Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Abstract

A microscopia confocal é o método de escolha para a análise da localização de vários tipos de células presentes nos tecidos complexos, tais como a medula óssea. No entanto, a análise e quantificação de localização celular é difícil, já que em muitos casos, depende de contagem manual, tendo, assim, o risco de introduzir um viés dependente avaliadores e reduzindo a confiabilidade entre examinadores. Além disso, muitas vezes é difícil avaliar se a co-localização entre duas células resulta de posicionamento aleatório, especialmente quando tipos de células diferem fortemente da frequência de sua ocorrência. Aqui, um método para a quantificação isenta de co-localização celular na medula óssea é introduzido. O protocolo descreve a preparação da amostra para se obter secções histológicas de ossos longos de murino inteiros, incluindo a medula óssea, bem como o protocolo de coloração e a aquisição de imagens de alta-resolução. Um fluxo de trabalho de análise que vai desde o reconhecimento da hematopoiética e não hemattipos de células opoietic em 2 dimensões imagens de medula (2D) osso para a quantificação dos contactos directos entre as células é apresentado. Isto também inclui uma análise de vizinhança, para se obter informações sobre o microambiente celular em torno de um determinado tipo de célula. A fim de avaliar se a co-localização dos dois tipos de células é a mera função do posicionamento de célula ou aleatório reflecte associações preferenciais entre as células, uma ferramenta de simulação, que é adequado para testar esta hipótese, no caso de células hematopoiéticas, assim como as células do estroma, é utilizado. Esta abordagem não é limitada para a medula óssea, e pode ser alargado a outros tecidos para permitir a análise reprodutível, quantitativa dos dados histológicos.

Introduction

Devido a recentes desenvolvimentos tecnológicos rápidos na microscopia, incluindo imageamento óptico, a análise de células dentro do contexto de todo o tecido tornou-se cada vez mais acessível para os imunologistas. A caracterização de células individuais em suspensão representa um método valioso e indispensável para compreender a função celular e molecular. No entanto, a análise das células dentro do seu (micro) -anatomical ambiente é essencial para a compreensão das interacções entre os vários tipos de células que colaboram com os processos complexos, tais como o desenvolvimento de respostas imunitárias.

Embora seja relativamente fácil para os microscopistas para obter informações qualitativas a partir de imagens, continua a ser um desafio para quantificar esses dados, em parte devido ao fato de que os métodos de análise neste domínio estão ficando para trás em comparação com o que é possível na aquisição de imagem. Muitos pesquisadores ainda dependem de contagem manual de células em suas imagens de histologia demorado,introduzindo assim uma polarização entre diferentes avaliadores e impedindo a replicação por outros grupos. Muitas vezes, uma imagem representativa é escolhido para sublinhar uma declaração sobre a posição celular ou co-localização em uma publicação, tornando-se difícil para o leitor a julgar a relevância estatística de um evento como esse.

Juntamente com o fato de que o conteúdo de informação completa de dados de imagem são raramente exploradas, que enfatiza a necessidade de uma abordagem mais imparcial, mais rápido e abrangente para analisar imagens histológicas.

A medula óssea é um tecido complexo, que assume as funções vitais importantes como o órgão de hematopoiese em vertebrados adultos. Além de ser o local de nascimento de células hematopoiéticas ^1,2 e desempenhando um papel importante no desenvolvimento de linfócitos B ^3, ele também atua como um local onde as reações imunológicas são iniciados ⁴ e apoia, células de recirculação B maduras ^5. Além disso, o seu papel na manutenção da imemória mmunological tornou-se cada vez mais apreciado na última década, como vários tipos de células que constituem a memória imunológica, foram encontrados para residir ^6-9.

A relação entre a arquitetura complexa do tecido da medula óssea e as suas funções ainda permanece elusiva. Ao contrário de órgãos linfóides secundários, que são organizadas em macro-compartimentos tais como zonas de células T e B, a medula óssea não tem uma macro-compartimentalização clara. Até agora compartimentos distintos na medula óssea são definidos, pela sua proximidade ao córtex do osso ou a vasculatura. A importância das várias populações de células do estroma residentes na medula óssea para um número de processos tais como células estaminais, que suportam o desenvolvimento de células B ou a manutenção de populações de células de memória imunes (tais como células plasmáticas durabilidade (PCs), CD4 ⁺ e CD8 ^+, células T da memória) indica claramente que existe um certo grau de micro-compartimentalização na medula óssea.

10. A visualização e caracterização de células do estroma da medula óssea é difícil devido às suas características morfológicas, com extensões dendríticas longos e finos formando uma rede em toda a medula óssea, e a falta de marcadores apropriados para discriminar subpopulações estromais.

Ainda não está claro até que ponto esses nichos partilham características comuns em relação à sua compositio celular e molecularn, e que elementos tornar um determinado nicho único. Para além das células do estroma, os tipos de células hematopoiéticas tenham sido mostrado desempenhar um papel crucial, fornecendo certos sinais de, pelo menos, para alguns dos nichos. Claramente, a complexidade da composição nicho requer sua análise in situ, e tornou-se cada vez mais importante para imunologistas e hematologistas para aumentar o zoom na microarquitetura de medula óssea, por exemplo, analisando as relações espaciais entre seus componentes celulares.

Aqui, uma estratégia para quantificar co-localização e de vizinhança relações celulares na medula óssea de uma forma automática e imparcial é apresentado. Um fluxo de trabalho detalhadas, incluindo a geração de camundongos quiméricos, que abriga as células fluorescentes estromais e células hematopoiéticas não fluorescentes, preparação de cortes histológicos de ossos não descalcificadas, aquisição de imagens confocal que cobrem o osso inteiro, bem como a análise de imagem automatizado de c celularo-localização e a sua validação / discriminação de posicionamento aleatório por uma ferramenta de simulação é fornecida (Figura 8).

Protocol

As experiências com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes atuais e regulamentos (licença de experiência com animais G0194 / 11).

1. Produção de fluorescente de Medula Óssea Ratos quiméricos

NOTA: A geração de medula óssea fluorescente ratinhos quiméricos para visualizar as células do estroma da medula óssea é realizado tal como descrito antes ^9.

