Abstract
Конфокальной микроскопии является методом выбора для анализа локализации нескольких типов клеток в пределах сложных тканей, таких как костный мозг. Тем не менее, анализ и количественная оценка клеточной локализации трудно, так как во многих случаях она опирается на ручном подсчете, тем самым принимая риск введения оценщик в зависимости от смещения и снижения надежности Interrater. Кроме того, часто бывает трудно судить о том, в совместной локализации двух клеток приводит из случайного позиционирования, особенно, когда типы клеток сильно различаются по частоте их появления. Здесь способ объективной количественной оценки клеточной совместной локализации в костном мозге вводится. Протокол описывает подготовку образца используется для получения гистологических срезов целых мышиных длинных костей в том числе костного мозга, а также протокол окрашивания и получение изображений высокого разрешения. Рабочий процесс анализа, охватывающих период от признания кроветворной и не-hematopoietic типы клеток в 2-мерных изображений мозга (2D) кости количественной оценки прямых контактов между этими клетками представлена. Это также включает в себя анализ окрестности, чтобы получить информацию о сотовой микросреды, окружающей определенный тип клеток. Для того, чтобы оценить, насколько совместная локализация двух типов клеток является лишь результатом случайного позиционирования клеток или отражает льготных ассоциации между клетками, инструмент моделирования, который предназначен для проверки этой гипотезы в случае гемопоэтических а также стромальных клеток, является используемый. Этот подход не ограничивается костного мозга, и может быть распространен на другие ткани, чтобы обеспечить воспроизводимое, количественный анализ гистологических данных.
Introduction
В связи с недавним быстрым развитием технологий в микроскопии, в том числе оптических изображений, анализ клеток в контексте всей ткани становится все более доступным для иммунологов. Характеристика отдельных клеток в суспензии представляет собой ценный и незаменимый метод, чтобы понять, клеточной и молекулярной функции. Тем не менее, анализ клеток в их (микро) -anatomical окружающей среды имеет важное значение для понимания взаимодействия между различными типами клеток, которые сотрудничают в сложных процессах, таких как развитие иммунных реакций.
Хотя это относительно легко микроскописты, чтобы получить качественную информацию из изображений, она остается проблемой для количественной оценки этих данных, отчасти из-за того, что методы анализа в этой области являются отсталыми по сравнению с тем, что можно в приобретении изображений. Многие исследователи до сих пор полагаются на трудоемкого ручного подсчета клеток в их гистологии изображений,Таким образом, введение смещения между разными оценщиками и препятствуя репликации другими группами. Часто один представитель изображение выбрано, чтобы подчеркнуть заявление на сотовый позиции или совместной локализации в публикации, что делает его трудным для чтения, чтобы судить статистической значимости такого события.
Вместе с тем, что подробную информацию содержание данных изображения редко эксплуатируют это подчеркивает необходимость более объективной, быстрее и комплексный подход к анализу гистологических изображений.
Костный мозг комплекс тканей, которые берет на себя важных жизненных функций как орган кроветворения у взрослых позвоночных животных. Помимо того, что родина для гемопоэтических клеток 1,2 и играет важную роль в развитии В-лимфоцитов 3, он также выступает в качестве места, где иммунные реакции инициируются 4 и поддерживает Зрелые, рециркуляции В-клеток 5. Кроме того, его роль в поддержании Immunological памяти становятся все более ценится в последнее десятилетие, поскольку некоторые типы клеток, составляющих иммунной памяти были найдены проживать там 6-9.
Соотношение между комплексной ткани архитектуры костного мозга и его функций все еще остается неясным. В отличие от вторичных лимфоидных органов, которые организованы в макро-купе, таких как Т и В-клеточных зонах, костного мозга не хватает четкого макро-раздробленности. До сих пор различные отсеки в костном мозге определяются их близости к кости коры или в сосудистой. Важность различных групп населения резидентов стромальных клеток в костном мозге в течение ряда процессов, таких, как поддержка стволовых клеток, развитие В-клеток или поддержания популяциях клеток иммунной памяти (например, долгоживущие плазменные клетки (ПК), CD4 + и CD8 + Т-клетки памяти) четко указывает на то, что существует определенная степень микро-компартментализацией в костном мозге.
Это еще не ясно, в какой степени эти ниши имеют общие черты с точки зрения их клеточной и молекулярной Compositioп, и какие элементы оказывают определенную нишу уникальным. В дополнение к стромальных клеток, гемопоэтических типы клеток, как было показано, чтобы играть решающую роль в обеспечении определенные сигналы по меньшей мере, для некоторых из ниши. Очевидно, что сложность ниши состава требуется их анализ на месте, и это становится все более важным для иммунологов и гематологи, чтобы увеличить микроархитектуры костного мозга, например, путем анализа пространственных отношений между ее клеточных компонентов.
Здесь стратегия для количественной сотовой совместной локализации и окрестности отношения в костном мозге в автоматическом и непредвзято представлена. Подробное рабочий в том числе генерации химерных мышей, несущие флуоресцентные стромальных клеток и не-люминесцентные кроветворных клеток, подготовки гистологических срезов от undecalcified костей, приобретение конфокальных изображений, охватывающих всю кость, а также автоматизированного анализа изображений с сотовойо-локализация и его проверка / с дискриминацией со случайной позиционирования с помощью инструмента моделирования обеспечивается (рисунок 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были утверждены соответствующими государственными комитетами по благосостоянию животных (Landesamt für Gesundheit унд Soziales Берлин) и были выполнены в соответствии с действующими принципами и правилами (лицензия животное эксперимент G0194 / 11).
1. Генерация Люминесцентная костного мозга химерных мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: поколение люминесцентных костного мозга химерных мышей, чтобы визуализировать стромальных клеток костного мозга костей выполняется, как описано выше 9.
- Начните лечения Del-Cre х мышей ROSA-tdRFP (мышей, экспрессирующих тандем красный флуоресцентный белок (tdRFP) повсеместно 11-13), чтобы подготовить их для облучения. Кроме того, можно использовать любой другой штамм с вездесущей выражения флуоресцентного белка. Администрирование 1 мг / мл неомицина и 1 мг / мл витаминов (А, D3, Е, С) с питьевой водой два дня перед облучением.
- Облучают мышей дважды 3,8-серый с цезием-137 гамма-облучателя Wiтонкая интервал 3 ч. Для этого поместите мышей в облучения пирога клетке, подходящей для соответствующего излучателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: При облучении мышей, наш институт не требует анестезии. Соблюдайте местные институциональной политики в отношении обезболивания при облучении. Лечить животных с 5 мг / кг карпрофена подкожно (SC) в день после облучения, если есть признаки боли. - На следующий день, восстановить мышей путем внутривенной инъекции 3 × 10 6 клеток костного мозга, полученных из длинных костей мышей C57BL / 6 мышей-доноров в буфере передачи 9. Держите мышей на неомицин и витамины до 2 недель, и следить за их благополучие и вес в течение этого времени. Подождите, по крайней мере, 4 недели, чтобы для восстановления иммунной системы, прежде чем начать конкретные экспериментальные методы лечения (например, иммунизация) 9.
