Automatiserad Kvantifiering av hematopoetisk cell - stromacells- Interaktioner i Histologiska bilder från Undecalcified Bone

Abstract

Konfokalmikroskopi är metoden för analys av lokalisering av flera celltyper inom komplexa vävnader såsom benmärg. Dock är analysen och kvantifiering av cellulär lokalisering svårt, eftersom det i många fall är beroende av manuell räkning, vilket bär risken för att införa ett rater beroende fördomar och minska interbedömarreliabilitet. Dessutom är det ofta svårt att bedöma om samlokaliseringen mellan två celler resulterar från slumpmässig positionering, speciellt när celltyper skiljer sig starkt på frekvensen av deras förekomst. Här används en metod för objektiv kvantifiering av cellulär samlokalisering i benmärgen införts. Protokollet beskriver provberedning används för att erhålla histologiska sektioner av hela murina långa ben inklusive benmärgen, liksom färgningsprotokollet och förvärvet av högupplösta bilder. En analys arbetsflöde spänner från erkännandet av hematopoetiska och icke-Hemåtopoietic celltyper i 2-dimensionella (2D) benmärgs bilder till kvantifieringen av de direkta kontakterna mellan dessa celler presenteras. Detta omfattar även en stadsdel analys, för att få information om den cellulära mikromiljön som omger en viss celltyp. För att utvärdera huruvida co-lokalisering av två celltyper är det bara är resultatet av slumpmässig cellpositionering eller reflekterar förmånliga associationer mellan cellerna, ett simuleringsverktyg, som är lämpligt för att testa denna hypotes i fallet med hematopoetiska såväl som stromala celler, är användas. Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till benmärgen, och kan utvidgas till andra vävnader för att möjliggöra reproducerbar, kvantitativ analys av histologiska data.

Introduction

På grund av den senaste tidens snabba tekniska utvecklingen inom mikroskopi, inklusive optisk avbildning, har analysen av celler inom ramen för hela vävnaden blir allt mer tillgänglig för immunologer. Karakterisering av enskilda celler i suspension är en värdefull och nödvändig metod för att förstå cellulära och molekylära funktionen. Dock är avgörande för att förstå samspelet mellan olika celltyper som samverkar i komplexa processer såsom utveckling av immunsvar analysen av cellerna i deras (mikro) -anatomical miljö.

Även om det är relativt lätt för microscopists att få kvalitativ information från bilder, är det fortfarande en utmaning att kvantifiera dessa uppgifter, dels på grund av det faktum att analysmetoder inom detta område släpar efter jämfört med vad som är möjligt i bilden förvärvet. Många forskare fortfarande förlitar sig på tidsödande manuell cellräkning i deras histologi bilder,därmed införa en bias bland olika bedömare och hindrar replikering av andra grupper. Ofta är en representativ bild valt att betona ett uttalande om cellulär position eller samlokalisering i en publikation, vilket gör det svårt för läsaren att bedöma den statistiska relevansen av en sådan händelse.

Tillsammans med det faktum att hela innehållet i bild datainformation sällan utnyttjas, betonar detta behovet av en mer objektiv, snabbare och övergripande strategi för att analysera histologiska bilder.

Benmärgen är en komplex vävnad, som tar på viktiga vitala funktioner som organ för blodbildningen hos vuxna ryggradsdjur. Förutom att vara födelseplatsen för hematopoetiska celler ^1,2 och spela en viktig roll i B-lymfocyter utveckling ^3, fungerar den också som en plats där immunreaktioner initieras ⁴ och stöder mogna, recirkulerande B-celler ^5. Dessutom, dess roll i att upprätthålla immunological minne har blivit alltmer uppskattat under det senaste decenniet, eftersom flera typer av celler som utgör immunologiskt minne har funnit att vistas där ^6-9.