1. Iniciar o tratamento Del-Cre x ratos ROSA-tdRFP (camundongos que expressam a proteína fluorescente vermelha em tandem (tdRFP) ubíqua ^11-13) para prepará-los para a irradiação. Como alternativa, use qualquer outra estirpe com expressão ubíqua da proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina e 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) através da água de beber, dois dias antes da irradiação.
2. Irradiar ratos duas vezes com 3.8 cinza com um Césio-137 gamma-irradiador wifina um intervalo de 3 horas. Para este efeito, colocar ratinhos em uma gaiola de torta de irradiação adequados para o respectivo irradiador.
   NOTA: Para a irradiação de ratos, o Instituto não requer anestesia. Siga as políticas institucionais locais referentes à anestesia para irradiação. Tratar os animais com 5 mg / kg por via subcutânea de carprofeno (sc) por dia após a irradiação, se há sinais de dor.
3. No dia seguinte, reconstituir os ratos com uma injecção intravenosa de 3 x 10 ⁶ células da medula óssea preparadas a partir de ossos longos de ratinhos C57BL / 6 dadores em tampão de transferência ^9. Mantenha os ratos sobre Neomicina e vitaminas para até 2 semanas e acompanhar o seu bem-estar e de peso durante este tempo. Aguardar pelo menos 4 semanas para permitir a reconstituição do sistema imunológico, antes de iniciar os tratamentos experimentais específicos (por exemplo, a imunização) ^9.
4. Sacrifício camundongos e colocá-los em uma placa de dissecação, esterilizar as pernas com etanol 70%. Euthanize camundongos, em conformidade com as políticas institucionais locais. Nosso Instituto realiza luxação cervical.
5. Use fórceps e tesouras para remover a pele das coxas. Remover o tecido muscular para expor o osso femoral. Desarticular o osso femoral a partir do quadril e joelho usando uma pinça e tesouras. Tenha cuidado para não quebrar ou cortar o osso.
6. Remova cuidadosamente restantes grandes pedaços de tecido muscular e da cartilagem do osso usando uma tesoura. Remover o tecido muscular remanescente por fricção com o osso papel de seda laboratório. Recolher os ossos limpos em um prato de petri com salina tamponada com fosfato (PBS).
7. Corrigir os ossos do fêmur inteiras em 4% de paraformaldeído (PFA, microscopia eletrônica-grade) para 4-6 horas.
8. Descartar PFA e incubar ossos em 10% de sacarose em PBS S / N. No dia seguinte, incubar os ossos em 20% de sacarose S / N. Um dia depois, incubar os ossos em 30% de sacarose O / N.

2. cryosectioning of Bones

NOTA: Após 16-24 h em 30% de sacarose, congelar os ossos e criocorte-los de acordo com o método de fita de Kawamoto ^14,15.

1. Prepara-se uma proveta grande (2,000 ml de volume) com gelo seco e acetona (cerca de 2: 1 ratio de volume, por exemplo, 400 ml de gelo seco e 200 ml de acetona) sob uma coifa. Coloque um copo pequeno (150-250 ml de volume) com hexano dentro (30-50 ml aproximadamente). Esperar para a mistura arrefecer para baixo (aproximadamente 10 min, até a geada aparece no exterior da proveta grande).
2. Preencha ¾ do cryomold marcado com Super Cryoembedding Médio (SCEM); coloque cuidadosamente os ossos dentro até que sejam totalmente imersa, tomando cuidado para que eles não se tocam as bordas do molde. Com grandes fórceps segurar o cryomold dentro do copo que a parte inferior do molde apenas tocando a superfície do hexano.
   1. Deixe as bordas exteriores do congelamento SCEM (indicado pela opacidade, isto leva cerca de 15 segundos). Em seguida, solte completamente o molde para o hexano e deixá-lo freeze por 1-2 min. Retire a amostra congelada e embrulhe em papel celofane e, em seguida, uma folha de alumínio (para proteger a amostra de secar e para evitar a exposição à luz). Armazenar a -80 ° C até cryosectioning.
3. Para cryosectioning dos ossos do fêmur usar um micrótomo e micrótomo padrão folhas de tecidos duros.
4. Regule a temperatura da amostra e lâmina do micrótomo a -24 ° C. Deixe a amostra sentar dentro do microtome por cerca de 15 min antes do corte.
   1. Fixe o bloco de amostra para o titular da amostra de metal com SCEM ou a temperatura de corte ideal (OCT) médio. Ajustar a orientação do bloco, se necessário. Apare a amostra até que o osso está totalmente aberta e a medula é visível. Ajuste a espessura de corte de 7 mm (rejeitar a primeira seção).
   2. Fixe um pedaço de fita Kawamoto com o lado adesivo na parte superior do bloco de amostra, utilizando uma espátula de madeira veado couro-coberto. Subsequentemente, a amostra cortada e ligar a fita de modo que a secção éLocalizada no lado de cima. Transfira a fita para uma lâmina de vidro usando uma pinça. Fixe a fita para a lâmina de vidro com fita Scotch.
5. Deixe secções secar durante pelo menos 30 min e armazená-las a -80 ° C até utilização. Guarde as lâminas não coradas e desmontados em caixas de plástico slide com espaçadores entre os slides individuais, a fim de evitar que elas se unem. Coradas e montadas lâminas podem ser armazenadas por até uma semana em papelão pastas de slides, a 4 ° C.

Coleção 3. Imagem

1. Descongele e criosecções mancha de acordo com protocolos de imunofluorescência comuns ^9. Incluir um corante nuclear, por exemplo, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI) para visualizar a integridade do tecido.
   NOTA: mancha, por exemplo, para RFP para visualizar as células estromais eosinófilos mancha com anti-proteína básica principal (MBP) e anticorpo de rato anti-rato Alexa Fluor 647-anticorpo (anti-anticorpos biotina-RFP e estreptavidina-Alexa Fluor 555), , células Bcom anticorpo de rato anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpo e PCs com luz anti-cadeia κ-fluoresceína-iso-tiocianato (FITC) e anticorpos anti-FITC-λ1 cadeia leve (pormenores do procedimento de coloração são descritos em ^9).
2. Monte secções coradas: colocar uma gota de Fluoromount na seção e, em seguida, cubra com uma tampa de vidro # 1 deslizamento, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Subsequentemente, realizar microscopia confocal de varrimento a laser com um instrumento equipado com linhas de laser adequados para a coloração.
3. Para gravar imagens para análise de co-localização automatizada de células hematopoiéticas da medula óssea com células estromais usando a ferramenta Wimasis, aplicam-se as seguintes definições:
   1. Usar uma lente da objectiva de 20X e um campo de visão de 708,15 x 708,15 mm. Para a análise automatizada, manter o tamanho de todas as imagens consistentes a 2.048 x 2.048 pixels (px), a fim de manter os resultados comparáveis.
   2. Grave um canal para estruturas do estroma (por exemplo, (por exemplo, DAPI, a 405 nm) e canais adicionais para as células hematopoiéticas de interesse (por exemplo, três canais, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B e PCs).
   3. Gravar imagens utilizando linha média de 4 ^16. O ideal é cobrir toda a seção femoral tomando imagens adjacentes de solteiro. Alternativamente, tirar fotografias não adjacentes de diferentes regiões da medula óssea (diafisária bem como epifisária).
      NOTA: Tenha cuidado para não produzir sobreposições entre imagens adjacentes (para evitar a análise repetida de células nas áreas de sobreposição).
4. Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem de microscopia. Verifique e, se necessário, ajustar o contraste para todos os canais no software Visualizador de Imagens / análise.
5. Exportação 3 arquivos .jpg por arquivo de imagem: um arquivo .jpg para o canal DAPI (/ verde / azul formato vermelho (RGB), falso código de cor amarela), um arquivo .jpg para o canal de estroma (escala de cinza) e um .jpg arquivo contendoos canais de células hematopoiéticas (máximo de 3 canais, em formato RGB, por exemplo, FITC (PCs, cor falsa: verde) / Alexa Fluor 594 (células B, cor falsa: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falsa cor: vermelho)) .

