm).
- Recolha os sinais fluorescentes emitidos pelas células através de uma objetiva de 40X e dividir com um espelho dicróico (594 nm) em um componente V m e um componente Ca.Filtra-se a luz emitida no canal de m V com um filtro de passagem longa (700 nm) e a luz emitida no canal de cálcio, com um filtro de passagem de banda (585/40 nm).
- Coletar a luz fluorescente filtrada usando duas câmeras CCD (80 x 80 pixels, 1.000 fps; RedShirt imagem).
- Para evitar a fotodegradação de corante, para fazer gravações de menos de 2 segundos em cada campo de vista a limitar o tempo de exposição à luz. Aqui, normalmente imagem quatro áreas diferentes para cada monocamada.
5. Processamento de Dados do V m ou Ca Recordings
- Para ambos os sinais Ca V (80 x 80 pixels) e m, calcular a média dos valores de intensidade de vinte e cinco (5 x 5) pixels vizinhos para um valor de intensidade, em diferentes pontos no tempo de gravação para reduzir o ruído de fundo.
NOTA: Após a média de dados, cada ponto de um potencial de ação individual ou Ca transitória tempo de gravação gera uma matriz de dados que contém 16 x 16 em média valores de intensidade (médiacanais de dados) com uma resolução espacial de 50 um. - Definir o tempo de ativação (AT) de sinais de Ca gravado V m or.
- Para definir um tempo de activação (AT) de um potencial de acção individual ou Ca transiente, determinar o tempo de 50% da amplitude de pico do V, sinais de Ca utilizando um algoritmo baseado no MATLAB feito por encomenda ou m, tal como descrito anteriormente. 12
- Corrigir manualmente o ATs analisados para eliminar quaisquer erros que possam ocorrer durante a análise do programa.
- Armazenar o definido AT matriz (16 x 16 canais de dados média) de potencial de acção gravado e transiente de cálcio, respectivamente, no software usado.
- Calcular potencial de acção ou transientes de cálcio a velocidade de condução (CV) na matriz de vectores AT usando o método de análise do campo de vectores como descrito anteriormente com modificações menores 12,18.
- Calcula-se o vector de CV de um canal de dados em relação ao seu redor AT pontos de dados (5 ×; 5 vizinha média de canais de dados) para simular uma superfície lisa polinomial dos tempos de ativação (na superfície) usando um algoritmo de mínimos quadrados dentro do programa MATLAB 12,18.
- Calcular condução vector utilizando as fórmulas abaixo
Fórmula 1:
Fórmula 2:
θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)]
NOTA: Ve é um vetor CV projetada em xey eixos; dx / dT é a projeção do vetor CV no eixo-x; dy / dT é a projeção do vetor CV no eixo-y. T é a superfície da AT; x, y referem-se a 2-D coordenadas; T x = ∂t / ∂x é a derivada parcial de T em relação a x; T y = ∂t / ∂y é a derivada parcial de T em relação à y; θ é a direcção final, de um vector de CV. - Grupo de todos os vetores da matriz AT em 36 vias, cada um dos quais abrange um sector de dez graus na bússola. </ Li>
- Seleccione o percurso que contém a maior população de vectores CV entre as 36 vias de condução. Calcule o CV média desta via para representar o CV da monocamada.
6. A visualização da propagação da onda frontal
- Normalizar a intensidade do sinal de um potencial de acção individual ou Ca transiente em diferentes pontos de tempo de gravação em relação ao seu valor de pico utilizando o software MATLAB.
- Armazenar temporariamente os dados de intensidade normalizadas de cada ponto de tempo gravado numa matriz 16 x 16 de intensidade no software Matlab utilizado.
- Construa uma intensidade mapa colorido a partir da matriz de intensidade armazenado de cada ponto de tempo de gravação utilizando a função surf.m.
NOTA: No mapa de intensidade, o vermelho representa alta intensidade do V sinais Ca m ou e azul reflete baixa intensidade dos sinais de fluorescência. - Criar um arquivo .avi usando a função avifile.m.
- Guarde todo o imapas ntensity em momentos diferentes de gravação do potencial de ação ou Ca transiente usando a função addframe.m.
NOTA: Neste ponto, dois arquivos AVI separadas de V m e propagação Ca será gerada.
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Representative Results
A monocamada confluente cultura apresenta um ritmo intrínseco regular como demonstrado no filme 1. Nós, então, realizada V m / Ca mapeamento óptico de dois canais em um totalmente confluente HL-1 monocamada. A Figura 1A mostra exemplo vestígios de V sinais Ca m e a partir de um único gravado bater. Mapas isócronos representativos de sinais de Ca utilizando o sistema de mapeamento óptico de duplo canal uniformemente propagadas V m e estão apresentados nas Figuras 1B e 1C. Imagens cronológicas representativos de potenciais de ação uniforme propagadas e transientes de Ca foram obtidos a partir do mesmo HL-1 cultura em monocamada. Finalmente, Cinema 2 e 3 fornecem exemplos de animação de um potencial uniforme propagada ação (Filme 2) e transiente de cálcio (Filme 3) na HL-1 monocamada confluente.