Förhållandet mellan den komplexa vävnadsarkitektur benmärgen och dess funktioner fortfarande svårfångade. Till skillnad från sekundära lymfoida organ, som anordnas i makro fack såsom T- och B-cellszoner, saknar benmärgen en tydlig makro uppdelning. Hittills distinkta fack i benmärg definieras av sin närhet till benet cortex eller kärl. Betydelsen av de olika inhemska stromal cellpopulationer i benmärgen för ett antal processer som stöder stamceller, utveckling av B-celler eller underhåll av immunminnescellpopulationer (såsom långlivade plasmaceller (PC), CD4 ⁺ och CD8 ⁺ minnes-T-celler) visar tydligt att det finns en viss grad av mikro-uppdelning i benmärgen.

10. Visualiseringen och karakterisering av stromaceller i benmärgen är svårt på grund av deras morfologiska funktioner med långa, tunna dendritiska förlängningar bildar ett nätverk i hela benmärgen, och bristen på lämpliga markörer för att diskriminera stromala subpopulationer.

Det är ännu inte klart i vilken utsträckning dessa nischer har gemensamma drag med avseende på deras cellulära och molekylära composition, och vilka faktorer gör en viss nisch unikt. Förutom stromaceller har hematopoetiska celltyper visat sig spela en avgörande roll genom att tillhandahålla vissa signaler åtminstone för en del av de nischer. Tydligt, komplexiteten i nisch sammansättningen kräver sin analys på plats, och det har blivit allt viktigare för immunologer och hematologer att zooma in på benmärgsmikroarkitektur, t.ex., genom att analysera de rumsliga relationer mellan dess cellulära komponenter.

Här, en strategi kvantifiera cellulära samlokalisering och grannskapsrelationer i benmärgen i ett automatiserat och opartiskt sätt presenteras. En detaljerad arbetsflöde med framtagning av chimera möss, hysande fluorescerande stromaceller och icke-fluorescerande hematopoetiska celler, beredning av histologiska snitt från undecalcified ben, förvärv av konfokala bilder som täcker hela benet, samt automatiserad bildanalys av cellulär co-lokalisering och validering / diskriminering från slumpmässig positionering av ett simuleringsverktyg tillhandahålls (Figur 8).

Protocol

De djurförsök godkändes av lämpliga statliga kommittéer för djurskydd (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) och genomfördes i enlighet med gällande riktlinjer och regler (djurförsök licens G0194 / 11).

1. Generering av fluorescerande benmärg Chimära möss

OBS: Alstring av fluorescerande benmärgs chimära möss för att visualisera benmärgsstromaceller utförs såsom beskrivits tidigare ^nio.

1. Börja behandla Del-Cre x ROSA-tdRFP möss (möss som uttrycker tandem röd fluorescerande protein (tdRFP) ubiquitously ^11-13) för att förbereda dem för bestrålning. Alternativt kan du använda någon annan stam med ubiquitous uttryck av fluorescerande protein. Administrera 1 mg / ml neomycin och 1 mg / ml av vitaminer (A, D3, E, C) via dricksvattnet två dagar före bestrålning.
2. Bestråla möss två gånger med 3,8 Gray med en Cesium-137 gamma-bestrå witunn ett intervall på tre timmar. För detta, placera möss i en strålnings paj bur lämplig för respektive bestrå.
   OBS: För bestrålning av möss, inte vårt institut kräver inte narkos. Följ lokala institutionella policy för anestesi för bestrålning. Behandla djur med 5 mg / kg av karprofen subkutant (sc) per dag efter bestrålningen om det finns tecken på smärta.
3. Nästa dag, rekonstruera möss genom en intravenös injektion av 3 x 10 ⁶ benmärgsceller framställda från långa ben från C57BL / 6 donatormöss i överföringsbuffert ^9. Håll mössen på Neomycin och vitaminer i upp till 2 veckor och övervaka deras välbefinnande och vikt under denna tid. Vänta minst 4 veckor för att möjliggöra för beredning av immunsystemet innan de specifika experimentella behandlingar (t.ex. immunisering) ^9.
4. Offer möss och placera dem på en dissektion ombord, sterilisera benen med 70% etanol. Euthanize möss i enlighet med lokala institutionella politik. Vår Institutet utför halsdislokation.
5. Använd pincett och sax för att ta bort huden från låren. Ta muskelvävnad att exponera lårbens benet. VRICKA lårbens ben från höften och knäled med pincett och sax. Var noga med att inte bryta eller skära benet.
6. Försiktigt bort återstående stora bitar av muskelvävnad och brosk från benet med sax. Avlägsna återstående muskelvävnad genom att gnugga benet med laboratorie mjukpapper. Samla de rengjorda ben i en petriskål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
7. Fix hela lårbens ben i 4% paraformaldehyd (PFA, elektronmikroskopi-grade) 4 - 6 timmar.
8. Kasta PFA och inkubera ben i 10% sackaros i PBS O / N. Nästa dag, inkubera benen i 20% sackaros O / N. Dagen efter, inkubera benen i 30% sackaros O / N.