4. Automated Análise de Imagem

1. Use uma ferramenta de análise de imagem para realizar segmentação de imagens, quantificação de co-localização e análise de vizinhança (ver Discussão).
2. Se estiver usando as ferramentas Wimasis, faça o seguinte:
   1. Carregar os conjuntos de 3 ficheiros.jpg por imagem com o mesmo nome de ficheiro seguido por um sublinhado e um número que indica o tipo da imagem.
   2. Use _1 para o arquivo .jpg com células hematopoiéticas, _2 para o arquivo .jpg para o canal DAPI, _3 para o arquivo .jpg para o canal de estroma. Por exemplo: Image1_1.jpg (células hematopoiéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), e Image1_3.jpg (canal de estroma). Faça o upload das imagens através da conta do cliente.
   3. Para contato celular quantificaçãoescolha a ferramenta de contato celular, clicando no respectivo campo. Para arredores célula quantificação, escolha a ferramenta vizinhança da célula e introduzir o raio arredores preferido em um (que é medida a partir de bordas das células).
   4. Faça o download dos resultados.
      NOTA: Os resultados são fornecidos como ficheiros.jpg que mostram as células hematopoiéticas e do canal de estroma com os limites dos objectos detectados realçada, assim como ficheiros.csv individuais contendo as medições para cada imagem, para além de uma síntese que .csv contém os dados para todas as imagens enviadas.
3. A partir do contato medições determinar a freqüência de células hematopoiéticas (vermelho, verde, azul ou células) em contato com as células estromais, ou as freqüências de células vermelhas, verdes, azuis ou entrar em contato com os outros tipos de células hematopoiéticas (Um exemplo é mostrado em resultados representativos , Figura 4). A fim de determinar as freqüências, dividir as contagens de contato dadas por imagem poro total de células conta por imagem.
   1. Para as experiências com ratinhos individuais, soma-se as contagens totais de contacto de todas as imagens para os ratinhos individuais e dividi-los pela soma das contagens de células totais de todas as imagens.
4. A partir das medições arredores, determinar a frequência de células vermelhas, verdes ou azuis na distância seleccionada a partir de células estromais e / ou as frequências de células vermelhas, verdes ou azuis na proximidade preferido para os outros tipos de células hematopoiéticas, tal como descrito no passo 4.3 ( ver também resultados representativos, figura 4).

5. Simulação da Random Medula Óssea Posicionamento

1. Antes de executar as simulações de posicionamento celular aleatória nas imagens histológicas de medula óssea analisados, preparar os seguintes arquivos com antecedência: os únicos arquivos .csv fornecidos pela ferramenta de contacto das células, os arquivos .jpg originais para o canal DAPI e os arquivos .jpg originais para o canal do estroma.
2. A fim de realizarsimulações de grupo em uma série de imagens (por exemplo, todas as imagens a partir de uma seção femoral), recolher todos os arquivos .jpg originais (_1, _2 e _3) e os correspondentes arquivos .csv individuais em uma pasta.
   NOTA: A ferramenta de simulação para o posicionamento de células de medula óssea aleatória está disponível mediante solicitação.
3. Inicie a ferramenta de simulação, marque a caixa "Auto-load de dados de imagem".
   NOTA: O programa irá ler as contagens de células e tamanho médio das células a partir do arquivo .csv automaticamente. Estes valores são exibidos nas caixas para "número de celular" e "tamanho celular AVG" (Figura 5A).
4. Digite o tag comum para os arquivos .csv, ou seja, o fator comum em seus nomes. Digite o número de conjuntos de imagens que devem ser usados ​​para a simulação de modo batch.
5. Carregar o arquivo .jpg gerado a partir do canal de estroma (com nome terminando _3).
6. Introduza as definições para gerar a máscara do canal DAPI:
   1. Marque a caixa "? Aplique a máscara "Definir o limite para converter a imagem DAPI em uma máscara binária a 10 (faixa de 0 - 255).
   2. Marque a caixa "8-bit?" Marque a caixa "Dilate?" E defina o grau de dilatação a 5 px. Marque a caixa "w / erosão?".
   3. Entre o valor desejado para o raio da vizinhança (raio bairro) utilizado para a análise das imagens simuladas. Para uma imagem de 708,15 x 708,15 mm com um tamanho de 2048 x 2048 px (pixel de escala xy: 0,346 mm), 29 px correspondem a 10 um.
7. Caixa de seleção "Usar Otsu?", Para usar o algoritmo de Otsu ¹⁷ para detecção automática de estruturas do estroma.
   NOTA: Este é o mesmo algoritmo que é usado pela ferramenta de contacto e arredores. Usando o mesmo algoritmo de segmentação de imagem na análise automatizada da imagem gravada ea imagem simulado é fundamental a fim de manter os dados comparáveis.
8. Insira as configurações para células hematopoiéticas, que ARe simulado como formas circulares.
   NOTA: Os números de celulares para as células vermelhas, verdes e azuis estão diretamente carregado a partir do arquivo .csv (ver também o passo 5.6).
   1. Utilizar a ferramenta de simulação para calcular o diâmetro médio em px de células vermelhas, verdes e azuis. Para determinar a área média de uma única célula como a área total de cada tipo de célula na imagem em px dividido pela contagem total de células por imagem. Usar a área média para calcular o raio de um disco, utilizando a fórmula. Dobrar o raio para determinar o diâmetro médio.
9. Medir a distribuição de tamanho de célula dos tipos celulares analisados ​​com o software de análise de imagem que inclui funções de segmentação de objectos. Determinar σ para todos os tipos de células hematopoiéticas ⁽¹⁸ e Figura 5B).
   Observação: Uma vez que as distribuições de tamanho de célula das células gravadas não são determinadas pela análise de imagem automatizado, usar uma distribuição de Gauss, como uma aproximação das distribuições reais. A largura de tele curva de distribuição é descrita por σ e pode ser muito diferente para diferentes tipos de células. (Para mais detalhes, consulte a Figura 5B).
   1. A partir destas medições, determinar o "tamanho de célula de corte": o diâmetro em que px descreve o menor objeto ainda reconhecido como uma célula completa pela ferramenta de análise de imagem.
10. Digite os parâmetros nas respectivas caixas na interface gráfica do usuário (Figura 5A).
    1. Digite o tamanho da célula cortado, ou seja, o tamanho mínimo permitido celular na simulação, como um diâmetro em px.
    2. Introduzir σ em px para a simulação da distribuição de tamanho de célula para as células vermelhas, verdes, azuis e (a partir do passo 5.9).
    3. Marque a caixa "Excluir" na subseção "Células em Mask". Com essa configuração, o programa escolheu uma nova posição para uma célula se confunde-se com pelo menos um pixel com uma área de no-go da máscara. Marque a caixa "evitar a sobreposição celular? ̶1; na subseção "exclusão Cell".
    4. Introduza a distância mínima permitida entre os centros das duas células em px.
       NOTA: A distância mínima deve ser determinada a partir das imagens gravadas. Injustamente distâncias mínimas medidas conduzirão a resultados artificiais / tendenciosas para a comparação das imagens gravadas e simulados.
    5. Definir a área máxima de sobreposição de 100%, se a sobreposição é definida pela distância mínima de centro a centro.
    6. Defina a ferramenta de simulação para 1.000 repetições.
    7. Marque a caixa "células de salvamento automático?" Para salvar as coordenadas dos objetos simulados para todas as repetições de cada imagem do lote como arquivos .rect (formato de texto). Marque a caixa "imagens de salvamento automático?" Para salvar um arquivo .tiff para cada imagem simulada. Digite uma tag comum para os arquivos salvos.
       NOTA: O "? Células de salvamento automático" opção reduz simulação executando tempo e tamanho total de dados, em comparação com quando salvar o real simulado images. Os arquivos .rect salvar as coordenadas das células simuladas como rectângulos e pode, assim, ser convertidos em imagens simuladas, se necessário.
11. Inicie a simulação clicando em "simulação Run".
    NOTA: A ferramenta de simulação gera automaticamente um arquivo .csv para os 1.000 simulações de cada imagem, incluindo as contagens de contacto média e contagens arredores de glóbulos vermelhos, verdes e azuis com as células vermelhas, verdes, azuis, e do estroma para cada conjunto de simulações repetidas . Além disso, para todos estes valores, as médias dos 1.000 simulações com desvio-padrão (STD) e erro padrão da média (SEM) são fornecidos.
12. Determinar a frequências de contacto e freqüências arredores de um conjunto de 1.000 imagens simuladas média. Para isso, divida o contato média e conta arredores pela contagem de células gravado por imagem. Comparar as frequências com os resultados da análise de co-localização automática da imagem gravada.
13. Aplicar stati adequadasmétodos stical dependendo da análise de ¹⁹ (para a Figura 7, foi utilizado um Wilcoxon bicaudal assinado teste de classificação).