- Жертвоприношение мышей и разместить их на вскрытии борту, стерилизовать ноги с 70% этанола. Euthanizе мышей в соответствии с местными институциональной политики. Наш институт выполняет шейки дислокации.
- Используйте пинцет и ножницы, чтобы снять кожу с бедер. Удалить мышечной ткани, чтобы разоблачить бедренную кость. Luxate бедренной кости из тазобедренного и коленного сустава с помощью щипцов и ножниц. Будьте осторожны, чтобы не сломать или вырезать кость.
- Тщательно удалите остатки больших кусков мышечной ткани и хряща от кости с помощью ножниц. Удалить остатки мышечной ткани, протирая кость с лабораторией папиросной бумаги. Сбор очищенные кости в чашку Петри с фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
- Исправить целые бедренных костей в 4% параформальдегида (PFA, электронная микроскопия класса) в течение 4 - 6 ч.
- Отменить PFA и инкубировать кости в 10% сахарозы в PBS O / N. На следующий день, инкубировать кости в 20% сахарозы o / n. На следующий день после, инкубировать кости в 30% сахарозы O / N.
2. Cryosectioning Кости
Примечание: После 16 - 24 ч в 30% сахарозы, заморозить кости и cryosection их в соответствии с методом 14,15 ленты Kawamoto-х годов.
- Подготовьте большой стакан (2000 мл объема) с сухим льдом и ацетоном (примерно 2: 1 объему, например, 400 мл сухого льда и 200 мл ацетона) под вытяжкой. Нанесите небольшое стакан (150 - 250 мл объема) с гексаном внутри (30 - 50 мл приблизительно). Подождите смеси остыть (примерно 10 мин, пока иней на внешней стороне большой химический стакан, пока не появится).
- Заполните ¾ меченого cryomold с супер Cryoembedding среды (SCEM); Аккуратно положите кости внутри, пока они не будут полностью погружены, заботясь о том, чтобы они не касались края формы. При больших щипцов удерживать cryomold в стакан с нижней части пресс-формы только касалась поверхности гексана.
- Пусть внешние края SCEM замораживания (указывается непрозрачностью, это занимает около 15 сек). Затем полностью отказаться от плесени в гексане, и пусть это пожарнаяЭз за 1 - 2 мин. Выньте замороженную пробу и завернуть в целлофан, а затем алюминиевая фольга (для защиты образца от высыхания и, чтобы избежать попадания света). Хранить при -80 ° С до cryosectioning.
- Для cryosectioning бедренной кости с помощью стандартных микротомных и микротомных лезвия для твердых тканей.
- Установите температуру образца и лезвия микротома до -24 ° C. Пусть образец сидеть внутри микротоме течение примерно 15 мин перед разрезанием.
- Закрепите блок выборки к держателю образца металла с SCEM или оптимальная температура резания (ОКТ) среды. Регулировка ориентации блока, если это необходимо. Обрежьте образец, пока кости не полностью открыт и виден мозг. Отрегулируйте толщину профиля до 7 мкм (отбросить первый раздел).
- Закрепите кусок Kawamoto ленты клейкой стороной на верхней части блока выборок с помощью оленей кожаными деревянной лопаткой. Затем вырезать образец и превратить ленту таким образом, чтобы разделрасположенный на верхней стороне. Трансфер ленту предметное стекло с помощью щипцов. Закрепите ленту на предметное стекло скотчем.
- Пусть участки высохнуть в течение не менее 30 мин, и хранить их при температуре -80 ° С до использования. Храните неокрашенных и с неподключенными слайды в пластиковых коробок предметных стекол с прокладками между отдельными горками для того, чтобы избежать этого, они слипаются. Витражи и слайды можно хранить до недели в картонной папки слайд при 4 ° С.
Сборник 3. Изображение
- Оттепель и пятен криосрезы в соответствии с общими протоколами иммунофлюоресценции 9. Включите ядерной пятно, например, 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) для визуализации целостности тканей.
Примечание: пятна, например, для ППП, чтобы визуализировать стромальных клеток (анти-RFP-биотин антитела и стрептавидин-Alexa Fluor 555), пятен эозинофилы с крысиным анти-крупного основного белка (MBP) антителом и анти-крысиного-Alexa Fluor 647 антитела В-клетки,с крыс анти-В220-Alexa Fluor 594 антитела и ПК с анти-κ-легкой цепи флуоресцеина-изо-тиоцианат (FITC) и анти-λ1 легкой цепи-FITC антител (Подробности процедуры окрашивания описаны в 9). - Установите окрашенные срезы: положить одну каплю fluoromount на участке, а затем накройте # 1 стеклянной крышкой скольжения, в то время как тщательно избегая образования воздушных пузырьков. Впоследствии, выполните лазерного сканирования конфокальной микроскопии с помощью инструмента, оснащенного лазерных линий, подходящих для окрашивания.
- Для того, чтобы записывать изображения для автоматического анализа совместной локализации костного мозга гемопоэтических клеток с стромальных клеток с помощью инструмента Wimasis, применяются следующие настройки:
- Используйте 20X объектив и поле зрения 708,15 х 708,15 мкм. Для автоматизированного анализа, сохранить размер всех изображений в соответствии с 2048 х 2048 пикселя (ПВ), чтобы сохранить результаты сопоставимы.
- Запишите один канал для стромальных структур (например, (например, DAPI, 405 нм) и дополнительные каналы для гемопоэтических клеток, представляющих интерес (например, 3 канала, 488/594/633 нм для эозинофилов, В-клетки и ПК).
- Запись изображений с помощью линии в среднем 4 16. В идеале, охватывают весь бедренной раздел по однократных соседних изображений. Кроме того, принимают без соседними кадрами из различных регионов костного мозга (диафизарной а также эпифиза).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не производить дублирование между соседними изображениями (во избежание повторного анализа клеток в пересекающихся областях).
- Сохранение изображений в формате файла изображения микроскопии. Проверьте и, при необходимости, отрегулировать контрастность для всех каналов в программном обеспечении просмотра изображений / анализа.
- Экспорт 3 .jpg файлов в файле изображении: один .jpg файл для канала DAPI (формат красный / зеленый / синий (RGB), ложные цвета кодируются в желтый), один .jpg файл для стромы канал (градаций серого) и один .jpg Файл, содержащийканалы для гемопоэтических клеток (максимум 3 канала, формат RGB, например, FITC (ПК, ложные цвета: зеленый) / Alexa Fluor 594 (В-клетки, ложные цвета: синий) / Alexa Fluor 647 (эозинофилы, ложные цвета: красный)) ,
4. Автоматизированный анализ изображения
- Используйте инструмент для анализа изображения для выполнения сегментации изображения, количественное совместной локализации и анализа окрестности (см обсуждения).