2. cryosectioning of Bones

OBS: Efter 16-24 tim i 30% sackaros, frysa ben och kryosektion dem enligt Kawamoto s bandmetoden ^14,15.

1. Förbered en stor bägare (2000 ml volym) med torr is och aceton (omkring 2: 1 volymförhållande, t.ex., 400 ml torr is och 200 ml aceton) under en huv. Placera en liten bägare (150-250 ml volym) med hexan inne (30-50 ml ungefär). Vänta tills blandningen svalna (ca 10 minuter, tills frosten visas på utsidan av stor bägare).
2. Fyll ¾ av den märkta cryomold med Super Cryoembedding Medium (SCEM); försiktigt placera benen inne tills de är helt täckta, se till att de inte vidrör kanterna på formen. Med stora pincett håller cryomold i bägaren med botten av formen precis når ytan på hexan.
   1. Låt de yttre kanterna av den SCEM frysa (indikeras av opacitet, tar detta ca 15 sek). Sedan helt släppa formen i hexan och låt den freEZE 1 - 2 min. Ta ut det frysta provet och linda in i cellofan och sedan aluminiumfolie (för att skydda provet från att torka ut och för att undvika exponering för ljus). Förvara vid -80 ° C tills cryosectioning.
3. För cryosectioning av lårbens ben använder en standard Eggen och Eggen blad för hårda vävnader.
4. Ställ provet och bladtemperaturen av mikrotomen till -24 ° C. Låt provet sitta inne mikrotomen för ca 15 min innan du skär.
   1. Fäst provblocket till provmetallhållaren med SCEM eller optimal skärtemperatur (OCT) medium. Justera orienteringen av blocket om det är nödvändigt. Trimma provet tills benet är helt öppet och märgen är synlig. Justera snittjockleken till 7 pm (kasta den första delen).
   2. Fäst en bit Kawamoto band med den klibbiga sidan på toppen av provblocket med hjälp av en hjort läderklädd träspatel. Därefter skär provet och vrid tejpen så att den del ärplacerad på ovansidan. Överför bandet till ett objektglas med pincett. Fäst tejpen på objektglas med tejp.
5. Låt sektioner torka under minst 30 min och förvara dem vid -80 ° C tills användning. Förvara ofärgade och omonterade bilder i plastglidlådor med distanser mellan enstaka diabilder för att undvika att de håller ihop. Målat och monterade diabilder kan lagras i upp till en vecka i kartong glid mappar vid 4 ° C.