Representative Results

Cortando criocortes de osso descalcificada com o método de Kawamoto fita permite que todo o osso a ser cortado como uma secção intacta, com a medula óssea da região endosteal ainda ligado ao osso mineralizado, tanto na diáfise, bem como nas áreas da epífise com a sua alta densidade do osso trabecular (Figura 1). A coloração nuclear das secções revela que, apesar de pequenas fendas na preparação não pode ser totalmente evitado, a estrutura das artérias e sinusóides, bem como a rede reticular do parênquima permanece intacta.

Como um exemplo de uma técnica de imunofluorescência de medula óssea quimérica fluorescente vermelha e a sua análise subsequente, uma coloração para os eosinófilos (proteína básica principal, MBP), PC (κ e λ cadeia leve) e células B (B220) é mostrado. Os ratinhos foram imunizados com 100 ug de hapteno 4-hidroxi-3-nitrof acoplado a γ globulina de galinha (NP-CGG) em alúmen ip, 4 semanas apósreconstituição, reforçado com 50 mg de NP-CGG em PBS iv 21 dias mais tarde e analisadas no dia 30 após o reforço. A análise de imagem automatizado resultou em um reconhecimento muito precisa das estruturas do estroma, incluindo também muito pequenos fragmentos de processos reticulares. Uma vez que o número de células de células estromais não pode ser determinado com o sistema aqui apresentado (ver também discussão), nenhum limiar tamanho foi introduzido para o canal do estroma, a fim de detectar todos os fragmentos presentes nas imagens (Figura 2). PCs e eosinófilos são maiores do que as células B e também mostrar uma forma mais heterogênea. Todos os três tipos de células têm sido bem reconhecido à primeira vista. Grumos celulares, especialmente de células B, foram bem separados. A ferramenta de análise é otimizado para os tipos de células acima mencionados (eosinófilos, PCs, células B). Para outros tipos de células, pode ser necessário ajustes. Os arquivos .csv gerados pela ferramenta de contacto das células contêm as seguintes medidas relevantes para células hematopoiéticas:contagem de células para cada população de células; área total de cada população de células em px; contagem de contacto das células vermelhas (neste caso, eosinófilos), células verdes (aqui PCs) ou células azuis (que aqui células B) com células vermelhas, verdes, azuis ou cinzentas (células estromais). Os arquivos .csv gerados pela ferramenta arredores célula conter as seguintes medidas para células hematopoiéticas: contagem de células para cada população de células; área total de cada população de células em px; contagem arredores de células vermelhas, verdes e azuis com as células vermelhas, verdes, azuis e cinzentas (células do estroma).

A fim de validar a qualidade dos instrumentos de análise de imagem, os resultados da análise automatizada foram comparados com o de uma contagem manual por avaliadores treinados 6 (Figura 3). Todos os avaliadores receberam imagens idênticas para análise. Estruturas do estroma e células hematopoiéticas foram cuidadosamente delineado com uma ferramenta de análise de imagem e estas regiões de interesse foram salvos e analisados. Para as estruturas do estroma, a área total por imagemfoi comparada entre a análise automatizada e manual. Estruturas estromais pareciam ser difícil para os avaliadores treinados para reconhecer precisamente, tal como reflectido pela grande variação observada para o tamanho da área total do estroma contado manualmente (Figura 3A). Aqui, a análise automatizada determinado um valor próximo da área média detectada por avaliadores treinados. Para todas as células, a ferramenta de análise automatizada determinada uma quantidade um pouco menor do que o de células contadas manualmente. No entanto, para PCs e eosinófilos, o número ainda estava no intervalo de variação entre os examinadores observado para as contagens manuais. O número de células B detectados por análise automatizada, no entanto, era ligeiramente abaixo desta gama (Figura 3A). O tamanho médio de célula (área em px) como determinado pela análise automatizada era 512 px para PCs, para 436 px eosinófilos, e 317 px para células B, enquanto avaliadores treinados determinado um tamanho de 515 px para PCs, para 464 px eosinófilos, e 291 px para células B. Assim, a média cell tamanho para as células B, PC e eosinófilos determinadas pela análise automatizada era comparável para os tamanhos de célula médios determinados por avaliadores manuais (Figura 3B). Esta ferramenta automatizada de análise de imagem agora pode ser usado para quantificar os contactos directos de medula óssea candidato tipos de células nicho. Além disso, a frequência de células de um determinado tipo de célula células estromais vizinhos ou outros tipos de células hematopoiéticas pode ser determinada. Uma análise das PCs de medula óssea e os seus contactos para células estromais, eosinófilos, células B, e outros PCs é mostrado, bem como a frequência de PCs vizinhos estes tipos de células dentro de 10 e 20 um (Figura 4A). Além disso, as frequências de contacto de vários tipos de células hematopoiéticas com estroma pode ser quantificada (Figura 4B).