- При использовании инструменты Wimasis, выполните следующие действия:
- Загрузить наборы 3 .jpg файлов в изображение с таким же именем файла, за которым следует подчеркнуть и цифрой, указывающей тип изображения.
- Используйте _1 файла .jpg с кроветворных клеток, _2 файла .jpg для канала DAPI, _3 для файла .jpg для стромы канала. Например: Image1_1.jpg (гемопоэтические клетки), Image1_2.jpg (DAPI канал), и Image1_3.jpg (стромы канал). Загрузите изображения с помощью учетной записи клиента.
- Для клеток контактной количественноговыбрать сотовый контактную инструмент, нажав на соответствующее поле. Для клеток окрестности количественного выберите инструмент клеток окрестности и введите предпочитаемый радиус окрестности в мкм (который измеряется от края ячейки ").
- Скачать результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты представлены как файлов .jpg, показывая кроветворных клеток и стромы канал с границами обнаруженных объектов выделена, а также отдельных .csv файлов, содержащих измерения для каждого изображения, в дополнение к резюме .csv файл, который содержит данные для всех загруженных изображений.
- От контакта измерений определить частоту гемопоэтических клеток (красный, зеленый или синий клеток) в контакте с стромальных клеток, или частот красного, зеленого или синего клеток, контактирующих с другой кроветворных типов клеток (пример показан в представительных результатов , рисунок 4). Для того чтобы определить частоты, делить данного контакта импульсов в изображении,Общая подсчитанных клеток на изображении.
- Для экспериментов с отдельными мышей, подвести полный контакт подсчет всех изображений для отдельных мышей и разделить их по сумме общего количество клеток всех снимков.
- Из измерений округе, определить частоту красного, зеленого или синего клеток в выбранном расстоянии от стромальных клеток и / или частоты красного, зеленого или синего клеток в предпочтительном близости к другим типам кроветворных клеток, как описано выше в стадии (4,3 смотри также Представитель Результаты, рисунок 4).
5. Моделирование случайных костного мозга позиционирования
- Перед выполнением моделирования позиционирования случайной клеток на анализируемом костного мозга гистологических изображений, подготовить следующие файлы в заранее: отдельные CSV-файлы, предоставляемые сотового контактной инструмента, оригинальные файлы .jpg для канала DAPI и оригинальные файлы .jpg для стромы канала.
- Для того чтобы выполнитьпакетные моделирование на серии изображений (например, все изображения с одной бедренной секции), собрать все исходные файлы .jpg (_1, _2 и _3) и соответствующие отдельные CSV-файлы в одной папке.
ПРИМЕЧАНИЕ: инструмент моделирования для позиционирования клеток случайным костного мозга может быть предоставлена по запросу. - Запустите программу моделирования, установите флажок "данных изображения Auto-Load".
ПРИМЕЧАНИЕ: программа будет читать количества клеток, а средний размер клеток из файла .csv автоматически. Эти значения отображаются в коробках "по номеру сотового" и "размер ячейки AVG" (рис 5А). - Введите общий тег для CSV-файлов, то есть общий фактор в их именах. Введите число наборов изображений, которые должны быть использованы для моделирования в пакетном режиме.
- Загрузите файл .jpg, полученные от стромы канал (имя файла оканчивающееся _3).
- Введите параметры для генерации маски из канала DAPI:
- Установите флажок "? Нанесите маску "Установите порог для преобразования изображения DAPI в двоичной маски 10 (диапазон 0 - 255).
- Установите флажок "8-бит?" Флажок "Разбавить?" И установите класс расширения до 5 пикселей. Установите флажок "W / эрозии?".
- Введите желаемое значение радиуса окрестности (радиуса окрестности), используемого для анализа смоделированных изображений. Для картинки 708,15 х 708,15 мкм с размером 2048 х 2048 точек (пикселей масштабирования ху: 0,346 мкм), 29 точек соответствуют 10 мкм.
- Отметьте "Использовать Оцу?", Чтобы использовать алгоритм Оцу в 17 для автоматического обнаружения стромальных структур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это тот же алгоритм, который используется контактной и окрестности инструмента. Используя тот же алгоритм сегментации изображения в автоматизированного анализа записанного изображения и моделируемой изображения имеет решающее значение для того, чтобы сохранить данные сопоставимы. - Введите параметры для гемопоэтических клеток, которые Arе моделируется как круглых форм.
ПРИМЕЧАНИЕ: число клеток красного, зеленого и синего клеток непосредственно загружаются из файла .csv (см также шаг 5,6).- Используйте инструмент моделирования для расчета среднего диаметра в РХ красных, зеленых и синих клеток. Определить среднюю площадь одной ячейки в качестве общей площади каждого типа клеток в изображении в пикселей, деленное на общее число клеток на изображении. Используйте среднюю площадь для расчета радиуса диска с помощью формулы. Двойной радиус, чтобы определить средний диаметр.
- Измерьте распределение пор по размеру анализируемых типов клеток с любым программным обеспечением для анализа изображений, который включает в себя функции объекта сегментации. Определить σ для всех гемопоэтических типах клеток (18 и рис 5B).
Примечание: Поскольку распределение по размерам клеток записанных клеток определяется не автоматизированного анализа изображений, использовать распределение Гаусса в качестве аппроксимации реальных распределений. Ширина тОн кривая распределения описывается σ и могут быть совершенно разными в различных типах клеток. (Для получения дополнительной информации см рис 5B).- Из этих измерений, определяют "размер ячейки среза": диаметр в PX, который описывает наименьший объект по-прежнему признается в качестве полного клетки с помощью инструмента анализа изображений.
- Введите параметры в соответствующих полях на графическом пользовательском интерфейсе (рис 5А).
- Введите размер ячейки отрезать, то есть минимальный размер ячейки позволило при моделировании, как диаметр в пикселей.
- Введите σ в PX для моделирования распределения по размерам клеток для красного, зеленого и синего клеток (из шага 5.9).
- Установите флажок "Удалить" в подразделе "Ячейки в маске". С помощью этой установки, программа выберет новую позицию для ячейки, перекрывает ли он, по крайней мере на один пиксель с запретной зоной маски. Установите флажок "Избегайте клеток перекрытия? ̶1; В подразделе "Cell исключения".
- Введите допустимое минимальное расстояние между центрами двух клеток в пикселей.
ПРИМЕЧАНИЕ: минимальное расстояние должно быть определено из записанных изображений. Неправильно измеренные минимальные расстояния приведет к необъективным / искусственные результатов для сравнения записанных и смоделированные изображения. - Установите максимальную площадь перекрытия до 100%, если перекрытие определяется минимальным расстоянием от центра до центра.
- Установите инструмент моделирования для 1000 повторений.
- Установите флажок "Авто клетки?", Чтобы сохранить координаты моделируемых объектов для всех повторений каждого образа партии как .rect файлов (текстовый формат). Установите флажок "Авто изображения?", Чтобы сохранить файл .tiff для каждого моделируемого изображения. Введите общий тег для сохраненных файлов.