3. Bildsamling

1. Tina och fläck kryosnitt enligt gemensamma immunofluorescens protokoll ^9. Inkludera en nukleär färgning, t.ex., 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) för att visualisera vävnadsintegritet.
   OBS: Stain, exempelvis för RFP att visualisera stromaceller (anti-RFP-biotin antikropp och streptavidin-Alexa Fluor 555), fläck eosinofiler med rått-anti-större grundprotein (MBP) antikropp och anti-rått-Alexa Fluor 647-antikropp , B-cellermed rått-anti-B220-Alexa Fluor 594-antikropp och datorer med anti κ lätt kedja-fluorescein-iso-tiocyanat (FITC) och anti-λ1 lätt kedja-FITC antikroppar (detaljer om färgningsproceduren beskrivs i ^9).
2. Montera färgade snitt: sätta en droppe Fluoromount på sträckan och sedan täcka med en # 1 glas täckglas, och därvid nogsamt undvika bildandet av luftbubblor. Därefter utför laserskanning konfokalmikroskopi med ett instrument utrustat med laserlinjer lämpliga för färgning.
3. För att spela in bilder för automatiserad samlokalisering analys av benmärgs hematopoetiska celler med stromaceller använder Wimasis verktyget, tillämpa följande inställningar:
   1. Använd en 20X objektivlins och ett synfält av 708,15 x 708,15 xm. För automatiserad analys, hålla storleken på alla bilder konsekventa vid 2048 x 2048 pixlar (px) för att hålla resultaten jämförbara.
   2. Spela in en kanal för stromala strukturer (t.ex. (t.ex. DAPI, 405 nm) och ytterligare kanaler för hematopoetiska cellerna av intresse (t.ex. 3 kanaler, 488/594/633 nm för eosinofiler, B-celler och datorer).
   3. Rekord bilder med hjälp av linje genomsnitt 4 ^16. Helst täcka hela lårbenssektionen genom att ta enstaka angränsande bilder. Alternativt kan du ta icke-angränsande bilder från olika regioner i benmärgen (diafysära samt epifys).
      OBS: Var noga med att inte producera lappningar mellan angränsande bilder (för att undvika upprepad analys av celler i de överlappande områden).
4. Spara bilderna i en mikroskopbild filformat. Kontrollera och, om nödvändigt, justera kontrasten för alla kanaler i bildvisare / analysprogram.
5. Export 3 .jpg filer per bildfil: en .jpg fil för DAPI kanalen (röd / grön / blå RGB-format (), falsk färgkodade i gult), en .jpg fil för stroma kanalen (gråskala) och en .jpg fil som innehållerkanalerna för hematopoetiska celler (max 3 kanaler, RGB-format, t.ex. FITC (PC, falsk färg: grön) / Alexa Fluor 594 (B-celler, falsk färg: blå) / Alexa Fluor 647 (eosinofiler, falsk färg: röd)) .

4. automatiserad bildanalys

1. Använd ett bildanalys verktyg för att utföra bildsegmentering, kvantifiering av samlokalisering och grannskapsanalys (se diskussion).
2. Om du använder Wimasis verktyg, gör så här:
   1. Ladda upp uppsättningar av 3 .jpg-filer per bild med samma filnamn följt av en understrykning och ett nummer som anger vilken typ av bilden.
   2. Använd _1 för .jpg fil med hematopoetiska celler, _2 för .jpg-filen för DAPI kanalen, _3 för .jpg fil för stroma kanalen. Till exempel: Image1_1.jpg (hematopoetiska celler), Image1_2.jpg (DAPI kanal), och Image1_3.jpg (stroma kanal). Ladda upp bilderna via kundkonto.
   3. För cellkontakt kvantifieringvälj cellkontaktverktyget genom att klicka på respektive område. För cell närhet kvantifiering, välj cellen närhet verktyget och ange önskad närhet radie i pm (vilket mäts från cellernas kanter).
   4. Ladda resultaten.
      OBS: Resultaten tillhandahålls som .jpg-filer som visar hematopoetiska cellerna och stroma kanal med gränserna för de upptäckta objekt markerat samt enstaka .csv-filer som innehåller mätningar för varje bild, förutom en sammanställning .csv fil som innehåller data för alla uppladdade bilder.
3. Från kontaktmätningar bestämma frekvensen av hematopoetiska celler (rött, grönt eller blått celler) i kontakt med stromaceller eller frekvenserna av röda, gröna eller blå celler kontakta andra hematopoetiska celltyper (ett exempel visas i Representativa resultat , Figur 4). För att bestämma frekvenserna, dela de givna kontakt pulser per bild genomden totala cell räknas per bild.
   1. För experiment med enskilda möss, summera den totala kontakt räknar av alla bilder för ensamstående möss och dela dem med summan av totala cellräkningar av alla bilder.
4. Från mätningarna omnejd, bestämma frekvensen av röda, gröna eller blå celler inom det valda avståndet från stromala celler och / eller frekvenserna för röda, gröna eller blå celler i den föredragna närhet till de andra typerna hematopoetiska cell som beskrivs i steg 4,3 ( se även Representativa resultat, Figur 4).