Antes de executar uma simulação de posicionamento medula óssea aleatória destas células com a ferramenta de simulação, os parâmetros que descrevem a distribuição de tamanho de célula como um Gausdistribuição Sian tem que ser determinado. Para obter uma distribuição de Gauss, que pode ser visualizado como uma curva em forma de "sino" simétrico e, apenas dois parâmetros têm de ser determinados: a localização do centro da curva (o modo, ou seja, onde o pico da curva está localizada ) e a largura da curva simétrico (isto é descrito pelo parâmetro σ acima mencionado). Este procedimento é mostrado aqui para PCs, eosinófilos e células B (Figura 5B). Distribuições de tamanho de célula medidos mostram que, para as células B, a largura da curva de distribuição descrito por σ é menor do que para PCs e eosinófilos. Para a simulação, os valores relativos de σ medido para as três populações de células foram mantidas (isto é, as células B foram sempre simulada por uma distribuição estreita de tamanho duas vezes mais do que a de PCs 'e eosinófilos'), enquanto os valores definidos em σ px eram conjunto para coincidir com o aspecto visual das células gravadas (Figura6B). Isso nos levou a aplicar uma σ de 2 px para células B e um σ de 4 px para ambos os PCs e eosinófilos. O ponto de corte de tamanho de célula foi determinada a partir das distribuições de tamanho de célula de medição. Para PCs e eosinófilos, um corte em 300 px tamanho do objeto, resultando em 20 px diâmetro de um objeto circular (cerca de 7 mm) e para as células B um ponto de corte em 220 px, levando a um diâmetro de 17 px (cerca de 6 mm) foi utilizado para a simulação.

A fim de definir as áreas na imagem aleatória simulado, onde as células podem ser colocadas por a ferramenta de simulação, uma máscara foi gerado a partir de sinais nucleares no canal DAPI de uma imagem histológica de medula óssea (Figura 6A). Um valor de 10 foi determinada como sendo o limite de intensidade ideal para gerar as imagens binárias (painel superior, imagem à direita). O limite determinado pelo algoritmo de Otsu não conduz ao pleno reconhecimento de todos os núcleos na imagem (painel superior, a imagem ao centro), de forma semelhante a intensidade fixalimiares de 50 ou de 150 (painel inferior, esquerda e centro da imagem) .A importância dos contactos de PCs, eosinófilos, ou células B com células do estroma (figura 4B) foi testado usando a ferramenta de simulação (Figura 7). Esta análise revelou taxas de contato significativamente maiores nas imagens gravadas em comparação com a simulação para PCs e células B (Figura 7a), em linha com o conceito de nichos estromais de apoio a estas populações. Isto foi confirmado em cinco camundongos quiméricos fluorescentes individuais (Figura 7b, D). Em contraste, nenhuma diferença clara foi determinada no caso de eosinófilos (Figura 7A, C).

Figura 1. Visão geral imagem de fluorescência de uma seção longitudinal de um fêmur murino criosseccionada com o método de fita de Kawamoto. O método da fita permite cuttinsecções de g com uma região endosteal intacta, tanto na diáfise, bem como nas áreas da epífise, a partir de osso descalcificada. A 7 mm de espessura seção osso de um ingênuo C57BL / 6 do mouse foi corado para a proteína de matriz extracelular laminina (vermelho), para Sca-1 para visualizar arteríolas (verde) e para núcleos (azul, DAPI). 47 telhas de 1.446 x 1.088 mm, resolução de 1360 x 1024 px foram gravadas e costuradas para criar a imagem panorâmica. Esta imagem foi adquirida em um grande campo microscópio de fluorescência, com uma lente objetiva de 10X (0,45 NA). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. automatizado de detecção de células do estroma e da medula óssea hematopoiética. A seção osso femoral de uma fluorescente chi vermelhomeric mouse no dia 30 após impulso foi manchado para RFP (cinza) para visualizar estroma, MBP (vermelho, eosinófilos), κ e λ cadeia leve (verde, PCs) e B220 (azul, células B). Esquerda: imagem original adquirido num microscópio confocal, utilizando uma objectiva 20X objectivo (0,8 NA) e um campo de visão de 708,15 x 708,15 mm. Direita: imagem segmentada. Os contornos dos objetos reconhecidos são realçados. Os retângulos brancos marcam a área mostrada nas imagens de fundo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Validação da análise automática de imagem por avaliadores treinados. (A) A área total das estruturas do estroma e número total de células de células hematopoiéticas contados por avaliadores treinados em um (estruturas do estroma), 10 (PCs), dois (eosinófilos) e uma imagem (células B) em comparação com os números de células obtidos por análise de imagem automatizado. Os pontos representam avaliadores individuais (n = 5-6). As barras indicam os valores médios ou valores determinados automaticamente. Distribuição do tamanho (B) Objecto de objectos contadas manualmente em relação ao tamanho médio determinado por objecto a análise automatizada. A fim de explicar as diferentes frequências dos diferentes tipos celulares, PCs foram contados em 10, eosinófilos em dois e células B em uma imagem. Os pontos representam objetos individuais. Linhas indicam a média. (C) delineamento manual das estruturas do estroma por avaliadores treinados. Esquerda: imagem original. Médio: exemplos de imagens analisadas manualmente. À direita:. Estruturas estromais detectadas por análise automatizada Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Figura 4. A análise automatizada de co-localização de PCs, eosinófilos, células B e células estromais da medula óssea do fémur. (A) Esquerda: Frequência de PCs em contato direto com as estruturas do estroma, eosinófilos, células B ou outros PCs em camundongos quiméricos fluorescente no dia 30 após o reforço. Oriente e direita: Frequência de PCs em 10 um imediações ou 20 um imediações das estruturas do estroma, eosinófilos, células B ou outros PCs. Partes deste figura (contato direto, 10 um arredores) são modificados a partir Zehentmeier et al. ⁹ (B) Freqüência de PCs, eosinófilos e células B em contato direto com as estruturas do estroma. 52-515 PCs, 918-3179 eosinófilos, células B 4146-13063 em 10-21 imagens foram contados a partir de 5 camundongos quiméricos fluorescentes no dia 30 após o reforço, compilados a partir de dois experimentos independentes. Os pontos representam os ratos individuais. As linhas indicam mediana."Target =" _ //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Determinação da distribuição do tamanho das células da medula óssea de PCs, eosinófilos e células B. (A) de tela da interface gráfica do usuário (GUI) da ferramenta de simulação. (B) A distribuição de tamanho de célula (área em px) de PCs (κ e luz λ cadeia, verde), eosinófilos (MBP, vermelho) e as células B (B220, azul) é mostrado em histogramas, medida após reconhecimento de objectos por software Volocity (painel superior). Em imagens de medula óssea do fêmur (painel inferior), detectado PCs são marcadas em vermelho (sobrepor amarelo), eosinófilos no azul (overlay violeta) e células B em amarelo (sobrepor cinza). A segmentação de imagens foi realizada através da definição de um limite de tamanho mínimo de 180 px para PCs,300 px por 220 px eosinófilos e de células B. 250 objetos foram medidos para PC, 650 objetos para eosinófilos e 3.000 objetos para células B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Geração da máscara para o posicionamento de célula aleatória simulado. (A) O canal original DAPI (amarelo), bem como sobreposições de imagens binárias com DAPI gerados por aplicação de vários limiares são mostrados. A máscara geradas a partir da imagem binária (limiar definido em 10) é apresentado abaixo (painel inferior, direita da imagem). As áreas a preto representam no-go áreas, as áreas brancas representam áreas em que as células são autorizados a ser colocados. (B) A imagem gravada (à esquerda) e a imagem simulada correspondente (à direita) mostram alta visuaissimilaridade. Os eosinófilos (PAM), PCs (κ e cadeia λlight), células B (B220) e células do estroma (RFP) são exibidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. O contato direto de tipos de células hematopoiéticas com estruturas estromais em imagens simuladas gravadas vs.. (A) Freqüência de PCs, eosinófilos e células B em contato direto com estroma no simulado em comparação com as imagens gravadas de camundongos quiméricos fluorescente no dia 30, após o impulso. As linhas ligam correspondente imagens (pontos) simulada e registrados. Imagens de um rato representante são mostrados em cada parcela. (B) As frequências de PCs, eosinófilos e células B em contato direto com estroma no simulado em comparação com as imagens gravadas de 5 ratinhos individuais a partir de duas experiências independentes. Teste de Wilcoxon, bicaudal (PCs: *** p = 0,0001; p = 0,0371 *; * p = 0,0161; p = 0,0012 ** ****; p <0,0001; eosinófilos: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; * p = 0,0161; p = 0,4143; *** p = 0,0007; células B: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0.0012 ; **** p <0,0001). Os pontos representam imagens individuais. As barras indicam média. Os valores de p 0,05 são considerados diferenças significativas. Os asteriscos em números indicam os seguintes valores P: ns: p> 0,05; *: P @ 0,05; **: P @ 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Partes deste figura (contato direto de PCs com estruturas do estroma) são modificados a partir Zehentmeier et al. ⁹ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