ПРИМЕЧАНИЕ: "? Автосохранения клетки" опция снижает моделирования рабочего времени и общий размер данных, по сравнению с тем, когда сохранения текущего имитации ИмаГЭС. В .rect файлы сохранить координаты моделируемых клеток, прямоугольников, и, если это необходимо, таким образом, могут быть преобразованы в моделируемых изображений.
- Запустите моделирование, щелкнув на "Run моделирования".
ПРИМЕЧАНИЕ: инструмент моделирования автоматически генерирует файл .csv для 1000 моделирования каждого изображения, в том числе средних контактных пунктам и окрестности пунктам для красного, зеленого и синего клеток с красными, зелеными, синими и стромальных клеток для каждого набора повторяющихся моделирования , Кроме того, для всех этих значений, средние значения 1000 моделирования со стандартным отклонением (STD) и стандартной ошибки среднего (SEM) предоставляются. - Определить среднее контактное частоты и окрестности частоты одного набора 1000 смоделированных изображений. Для этого разделите среднюю контакт и окрестности рассчитывает на записанном количества клеток каждого изображения. Сравните частоты результатам автоматизированного анализа совместной локализации записанного изображения.
- Применение надлежащих Статиstical методы в зависимости от анализа 19 (для рис 7, мы использовали двусторонний Уилкоксона тест ранга).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Режущие криосрезах из undecalcified кости методом ленточного Kawamoto позволяет весь костный быть сокращены в интактной части, при этом костного мозга эндостальной области все еще прикреплен к минерализованной костной ткани, как в диафизе, а также в районах с эпифизарными их Высокая плотность губчатой кости (фиг.1). Ядерный окрашивание участков показывает, что, хотя небольшие трещины в подготовке не может быть полностью избежать, структура синусоид и артерий, а также ретикулярная сеть паренхимы остается неповрежденным.
В качестве примера иммунофлуоресценции окрашивания красным флуоресцентным химерного костного мозга и его последующего анализа, окрашивание эозинофилов (главным основным белком, МВР), ПК (κ и λ легких цепей) и В-клетки (B220) показан. Мышей иммунизировали 100 мкг 4-гидрокси-3-nitrophenylacetyl гаптена, соединенный с курицей γ-глобулина (NP-CGG) в квасцы IP, через 4 недели послевосстановление, повысили с 50 мкг NP-CGG в PBS IV 21 дней и анализировали на 30 день после подъема. Автоматизированный анализ изображений привело к очень точного определения стромальных структур, в том числе и очень небольшие фрагменты ретикулярных процессов. Поскольку число клеток стромальных клеток не может быть определена с помощью системы, представленной здесь (смотри также обсуждение), не пороговый размер не был введен в стромальных канала, для того, чтобы обнаружить все фрагменты в изображение (рисунок 2). ПК и эозинофилов больше, чем В-клеток, а также показать более гетерогенную форму. Все три типа клеток были хорошо известны на первый взгляд. Сотовые кластеры, особенно В-клеток, были хорошо разделены. Средство анализа оптимизирована для вышеуказанных типов клеток (эозинофилы, ПК, В-клетки). Для других типов клеток, корректировки могут быть необходимы. В .csv файлы, созданные с помощью клеточного контакта инструмента содержит следующие соответствующие измерения для гемопоэтических клеток:Количество клеток для каждой клеточной популяции; Общая площадь для каждой ячейки населения в PX; Связаться с Количество эритроцитов (в данном случае эозинофилов), зеленые клетки (здесь ПК) или синие клетки (здесь B-клетки) с красными, зелеными, синими или серыми клетками (клетками стромы). В .csv файлы, созданные с помощью инструмента клеток окрестности содержать следующие измерения для гемопоэтических клеток: количество клеток для каждой ячейки населения; Общая площадь для каждой ячейки населения в PX; окрестности количество красного, зеленого и синего клеток с красными, зелеными, синими и серыми клетками (клетками стромы).
Для того чтобы проверить качество инструментов для анализа изображений, результаты автоматизированного анализа были по сравнению с ручным подсчетом по 6 обученных оценщиков (рисунок 3). Все оценщики получили идентичные изображения для анализа. Стромальные структуры и гемопоэтические клетки осторожно очерчены инструмент для анализа изображений, и эти регионы, представляющие интерес, сохраняются и анализируются. Для стромальных структур, общая площадь каждого изображениябыл сравнивали между автоматической и ручной анализ. Стромальные структуры, казалось бы трудно обученные оценщики признать точно, как это отражено в большой дисперсии, наблюдаемой для размера общей площади стромы рассчитывали вручную (фиг.3А). Здесь автоматизированный анализ определил величину, близкую к средней площади, определенной обученных оценщиков. Для всех клеток, автоматизированный инструмент анализа установлено, немного меньшее количество клеток, чем рассчитывали вручную. Тем не менее, для персональных компьютеров и эозинофилов, количество все еще находится в диапазоне от Interrater дисперсии, наблюдаемой для ручного подсчета. Число В-клеток, обнаруженных с помощью автоматизированного анализа, однако, был немного ниже этого диапазона (фиг.3А). Средний размер клеток (область, в ПВ), как определено с помощью автоматизированного анализа было 512 точек для ПК, 436 точек на эозинофилы и 317 точек на В-клетках, в то время как подготовленные оценщики определяют размер 515 пикселей для ПК, 464 пикселей для эозинофилов, и 291 точек на В-клетках. Таким образом, в среднем сРазмер локоть для В-клеток, ПК, и эозинофилов, определенных с помощью автоматизированного анализа было сравнимо с средних размеров клеток, определенных ручных оценщиков (фиг.3В). Это автоматизированный инструмент для анализа изображений теперь могут быть использованы для количественной оценки прямых контактов кандидат костного мозга типов ниша клеток. Кроме того, частота клеток определенного типа клеток соседних стромальных клеток или других типов кроветворных клеток может быть определена. Анализ ПК костного мозга и их контактов с стромальных клеток, эозинофилов, В-клетки и другие компьютеры показано, а также частота ПК соседних этих типов клеток в пределах 10 и 20 мкм (фиг.4А). Кроме того, контактные частоты различных гемопоэтических клеточных типов с стромы может быть количественно (Фиг.4В).