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Figura 1: (A) os traços Exemplo de V m (azul) e Ca (vermelho) de uma batida eletricamente passeado em um comprimento de ciclo (CL) de 500 ms. (B) Uma imagem de nosso sistema de mapeamento óptico para HL-1 monocamadas. (C) Um Mapa isócrono de ação potencial de propagação da mesma batida compassada em todo o campo de visão inteiro. (D) Um Mapa isócrono de Ca propagação transitória da mesma batida compassada em todo o campo de visão. Em ambos os mapas isócronos, lapso de tempo é representada com cores, começando com azul escuro como iniciação e vermelho escuro, a 50 ms. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: (A) Uma série de mapas de distribuição V m a 60, 80, 140 e 200 ms após o início da gravação. (B) Os mapas de distribuição Ca em 60, 80, 140 e 200 ms após o início da gravação.
Filme 1: Um filme representante inscrito a partir de um confluente HL-1 monocamada na cultura dia cinco, sob um microscópio de luz com uma objetiva de 40X.
Filme 2 : Um filme representante de um potencial de ação propagado de uma batida compassada em um CL de 500 ms.
Filme 3 : Um filme representante de um transiente Ca propagada a partir de um paced bater em um CL de 500 ms.
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Discussion
Este artigo descreve os principais aspectos do mapeamento óptico em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada coradas com cálcio e tensão corantes fluorescentes sensíveis. Ele inclui a cultura de um HL-1 monocamada de células ideal, configuração dos equipamentos de mapeamento, o mapeamento de uma monocamada de culto, e análise de dados.
Para mapear com sucesso células em cultura, é a chave para preparar uma monocamada de células distribuídas uniformemente. Quando semear as células sobre a as lamelas, certifique-se para dispersar uniformemente as células. Sempre mapear monocamadas de células totalmente crescidos e completamente confluentes, como estes irão responder melhor à estimulação elétrica. É também importante para manter as células oxigenadas durante o carregamento dos corantes, mas as bolhas de oxigénio não deve entrar em contacto directo com as células como este pode matar ou desalojar-los a partir da lamela. Diminuir a concentração de corante e a redução da intensidade da luz diminui grandeza de sinal e reduzir a relação sinal-ruído, enquanto aumenta concentrati corantese melhorando a intensidade da luz vai aumentar magnitude do sinal, mas também aumentar o ruído. Portanto, um equilíbrio óptimo de concentração de corante fluorescente e luz de excitação força deve ser determinado para melhorar a relação sinal-ruído dos sinais de gravação. Além disso, durante a gravação de mapeamento óptico, certifique-se para evitar a exposição a monocamada de células para longas exposições de luz concentrada, pois isso pode causar danos às células fotodinâmica dentro luz exposta a área de. Finalmente, um sistema de mapeamento óptico que fornece alta resolução temporal e espacial de sinais de gravação é necessária para a obtenção de dados de elevada qualidade.
Enquanto mapeamento óptico de canal duplo em corações intactos tem um grande potencial para o estudo de eletrofisiologia cardíaca, devido à sua capacidade de sinais de tensão e de cálcio cobrar simultâneas, uma limitação é que esta técnica coleta informações a partir de uma superfície 3-D como uma projeção de mapa 2-D. Obtidos 2-D dados de corações intactos com informações ignoradas, de 3-D curvature do coração pode resultar em erros na análise de dados, em especial na análise da velocidade de condução. Com as vantagens de usar um HL-1 modelo celular cultivadas 2-D, que são capazes de visualizar ritmos regulares e irregulares, avaliar Ca transitória e potencial de ação cinética, determinar a velocidade de condução e caracterizar Ca e ação potencial padrões de propagação (uniforme ou não- propagação uniforme) sem interferência a partir da estrutura 3-D de um coração intacto. Portanto, o mapeamento com sucesso ambos os transientes de cálcio e potenciais de ação em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada como uma abordagem de cortesia pode aumentar consideravelmente a compreensão das propriedades eletrofisiológicas de miócitos atriais e os mecanismos subjacentes da arritmogênese atrial.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Claycomb para fornecer células HL-1 e protocolo de manutenção detalhado. Gostaríamos também de agradecer Ms. Elena Carrillo e Dr. Seth Robia por sua assistência com a geração de o filme celular e Mr. Pete Caron por sua ajuda com fazer alguns acessórios para o nosso sistema de mapeamento óptico de canal duplo.
Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 para XA), os Institutos Nacionais de Saúde (HL113640 para XA) e Loyola Fundo de Desenvolvimento Research University (a XA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
References
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