700 "/>
. Figura 8. fluxo de trabalho completo da abordagem de quantificação de células hematopoiéticas - interações entre células estromais na medula óssea de camundongos A abordagem é dividido em três partes principais: 1. cortes de medula óssea de camundongos são preparados e os dados são coletados por meio de microscopia confocal de varredura a laser, 2 . a análise automática das imagens gravadas e a simulação de posicionamento aleatório de células de medula óssea é realizado, 3. as contagens de contacto e de vizinhança obtidos a partir de imagens gravadas e simulados são comparados. A entrada (arquivos de imagem) e de saída (arquivo de texto) da análise automatizada é indicado em azul, a entrada (arquivos de imagem) e de saída (arquivos de texto e, opcionalmente, arquivos de imagem) da ferramenta de simulação é indicado em verde. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Apesar dos avanços nos métodos de imagem óptica modernos, a análise dos dados histológico ainda é muitas vezes dificultada pela falta de ferramentas adequadas e métodos de quantificação, ou por análises tendenciosas que se concentram em uma pequena área de interesse. A abordagem sinérgica aqui apresentada combina análise de imagem cobrindo toda a região de medula óssea, a segmentação automatizada e detecção de objectos de vários tipos de células hematopoiéticas e estromais, análise de co-localização, e, finalmente, uma ferramenta de validação de contactos não ocorrem aleatoriamente fornecidos por um novo custom- software de simulação projetadas.

Histologia dos ossos inteiros, incluindo a medula óssea tem sido difícil de executar devido às diferentes densidades dos tecidos presentes em uma secção de - por um lado a muito duro, osso mineralizado, por outro lado, a medula extremamente frágil, que é facilmente interrompido quando cortado em conjunto com o osso. Como alternativa, o método da fita para o corte de secções de osso pres^14,15 entadas aqui tem a vantagem de que estabiliza o tecido, deixando assim as áreas endosteal intacta (Figura 1). Além de ser ricas em osteoblastos, estas áreas têm sido sugeridos para desempenhar um papel na manutenção de células estaminais ^20.

O papel crucial das células estromais de processos de desenvolvimento e manutenção celular na medula óssea, é cada vez mais evidente. No entanto, a análise de células, estas frágeis raras tem provado ser difícil por dois motivos: em primeiro lugar, eles são difíceis de isolar a partir da medula óssea; em segundo lugar, o grau de heterogeneidade entre a população estromal não é conhecida, e, por conseguinte, pode-se perca uma população importante, utilizando certos marcadores que foram descritos para as células estromais. O método para gerar quimeras de medula óssea é útil para fluorescentes marca fluorescente e subsequentemente analisar a população de células de estroma da medula óssea, como um todo. No entanto, deve notar-se que, nestes kmce todas as células mesenquimais da medula óssea são visualizados, incluindo as células endoteliais e os osteoblastos. Isto deve ser tomado em consideração se os dados a partir de tais ratinhos quiméricos é analisada. Mesmo que há também um risco de células hematopoiéticas de origem destinatário sobreviventes a irradiação, essas células normalmente apenas cobrir uma área muito pequena, por campo de visão em comparação com o doador de CD45 ⁺ células, não afectando assim a análise histológica ^9. Evidentemente, este método deve ser combinados num passo subsequente com uma detecção mais específica do estroma (sub) populações. Actualmente, a análise destas células é feito principalmente por histologia, devido às razões mencionadas acima, que impõe um limite no número de parâmetros que podem ser analisados ​​ao mesmo tempo. O desenvolvimento de multi-parâmetro análises em microscopia vai ajudar a superar esses limites.

Durante a análise de imagem, a segmentação foi realizada utilizando o algoritmo de Otsu originais. Essencialmente, Este método baseia-thresholding agrupamento determina automaticamente o limiar de intensidade para a separação óptima do primeiro plano (sinal) e de fundo (ruído) pixels em dois grupos com o menor divergência estatística num determinado canal, resultando em uma imagem binária ^17. Aqui, o método de Otsu foi aplicado à versão logaritmo natural da imagem original, isto é:

Imagem de entrada para Otsu = ln (imagem de entrada)

Isso funciona melhor para imagens de fluorescência desde o método de Otsu podem identificar células dim como pano de fundo. Adicionando a função logarítmica permite uma melhor separação das células e de fundo em duas classes diferentes, o algoritmo de Otsu. No entanto, só a intensidade de limiar não é suficiente para detectar com precisão objetos únicos. Ele trabalha eficientemente quando a detecção de objectos bem separadas em imagens, mas não é suficiente para as células individuais separados localizados no interior de agrupamentos. Como alguns dos tipos de células queforam de interesse para nós, tais como eosinófilos ou células B, são frequentemente agrupados em conjunto no tecido, os seus núcleos no canal DAPI foram segmentados utilizando um algoritmo baseado no k-means do histograma de intensidade com k = 10 ^21. O algoritmo de segmentação celular vai traçar a mais brilhante para os pixels mais escuras (agrupados em 10 caixas) e olhar constantemente para a formação de objetos de célula-lembrando. Estes objectos serão então definidas como células. Quando todos os pixels tenham sido utilizados, os núcleos resultantes são dilatadas para gerar uma máscara que é então aplicada a outros canais de separação de aglomerado.