Перед выполнением моделирования случайных позиционирования костного мозга этих клеток с помощью инструмента моделирования, параметры, описывающие распределение пор по размеру, как GausСиан распределение должны быть определены. Для гауссова распределения, который может быть представлен в виде симметричного и "колоколообразной кривой", только два параметра должны быть определены: расположение центра кривой (в режиме, т.е., где пик на кривой находится ), и ширина симметричной кривой (это описывается в вышеупомянутой параметра σ). Эта процедура показана здесь для персональных компьютеров, эозинофилов и В-клеток (Фиг.5В). Измеренные распределения размеров клеток показывают, что для В-клеток, ширина кривой распределения, описанной σ меньше, чем для ПК и эозинофилов. Для моделирования, относительные значения σ, измеренной для трех клеточных популяций поддерживали (т.е., В-клетки были всегда моделируется в два раза узким распределением по размерам, чем у ПК 'и' эозинофилов), в то время как значения σ, определенные в пикселей были чтобы он совпадал внешний вид записанных клеток (рис6B). Это привело нас к применять σ из 2 пикселей для В-клеток и σ 4 пикселей для ПК, так и эозинофилов. Размер ячейки среза определяется из измеренных распределений размеров клеток. Для ПК и эозинофилов, обрезанием на 300 точек Размер объекта, в результате чего диаметром 20 рх для круглого объекта (около 7 мкм) и В-клеток отсечки на 220 пикселей, что приводит к диаметром 17 рх (около 6 мкм) был использован для моделирования.
Для того, чтобы определить области, в моделируемой случайной изображения, где клетки позволили быть размещены инструмент моделирования, маска, полученные от ядерного сигнала в канале DAPI из костного мозга гистологического изображения (рис 6а). Значение 10 было установлено, что оптимальный порог интенсивности для генерации бинарных изображений (верхняя панель, правое изображение). Порог определяется по алгоритму Оцу не ведет к полному признанию всех ядер в изображения (верхней панели, центр изображения), аналогично фиксированной интенсивностипороги 50 или 150 (нижняя панель, слева и в центре изображения) .Отель актуальность контактов ПК, эозинофилов, или В-клеток с стромальных клеток (рис 4б) была проверена с помощью инструмента моделирования (рисунок 7). Этот анализ показал, значительно более высокие контактные ставок в записанных изображений по сравнению с моделирования для ПК и В-клеток (рис 7а), в соответствии с концепцией стромальных ниш, поддерживающих эти группы населения. Это было подтверждено в 5 отдельных флуоресцентных химерных мышей (фиг.7В, D). В отличие от этого, не ясно, разница не была определена в случае эозинофилов (7А, С).
Рисунок 1. Обзор флуоресценции изображение продольного разреза мышиного бедра cryosectioned методом ленты Kawamoto в. Метод лента позволяет разрезалг участки с неповрежденной эндостальной регионе, как в ДИАФИЗАРНЫХ а также в области эпифиза, от undecalcified кости. Толщиной кости раздел наивной C57BL / 6 мыши 7 мкм окрашивали для белок внеклеточного матрикса, ламинин (красный), для SCA-1 визуализировать артериол (зеленый) и для ядер (синий, DAPI). 47 плитки 1446 х 1088 мкм, разрешение 1360 х 1024 точек были записаны и сшитые для создания общее изображение. Это снимок был получен на флуоресцентного микроскопа широкого поля, с 10-кратным объективом (0,45 NA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. автоматическое обнаружение стромальных и гемопоэтических клеток костного мозга. Раздел бедренной кости с красным флуоресцентным читопом мыши на 30 день после повышения окрашивали для RFP (серый) для визуализации стромы, MBP (красный, эозинофилы), κ и λ легкую цепь (зеленый, ПК) и B220 (голубой, В-клетки). Слева: Оригинальное изображение получали на конфокальной микроскопии, используя 20X объектива (0,8 NA) и поле зрения 708,15 х 708,15 мкм. Справа: сегментированные изображения. Очертания распознанных объектов будут выделены. Белые прямоугольники отметить область отображается в нижней части изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Проверка автоматического анализа изображений обученными оценщиками. () Общая площадь стромальных структур и общего числа клеток кроветворных клеток, подсчитанных обученным рейтинговых агентств в одном (стромальных структур), 10 (ПК), два (эозинофилы) и одно изображение (В-клетки) по сравнению с числа клеток, полученных с помощью автоматизированного анализа изображений. Точки представляют отдельные оценщиков (п = 5 - 6). Полоски показывают средние значения или значения, определенные автоматически. (В) объекта распределение по размерам вручную подсчитанных объектов по сравнению со средним размером объекта определяется путем автоматизированного анализа. Для учета различных частот в различных типах клеток, ПК подсчитывали в 10, эозинофилы в двух и В-клеток в одном изображении. Точки представляют отдельные объекты. Линии показывают среднее. (C) Руководство Излагая стромальных структур обученным рейтинговых агентств. Слева: исходное изображение. Средний: примеры вручную анализируемых изображений. Справа:. Стромальные структуры, обнаруженные автоматизированного анализа Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
"Рисунок 4" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" ширина = "700" />
Рисунок 4. Автоматический анализ совместной локализации ПК, эозинофилов, В-клеток и стромальных клеток в костном мозге бедра. (А) Слева: Частота ПК в непосредственном контакте с стромальных структур, эозинофилов, В-клеток или других компьютеров в флуоресцентном химерного мышей на 30 день после подъема. Средняя и правая: Частота ПК в 10 мкм вблизи или 20 мкм вблизи стромальных структур, эозинофилов, В-клеток или других ПК. Части этой фигуре (непосредственном контакте, 10 мкм окрестности) модифицируются с Zehentmeier др. 9 (В) Частота ПК, эозинофилов и В-клеток в непосредственном контакте с стромальных структур. 52-515 ПК, 918-3179 эозинофилов, 4146-13063 B клетки в 10-21 изображений были подсчитаны из 5 флуоресцентных химерных мышей на 30 день после повышения, объединяли от двух независимых экспериментов. Точки представляют отдельные мышей. Линии указывают медиану.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Определение распределения по размерам клеток ПК костного мозга, эозинофилов и В-клеток. () Скриншот графического интерфейса пользователя (GUI) инструмента моделирования. (B) Распределение размера ячейки (область, в ПВ) ПК (κ и λ легких цепей, зеленый), эозинофилы (МВР, красный) и В-клетки (В220, синий) показана на гистограммах, как измерено после распознавания объектов с помощью программного обеспечения Volocity (верхняя панель). В бедренной изображений костного мозга (нижняя панель), обнаружены ПК отмечены красным цветом (наложение желтый), эозинофилы в голубом (наложения фиолетовый) и В-клетки в желтый (накладывать серый). Сегментация изображения была выполнена путем установления минимального размера порог 180 пикселей для ПК,300 точек на эозинофилы и 220 точек на В-клетках. 250 объектов были измерены для ПК, 650 объектов для эозинофилов и 3000 объектов для В-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Формирование маски для моделирования позиционирования случайной клеток. () Исходный канал DAPI (желтый), а также накладки из DAPI с бинарных изображений, полученных с применением различных пороговых значений показаны. Маска генерируется из бинарного изображения (порог устанавливается в 10) отображается ниже (нижней панели, на рисунке справа). Черные области представляют собой не что запретные зоны, белые области представляют собой области, где клетки запрещенных к помещению. (B) на записанное изображение (слева) и соответствующего имитационного изображение (справа) показать визуальнаяСходство. Эозинофилы (МВР), ПК (κ и λlight цепи), В-клетки (B220) и стромальных клеток (RFP) отображаются на дисплее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Прямой контакт гемопоэтических типах клеток с стромальных структур в записанных против имитации изображений. (А) Частота ПК, эозинофилов и В-клеток в непосредственном контакте с стромы в смоделированы по сравнению с записанных изображений флуоресцентного химерного мышей на 30 день после подъема. Линии соединяют соответствующего имитационного и записанные изображения (точек). Изображения из одного представителя мыши приведены в каждом участке. (B) Частоты ПК, эозинофилов и В-клеток в непосредственном контакте с стромы в смоделированы по сравнению с записанных изображений 5 отдельных мышей из двух независимых экспериментов. Уилкоксона тест звание, двумя хвостами (шт: *** р = 0,0001; * р = 0,0371; * р = 0,0161; ** Р = 0,0012; **** P <0,0001; эозинофилы: *** р = 0,0007 ; р = 0,1055; * р = 0,0161, р = 0,4143; *** р = 0,0007; В-клетки: **** р <0,0001; ** р = 0,0020; *** р = 0,0005; ** р = 0,0012 ; **** р <0,0001). Точки представляют отдельные изображения. Бары указывают среднее. Значения Р 0,05 считаются существенные различия. Звездочки в рисунках указывают следующие значения P: NS: P> 0,05; *: Р 0,05; **: P 0,01; ***: Р 0,001; ****: P 0.0001. Части этой фигуры (прямой контакт ПК с стромальных структур) изменяются от Zehentmeier и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
700 "/>
. Рисунок 8. Полный рабочий подхода количественного для кроветворной клетки - стромальных клеток взаимодействия в костном мозге мышей подход состоит из трех основных частей: 1. участки мышиного костного мозга получают исходные данные и собирают лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, 2 . автоматизированный анализ записанных изображений и моделирования случайных позиционирования клеток костного мозга производится, 3. контактную информацию и окрестности рассчитывает, полученные из записанных и смоделированных изображений сравнению. Вход (файлы изображений) и выходных (текстовый файл) автоматизированного анализа выделяется синим цветом, вход (файлы изображений) и выходных (текстовые файлы и, необязательно, файлы изображений) средств моделирования, обозначается зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на прогресс в современных оптических методов визуализации, анализа гистологических данных по-прежнему часто затруднено из-за отсутствия надлежащих инструментов количественного и методов, или предвзятых анализов, которые сосредоточены на небольшом участке. Синергетический подход, представленный здесь сочетает в себе анализ изображения, охватывающую весь регион костного мозга, автоматизированной сегментации и распознавания объектов различных кроветворных и стромальных клеточных типов, анализ совместной локализации и, наконец, средство проверки на неслучайным, происходящих контактов, предусмотренных новой нестандартной разработанное программное обеспечение моделирования.
Гистологическое исследование целых костей, включая костный мозг было трудно выполнить из-за различных плотностей тканей, присутствующих в одной секции - с одной стороны, очень трудно, минерализованной костной ткани, с другой стороны, чрезвычайно хрупки мозга, который получает легко нарушена при разрезании вместе с костью. В качестве альтернативы, способ лента для резки секций кости Presподарил здесь 14,15 имеет то преимущество, что стабилизирует ткани, тем самым оставляя области эндостальные нетронутыми (рис 1). Кроме того, чтобы быть богатым в остеобласты, эти области были предложены, чтобы играть роль в поддержании 20 стволовой клетки.
Решающая роль стромальных клеток в процессах развития и клеточного содержания в костном мозге становится все более очевидным. Тем не менее, анализ этих редких, уязвимых клеток оказалось очень сложно по двум причинам: во-первых, их трудно выделить из костного мозга; Во-вторых, степень неоднородности среди населения стромы не известно, и, следовательно, можно пропустить важную население с помощью определенных маркеров, которые были описаны для стромальных клеток. Способ для генерации флуоресцентных химеры костного мозга полезно флуоресцентно меткой, а затем анализировать костного мозга популяции стромальных клеток в целом. Тем не менее, следует отметить, что в этих миCE все мезенхимальные клетки костного мозга визуализируются, в том числе эндотелиальных клеток и остеобластов. Это должно быть принято во внимание, если данные из таких химерных мышей анализируют. Несмотря на то, существует также риск гемопоэтических клеток реципиента происхождения выживших облучение, эти клетки обычно покрывают только очень маленькую область за полем зрения по сравнению с донорской CD45 + клеток, таким образом, не влияя на гистологический анализ 9. Очевидно, что этот метод должен быть объединены в последующей стадии с более специфической детекции стромальных (суб) популяций. В настоящее время анализ этих клеток, в основном, осуществляется за счет гистологии причинам, указанным выше, наложение ограничения на число параметров, которые могут быть проанализированы в то же время. Создание многоуровневой параметра анализа в микроскопии поможет преодолеть эти ограничения.
При анализе изображения, сегментация была выполнена с использованием оригинального алгоритма Otsu в. По существуЭтот кластер на основе метода порога автоматически определяет порог интенсивности для оптимального разделения переднего плана (сигнала) и фона (шума) пикселей в двух группах с низкой статистической расходимости в данном канале, в результате чего бинарного изображения 17. Здесь Метод Оцу наносили на натуральный логарифм версии из исходного изображения, а именно:
Входное изображение для Оцу = LN (Входное изображение)
Это работает лучше для флуоресцентных изображений с Метод Оцу может идентифицировать тусклые клетки в качестве фона. Добавление логарифмической функции позволяет лучше разделения клеток и фона в двух разных классов по алгоритму Оцу в. Тем не менее, интенсивность порога сама по себе не достаточно, чтобы точно выявить отдельные объекты. Она работает эффективно при обнаружении хорошо разделенные объекты в изображениях, но не достаточно, чтобы отдельных одиночных клеток, расположенных в кластерах. Поскольку некоторые из типов клеток, чтобыли для нас интерес, например, эозинофилов или В-клеток, часто группируются вместе в ткани, их ядра в канале DAPI были сегментированы с использованием алгоритма, основанного на K-Means кластеризации гистограммы интенсивности с К = 10 21. Алгоритм клеток сегментация будет строить яркая на тусклые пикселей (сосредоточены в 10 ячеек) и постоянно искать для формирования клеточных напоминающее объектов. Эти объекты затем будут определены как клетки. Когда все пиксели были использованы, в результате ядра расширены, чтобы генерировать маски, которая затем применяется к другим каналам для разделения кластера.
Следует отметить, что этот анализ хорошо работает для гемопоэтических клеток, которые компактны, но она ограничена по отношению к стромальных клеток, так как это не возможно, чтобы определить границы этих больших, разложенном клеток из-за их взаимосвязи дендритные расширений, которые образуют сеть ретикулярной. Таким образом, количества клеток на стромальных клетокне может быть обеспечена. Маркировка отдельных клеток через рок-картографических журналистами под контролем стромы конкретных промоутеров будет решить эту проблему, в соответствии с тем, что было опубликовано на нейронах (с помощью "Brainbow" системы 22) и для маркировки фолликулярных дендритных клеток в лимфатических узлах 23.