Deve ser notado que esta análise funciona bem para as células hematopoiéticas que são compactos, mas que é limitada no que diz respeito às células do estroma, uma vez que não é possível determinar as fronteiras destes grandes, distribuídos-out células devido à interligação das suas extensões dendríticas que formam uma rede reticular. Assim, células conta para células estromaisnão pode ser fornecido. Rotular células individuais através de mapeamento de destino repórteres sob o controlo de promotores específicos de estroma irá resolver esta questão, de acordo com o que tem sido publicada para neurónios (usando o "Brainbow" sistema ²²⁾ e para a marcação das células dendríticas foliculares em nodos linfáticos ^23.

Além disso a aplicação de um passo de redução de ruído para todos os canais de excluir objectos abaixo de 30 px, de exclusão de tamanhos foi aplicado no processo de reconhecimento de objectos para hematopoiéticas, mas não as células estromais. Pequenos fragmentos de células que foram cortados pela secção podem ser excluídos; no entanto, a perda pode ser negligenciada, neste caso, a favor de um reconhecimento inequívoca das células. Estendendo a análise e simulação de dois a três dimensões vai superar essa limitação. O desenvolvimento de métodos para estudar a distribuição celular em peças inteiras, por exemplo, por meio de microscopia de fótons múltiplos ou luz folha de microscopia / SPIM, certamente vai ajudar em thé o respeito. De forma a estudar a composição celular complexa de nichos de componentes múltiplos, que também irá tornar-se necessário aumentar o número de parâmetros que estão a ser analisados ​​in situ. Abordagens promissoras para a análise de múltiplos de informação histológica em combinação com citometria de quantificação foram publicados recentemente ^{24, 25.}

A análise foi realizada por contacto quantificar a sobreposição de dois objectos. O contacto directo foi definido como uma sobreposição de pelo menos um pixel. É importante notar que esta análise está limitada pela resolução das imagens de microscopia e depende, portanto, o comprimento de onda de excitação e de modo, bem como a abertura numérica da lente objectiva utilizada no microscópio, e o tamanho do furo de pino. Na análise mostrado aqui, um objectivo 0,8 NA, 20X com combinações fluorocromo excitado com 488, 561, 594, e 633 nm utilizando um fotão excitação foi aplicado. Assim, resolução lateral valores entre0,372 e 0,483 mm foram alcançados. Isso permite que as afirmações de ser feitas sobre a justaposição de várias subpopulações de células; no entanto, ele não dá qualquer informação sobre os mecanismos moleculares envolvidos nas supostas interações celulares. Além disso, são necessários outros métodos tais como microscopia intravital 2-fotão para melhorar a caracterização destes contactos intercelulares ^9. Transferência de energia (FRET) sistemas baseados Förster-ressonantes pode ajudar a confirmar se essas interações são realmente funcional ^26.

A fim de avaliar o microambiente celular de nichos de tecidos, não é apenas importante para analisar os contactos directos de células, mas também para quantificar os tipos de células na vizinhança de um determinado tipo celular de interesse ("análise vizinhança"). Estudos distâncias entre as células e estruturas do tecido medidos anteriormente publicado, tais como navios com base na posição do núcleo ^27. Desde que estávamos interessados ​​em determining a distância de vários tipos de células, em parte, com várias proporções de volume de citoplasmática para nuclear, que preferido para medir a distância entre as superfícies. Para este fim, calculou-se o raio de proximidade por determinação da distância Euclidiana entre um limite cell's depois de converter os valores a partir de um a px. A distância euclidiana é a distância em linha reta entre dois pixels e pode ser descrita pela fórmula ^28:

Células com pixels de seus limites dentro de uma distância euclidiana de eg, 10 um dos pixels de limites de uma célula-alvo foram contados como vizinho essa célula.

Na sua forma actual, a análise apenas determina se uma célula é posta em contacto ou aproximado por outra célula do mesmo tipo ou diferente, proporcionando assim apenas um binário SIM / NÃO caracterização. O número real de célulass que entre em contato com a célula de interesse ou estão dentro de um determinado raio a partir dele não é calculado. O passo seguinte será o de estender a análise actual de maneira que o tamanho do grupo de contactar ou células vizinhas podem ser detectadas e comparadas entre os diferentes células alvo do mesmo tipo. Isto irá levar a informação adicional importante sobre a composição de nichos da medula óssea, tais como o nicho de sobrevivência para células plasmáticas da medula óssea, para o qual a contribuição variando de células acessórias hematopoiéticas foi discutido ^29-33.

Os algoritmos de reconhecimento de objetos foram otimizados em conjunto com os especialistas de Wimasis usando sua comercialmente disponível serviço de solução personalizada e estão disponíveis mediante solicitação. Outra opção é usar um software disponível comercialmente para a análise de imagem, tais como Definiens, Volocity, ou Imaris, ou freeware, como CellProfiler.

A segmentação celular e análise de imagem ferramentas automatizadas nósre validado por comparação dos resultados com os dados analisados ​​manualmente fornecidos por seis avaliadores treinados imagem com relação a dois parâmetros, a saber, o tamanho do objecto e o número de células em várias populações de células. Como mostrado na Figura 3B, o tamanho médio de objecto para células hematopoiéticas (PCs, eosinófilos e células B) foi semelhante entre ambos os métodos, com uma variação mais alta para a determinação do tamanho manual para células e eosinófilos no plasma, provavelmente devido à sua forma mais irregular comparado às células B. A detecção automática de números de celulares apresentaram valores ligeiramente mais baixos do que os detectados manualmente. Nomeadamente, eles estavam ainda dentro da gama dos valores manuais, no caso de eosinófilos e PCs, e são inferiores a estes valores, no caso de células B, provavelmente devido a uma maior heterogeneidade de expressão de B220, o qual foi utilizado como um marcador para células B. B220 é conhecido por ser sobre-regulada durante a diferenciação das células B na medula óssea e células B com baixo bem como alto icoloração ntensity para B220 pode ser observado. Células B com sinais de baixa B220 caiu abaixo do limiar aplicada, o que pode ter causado a exclusão das células mais rapidamente em fase B. Um limite inferior para a detecção automática pode resolver este problema. Para as células do estroma, que são mais difíceis de detectar devido à sua menos compacto, mais dendríticas e morfologia estendido, a detecção manual resultou em altas variações entre avaliadores individuais. Curiosamente, a média da área total de estroma foi igual à área total determinada automaticamente, o que indica que a análise é bem adequado para compensar viés indivíduo pelos avaliadores. Tomados em conjunto, estes dados mostram que os resultados automatizados geralmente representam os valores médios de análises manuais e são bem adequados para reduzir a variabilidade inter-examinadores na análise.