В дополнение к применению на шаг уменьшения шума для всех каналов, за исключением объектов ниже 30 пикселей, гель был применен в процессе распознавания объектов для кроветворной но не стромальных клеток. Небольшие фрагменты клеток, нарезаемых срезов могут быть исключены; Однако, потерями можно пренебречь в данном случае в пользу однозначного признания клеток. Продление анализа и моделирования с 2:58 размеров будет преодолеть это ограничение. Разработка методов для изучения клеточного распределение в тотальных, например, с несколькими фотонов микроскопии или светло-листа микроскопии / SPIM, безусловно, поможет в гоэто уважение. С целью изучения сложного клеточного состава многокомпонентных ниши, то также стало необходимым, чтобы расширить число параметров, которые анализируются на месте. Перспективные подходы к многопараметрической анализа гистологических информации в сочетании с цитометрии количественного недавно были опубликованы 24, 25.
Контакт анализ проводили с помощью количественной перекрытие двух объектов. Непосредственный контакт был определен как перекрытия, по меньшей мере один пиксель. Важно отметить, что этот анализ ограничивается разрешением микроскопии изображений и, следовательно, зависит от длины волны и способа возбуждения, а также от числовой апертуры линзы объектива, используемого в микроскопе, и обскура размера. При анализе показано здесь, цель 0,8 NA, 20X с флуорохромом комбинаций волнует 488, 561, 594, и 633 нм с использованием одного возбуждающего кванта была применена. Таким образом, латеральное разрешение значения междуБыли достигнуты 0,372 и 0,483 мкм. Это позволяет утверждения должны быть сделаны о сопоставлении различных клеточных подмножеств; Однако, это не дает никакой информации о предполагаемых молекулярных механизмов, участвующих в межклеточных взаимодействий. Кроме того, другие методы, такие как 2-фотонной прижизненной микроскопии необходимы для улучшения характеристику этих межклеточных контактов 9. Ферстер-резонансного переноса энергии (FRET) систем на основе может помочь подтвердить, если эти взаимодействия действительно функционирует 26.
Для того чтобы оценить клеточный микроокружение тканей ниши, это не только важно для анализа прямых клеточных контактов, но также и для количественного определения типов клеток в окрестности определенного типа клеток, представляющих интерес ("окрестности анализа"). Ранее опубликованных исследований измеренных расстояний между клеток и тканевых структур, таких как сосуды, основанных на месте ядра 27. Так как мы были заинтересованы в всего определитсячисле расстояние различных типов клеток, в части с различной соотношения ядерный цитоплазматической объема, мы предпочли, чтобы измерить расстояние между поверхностями. Для этого мы рассчитали радиус окрестности, определяя евклидова расстояния от cell's границе после преобразования значения из мкм до пикселей. Евклидово расстояние является расстояние по прямой линии между двумя пикселями и может быть описано формулой 28: 
Клетки с пикселями их границы, в пределах евклидовой расстоянии, например, 10 мкм от пикселей границ клетки-мишени были считаться соседней эту ячейку.
В нынешнем виде, анализ только определяет, является ли контакт или подошел другой ячейки того же или другого типа, таким образом, не обеспечивает только двоичный ДА / НЕТ характеристику клеток. Фактическое количество клеткис, которые контактируют с клеток, представляющих интерес или в пределах определенного радиуса от него не рассчитывается. Следующим шагом будет расширить текущий анализ таким образом, что размер группы в контакт или соседние клетки могут быть обнаружены и в сравнении между различными клетками-мишенями и того же типа. Это приведет к важной дополнительной информации о составе ниш костного мозга, такие как ниши выживания для плазменных клеток костного мозга, для которого различные вклад гемопоэтических вспомогательных клеток был обсуждаться 29-33.
Алгоритмы распознавания объектов были оптимизированы совместно со специалистами из Wimasis с использованием коммерчески доступного свои услуги собственное решение и доступны по запросу. Другой вариант заключается в использовании коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений, таких как Definiens, Volocity или Imaris или бесплатная, такие как CellProfiler.
Автоматизированные сегментации клеток и анализа изображений инструменты, которые мыповторно подтверждено путем сравнения их результатов с ручным анализируемых данных, предоставленных 6 обученных оценщиков изображения относительно двух параметров, а именно от размера объекта и количества клеток в различных клеточных популяций. Как показано на фигуре 3В, среднего размера объекта для гемопоэтических клеток (ПК, эозинофилов и В-клеток) была одинаковой обоих методов, с более высокой дисперсии для ручного определения размера для плазменных клеток и эозинофилов, вероятно, связано с их более неправильной формы, чем В-клеткам. Автоматическая детекция количества клеток дали немного более низкие значения, чем вручную, обнаруженных них. Следует отметить, что они были все еще в пределах ручных значений в случае эозинофилов и ПК, в то время как они были ниже этих значений в случае В-клеток, вероятно, связано с более высокой гетерогенности экспрессии B220, который был использован в качестве маркера Для В-клеток. B220, как известно, повышается в течение дифференциации В-клеток в костном мозге, и В-клетки с низким, а также высокий яntensity окрашивание на B220 можно наблюдать. В-клетки с низким сигналов B220 упал ниже прикладного порог, которые, возможно, привели к исключению из В-клеток ранних стадиях. Нижний порог автоматического обнаружения может решить эту проблему. Для стромальных клеток, которые трудно обнаружить из-за их менее компактной, более дендритных и растянутая морфологии, ручное определение привело к высокой дисперсии между отдельными респондентами. Интересно, что общая площадь стромы была равна общей площади определяется автоматически, указывая, что анализ хорошо подходит для компенсации отдельного смещения со стороны оценщиков. Взятые вместе, эти данные показывают, что автоматизированные результаты в целом представляют собой средние значения ручного анализа и хорошо подходят для уменьшения Interrater изменчивость в анализ.
Для того, чтобы различать случайное и неслучайное расположение клеток в структурных ограничений ткани, средство моделирования была разработана. Дурчисле моделирование, искусственный образ со случайно расположенными гемопоэтических клеток создается для каждого записывается костного мозга гистологического изображения. Во-первых, изображение стромы канал используется в исходном формате. Маска формируется из изображения DAPI, применяя порог фиксированную интенсивность основе, таким образом, преобразование изображения в двоичном формате; двоичный маска затем подвергается несколько шагов пикселя на основе расширения и эрозии. Маска определяет направления в области изображения, где моделируются ячейки могут быть размещены. Координаты центров моделируемых клеток обеспечивается равномерный генератор случайных чисел, границы которой, где определяется размером изображения. Информация о количестве клеток, а средний размер ячейки для каждой группы населения, определенном автоматизированного анализа изображений записанных изображений используются для определения моделируемых популяций гемопоэтических клеток. Предполагается, что диаметр моделируемой чейки, чтобы следовать одномерное гауссово распределение, из которого фактическаядиаметр ячейки выбирается случайным образом: диаметр затем модифицирован так, чтобы размер ячейки, предохранителями для минимально допустимый размер объекта вводятся. В случае имитация клеток будет расположена таким образом, что один или несколько пикселей перекрываться с непроходной зоне или будет в течение заданного расстояния от другого уже размещены ячейки (4 мкм от центра к центру, как это определено в записанными изображениями), Нью-случайных координат будет выбран в то время как диаметр остается неизменным. Это будет повторяться до тех пор, количество моделируемых клеток не равно числу клеток в записанном изображении.