A fim de discriminar posicionamento aleatório e não-aleatória de células dentro das limitações estruturais do tecido, uma ferramenta de simulação foi desenvolvido. During a simulação, uma imagem artificial com células hematopoiéticas posicionados aleatoriamente é criada para cada imagem histológica da medula óssea gravado. Em primeiro lugar, a imagem do canal de estroma é utilizado em seu formato original. A máscara é gerado a partir da imagem DAPI pela aplicação de um limiar baseado na intensidade fixa, convertendo assim a imagem em formato binário; a máscara binária então sofre várias etapas de dilatação com base em pixel e erosão. A máscara define áreas no campo da imagem, onde as células simuladas são autorizados a ser colocados. As coordenadas dos centros das células simuladas são fornecidos por um gerador de número aleatório uniforme, os limites de que quando determinado pelo tamanho da imagem. As informações sobre o número de células e o tamanho médio de célula para cada população determinada por análise de imagem automatizada das imagens gravadas são usados ​​para definir as populações de células hematopoiéticas simulados. O diâmetro da célula simulada é assumido para seguir uma distribuição gaussiana unidimensional a partir do qual o realdiâmetro da célula é selecionada aleatoriamente: O diâmetro é então modificada para que tamanho de célula de corte para o tamanho mínimo permitido objeto são introduzidos. No caso da célula simulada seria posicionado de tal modo que um ou mais pixels sobreposição com uma área de não-ir ou seria dentro de uma distância pré-definida de outra célula já colocado (4 mm de centro a centro, tal como determinado em imagens gravadas), novas coordenadas aleatórios será escolhido, enquanto o diâmetro é deixado inalterado. Isto irá ser repetida até que o número de células simuladas é igual ao número de células na imagem gravada.

O instrumento foi baseado no pressuposto de que as células hematopoiéticas pode ser posicionado livremente dentro da medula óssea, enquanto as estruturas do estroma actuar como uma matriz fixa no interior do tecido. O instrumento foi optimizado para a situação na medula óssea, onde áreas de parênquima são atravessadas por um sistema complexo de sinusóides. A abordagem de modelagem semelhante foi recentemente publicado pela Frenette e colegas de trabalho, a fim deanalisar o posicionamento de células-tronco hematopoiéticas, em relação às células do estroma e as estruturas vasculares, que constituem cerca de 30% do volume total de medula óssea femural ^25. A fim de corrigir para este efeito, a ferramenta de simulação aqui apresentada baseia-se uma máscara de áreas foram células são deixadas a ser colocado. Isto foi conseguido através de uma imagem de mancha nuclear, em que os objectos que representam os núcleos foram expandidas por uma dilatação de 5 passos (ver Figura 6) após binarização. As áreas com baixa densidade celular, ou seja, de baixa densidade de núcleos como o osso e sinusóides, não contribuirá para a máscara e, portanto, tornam-se áreas proibidas. A fim de evitar uma redução artificial dessas áreas no-go por o procedimento de dilatação, uma erosão 5-passo foi aplicado posteriormente, reabrindo assim áreas maiores de exclusão, deixando simultaneamente a alta densidade nuclear (daí o "permitido") áreas inalterado. Este método pode ser facilmente adaptada para outros órgãos linfóides. Em aqueles tquestões foram este método não pode funcionar (por exemplo, em áreas em que as células com um rácio elevado citoplasma / núcleo estão presentes), outros métodos, tais como a rotulagem citoplasmático pode ser utilizado para criar a máscara.

As células hematopoiéticas foram simuladas como objectos circulares cujo tamanho foi determinado usando um gerador de números aleatórios de Gauss, a média de que concordaram com a diâmetro médio calculado de cada tipo de célula. A largura da distribuição foi baseada em distribuições de tamanho de célula medido nas imagens gravadas conforme determinado por um software de análise de imagem. A fim de ter em conta que as pequenas fragmentos celulares foram excluídos da análise de imagem automatizado, de tamanho de célula pontos de corte foram introduzidos como determinado a partir da distribuição de tamanho de célula medido para cada tipo de célula (ver Figura 5).

Naturalmente, este funciona bem para os tipos de células que são relativamente uniformes em tamanho e forma, mas pode conduzir a problemas no caso de células que umare altamente heterogênea com relação a esses parâmetros. Deve ser notado que esta análise está optimizado para os principais tipos de células hematopoiéticas da medula óssea (granulócitos, células progenitoras hematopoiéticas e linfócitos), que têm em comum o facto de possuir uma forma regular, quase arredondada. No entanto, este método não foi testado para as células dendríticas, macrófagos ou tipos de células com corpos de células fortemente irregulares. Analisando essas células vão apresentar novos desafios para a nossa análise de imagem automatizado, bem como para a abordagem de simulação, incluindo a necessidade de melhores algoritmos de agrupamento de células de separação de ^24, bem como a forma-análise detalhada e simulação de não apenas as células diferentes tamanhos, mas também de diferentes formatos. Uma alternativa seria uma abordagem de simulação que trabalha com as formas exactas como registrado. No entanto, deve notar-se que este método poderia aumentar significativamente o comportamento determinista do sistema modelo.

Para a expe simuladoriments, 1.000 repetições da simulação para cada imagem gravada foram gerados. Usando este muitas repetições irá reduzir o erro relativo contribuído pelo processo de simulação-se a cerca de 3%. Nomeadamente, se os valores de célula-célula co-localização são calculados a partir de simulações que são aleatórios, em seguida, o próprio processo de simulação será caracterizada por uma função de erro ^-1/2 N, onde N é o número de simulações medido por imagem. Esta é a contribuição do processo de simulação se ao erro acumulado dos valores de co-localização medidos. Assim, para N = 1,000 a 3,16 de erro é contribuído%. As simulações apresentadas aqui funcionou por 20 a 60 min por imagem por 1.000 repetições quando apenas guardar as imagens simuladas como arquivos .rect (um formato de texto simples) ao invés de imagens como reais em formato jpeg ou tiff (também uma opção no software ).

Tomados em conjunto, esta abordagem permite, uma análise de alto rendimento imparcial de imagem histológicas e permite a geração de dados estatisticamente relevantes. Isto pode ser útil para a comparação localização celular sob diferentes condições. Além disso, o elemento temporal podem no futuro ser integrados em uma abordagem de modelagem de movimentos de células de medula óssea, quanto mais dados sobre a motilidade dos vários tipos de células na medula óssea se torna disponível. Este método pode então ser utilizado para simular a perturbação do sistema, tais como a mobilização de células da medula óssea para a circulação, por exemplo, neutrófilos, no caso de uma inflamação aguda ^34. Para melhor elucidar a função da medula óssea como um local de armazenamento de células de memória do sistema imunológico, também se pode imaginar estendendo-o para modelar a competição por fatores de sobrevivência. Além disso, a possível interferência entre nichos distintos poderiam ser tratadas, bem como a indução de nichos. Juntos, isso vai ajudar a entender as mudanças fisiológicas (por exemplo, desencadeia um comportamento regenerativo em células-tronco) como well como as perturbações patológicas do sistema como um todo, por exemplo no caso de desordens auto-imunes, neoplasia, ou inflamação aguda. Como parte de um conceito iterativo de experiência e modelagem, novas hipóteses podem ser gerados com base nas simulações, os quais por sua vez podem ser novamente testados experimentalmente, ajudando desse modo a melhor compreender a função e a interacção de vários tipos de células no interior da complexidade dos tecidos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).