Инструмент был основан на предположении, что кроветворные клетки можно расположить свободно в костном мозге, в то время как стромальные структуры действуют в качестве фиксированной матрицы в ткани. Инструмент был оптимизирован для ситуации в костном мозге, где паренхимы области пересекаются сложной системой синусоид. Похоже подход к моделированию недавно была издана Френетт и сотрудниками для того, чтобыанализировать позиционирование гемопоэтических стволовых клеток в отношении стромальных клеток и сосудистых структур, которые составляют около 30% от общего объема костного мозга бедренной кости 25. Для того чтобы исправить этот эффект, средство моделирования, представленные здесь, основаны на маске областей были клетки могут быть помещены. Это было достигнуто с помощью окрашивающим ядра изображение, в котором объекты, представляющие ядра были расширены с помощью 5-ступенчатой дилатации (рисунок 6) после бинаризации. Районы с низкой клеточной плотности, т.е. низкой плотности ядер, таких как кости и синусоиды, не будет способствовать маски и поэтому не стали запретные зоны. Для того, чтобы избежать искусственного сокращения этих запретные зоны по процедуре замедления, 5-ступенчатая эрозия была применена впоследствии, таким образом, возобновление большие площади исключения, при этом остается высокой плотности ядерной (и, следовательно "разрешено") области без изменений. Этот способ может быть легко адаптирован для других лимфоидных органах. В тех твопросы были этот способ может не работать (например, в районах, где клетки с высоким соотношением цитоплазма / ядра присутствуют), другие методы, такие как цитоплазматической маркировки могут быть использованы для создания маски.
Гемопоэтических клеток были смоделированы как круговые объектов, размер которых был определен с помощью Gaussian генератор случайных чисел, среднее из которых согласованы с вычисленным средним диаметром каждого типа клеток. Ширина распределения была основана на измерении распределения размеров клеток в записанных изображений, как это определено программным обеспечением для анализа изображений. Для того, чтобы принять во внимание, что небольшие клеточные фрагменты были исключены в автоматизированного анализа изображений, размер ячейки, предохранителями были введены как из измеренного распределения по размерам клеток для каждого типа клеток (рисунок 5).
Естественно, это хорошо работает для типов клеток, которые являются относительно однородными по их размеру и форме, но может привести к проблемам в случае клеток, чтоповторно весьма неоднородны по отношению к этим параметрам. Следует отметить, что этот анализ оптимизирован для основных типов гемопоэтических клеток в костном мозге (гранулоциты, гемопоэтические клетки-предшественники и лимфоцитов), которые имеют в общем, что они обладают регулярные, почти округлую форму. Тем не менее, этот метод не был проверен дендритных клеток или макрофагов, типов клеток с сильно неровной поверхностью клеток. Анализ такие клетки будут выдвигать новые требования к нашей автоматизированного анализа изображений, а также подхода моделирования, в том числе необходимость совершенствования клетки кластера алгоритмов разделения 24, а также подробная форма-анализа и моделирования не только разного размера, но и различной формы клеток. Альтернативой может быть подход к моделированию, который работает с точными формами как записано. Тем не менее, следует отметить, что этот метод значительно увеличит детерминированный поведение модельной системы.
Для моделируемой EXPEriments, были получены 1000 повторений моделирования для каждого снимка. Используя это много повторений будет уменьшить относительную погрешность, добавленных самого процесса моделирования до примерно 3%. А именно, если значения совместной локализации клетка-клетка вычисляются из моделирования, которые случайным образом, то сам процесс моделирования будет характеризоваться функцией Н -1/2 ошибок, где N есть число моделирования в измеренного изображения. Это вклад от самого процесса моделирования с накопленной погрешности измеренных значений совместной локализации. Таким образом, для N = 1000 способствовала ошибка 3,16%. Моделирование, показанные здесь, побежал за 20 до 60 минут в изображении на 1000 повторений когда только сохранения смоделированных изображения, как .rect файлов (простой текстовый формат), а не в виде действительных изображений в .jpeg или .tiff формате (также опцию в программном обеспечении ).
Взятые вместе, этот подход позволяет беспристрастно, с высокой пропускной способностью анализа гистологических изображенияс и обеспечивает генерацию статистически соответствующих данных. Это может быть полезно при сравнении клеточную локализацию в различных условиях. Кроме того, временная компонента может в будущем быть интегрированы в модельном подходе движений клеток костного мозга, а более подробные данные о подвижности различных типов клеток в костном мозге становится доступным. Этот метод может быть использован для имитации возмущения системы, такие как мобилизации клеток из костного мозга в кровоток, например, нейтрофилов в случае острого воспаления 34. Для дальнейшего выяснения функцию костного мозга, как место для хранения иммунных клеток памяти, Можно также представить его продления для моделирования конкуренции на факторы выживания. Кроме того, можно перекрестных помех между различными ниш могут быть рассмотрены, а также индукция ниши. Вместе это поможет понять физиологические изменения (например, триггеры для регенеративной поведения в стволовых клетках) в качестве WELL как патологических возмущениях системы в целом, например, в случае аутоиммунных расстройств, неоплазии, или острого воспаления. В рамках итеративного концепции эксперимента и моделирования, новые гипотезы могут быть получены на основе моделирования, который в свою очередь снова может быть проверена экспериментально, тем самым помогая для дальнейшего понимания функции и взаимодействие различных типов клеток в пределах от сложности ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Андреаса Радбрух за ценные обсуждения. Мы благодарны Сабине Gruczek, Патрик Thiemann и Мануэла Ohde за помощь по уходу за животными и Роберт Гюнтер для превосходного технической помощи. Мы благодарим наших квалифицированных рейтинговых агентств Лаура Эме, Jannike Байат-Sarmadi, Каролин Поллок, Катрин Рот, Флоренция паче и Катарина Рог для оценки образцов гистологии и Рэнди Линдквист для корректуры рукописи. Мы благодарим J. Н. Ли, Mayo Clinic, Скоттсдейл, Аризона, США для MBP-специфических антител.
Эта работа была поддержана DFG HA5354 / 4-1, Джими-базовую сеть DFG о предоставлении гранта для прижизненной микроскопии и TRR130 / TP17 и DFG ДЛЯ 2165 (HA5354 / 6-1) на AEHSZ при поддержке Международного Макса Планка Школа инфекционных болезней и иммунологии (IMPRS-IDI), Берлин.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al.
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E.
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