5. Simulering av Random benmärg Positionering

1. Innan utför simuleringarna av slumpmässig cell positionering på de analyserade benmärgs histologiska bilder, förbereda följande filer på förhand: de enskilda .csv-filer som tillhandahålls av cellkontaktverktyget, de ursprungliga .jpg-filer för DAPI kanalen och de ursprungliga .jpg-filer för den stromala kanalen.
2. För att kunna utförasats simuleringar på en serie bilder (t.ex. alla bilder från en lårbens avsnitt), samla alla original .jpg-filer (_1, _2 och _3) och motsvarande enskilda .csv-filer i en mapp.
   OBS: simuleringsverktyg för slumpmässig benmärgscell positionering är tillgänglig på begäran.
3. Starta simuleringsverktyg, markera rutan "Automatisk lastbilddata".
   OBS: Programmet kommer att läsa de celler och medelcellstorlek från CSV-filen automatiskt. Dessa värden visas i rutorna för "Cellnummer" och "Cellstorlek AVG" (Figur 5A).
4. Ange gemensamma tag för CSV-filer, dvs, den gemensamma faktorn i deras namn. Ange antalet bilduppsättningar som ska användas för batch-mode simulering.
5. Fyll på .jpg fil som genereras från stroma kanalen (med filnamn som slutar _3).
6. Ange inställningarna för att generera masken från DAPI kanalen:
   1. Markera rutan "? Applicera masken "Ställ tröskeln för konvertering av DAPI bilden till en binär mask till 10 (intervall 0-255).
   2. Markera rutan "8-bit?" Markera rutan "Dilate?" Och bestämma betyg på dilatation till 5 px. Markera rutan "w / erosion?".
   3. Ange önskat värde för närheten radien (grannskap radie) som används för analys av de simulerade bilder. För en bild av 708,15 x 708,15 xm med en storlek på 2048 x 2048 px (pixelskalning xy: 0,346 | im), 29 px motsvarar 10 um.
7. Markera rutan "Använd Otsu?" För att använda Otsu algoritm ¹⁷ för automatisk detektering av stromala strukturer.
   OBS: Detta är samma algoritm som används av kontakten med omnejd verktyg. Med samma bildsegmente algoritm i automatiserad analys av den inspelade bilden och den simulerade bilden är avgörande för att hålla data jämförbara.
8. Ange inställningarna för hematopoetiska celler, vilket are simuleras som runda former.
   OBS: De cellantal för röda, gröna och blå celler direkt laddas från CSV-fil (se även steg 5.6).
   1. Använd simuleringsverktyg för att beräkna den genomsnittliga diametern i px av röda, gröna och blå celler. Bestäm den genomsnittliga arean av en enda cell som den totala arean av varje celltyp i bilden i px dividerat med det totala celltalet per bild. Använd den genomsnittliga arean för att beräkna radien av en skiva genom att använda formeln. Dubbla radien för att bestämma den genomsnittliga diametern.
9. Mät cellstorleksfördelningen av de analyserade celltyper med någon bildanalys programvara som innehåller objektsegmentefunktioner. Bestäm σ för alla hematopoietiska celltyper ⁽¹⁸ och Figur 5B).
   OBS: Eftersom cellstorleksfördel av de inspelade cellerna inte bestäms av automatiserad bildanalys, använd en normalfördelning som en approximation av de verkliga distributioner. Bredden på than Fördelningskurvan beskrivs av σ och kan vara ganska olika för olika celltyper. (För detaljer, se figur 5B).
   1. Från dessa mätningar, bestämma "cellstorleken cutoff": diametern i px som beskriver den minsta objektet fortfarande erkänd som en komplett cell genom bild analysverktyg.
10. Ange parametrar i respektive rutor på det grafiska användargränssnittet (Figur 5A).
    1. Ange cellstorleken avskuren, dvs den minsta cellstorleken tillåts i simuleringen, som en diameter i px.
    2. Ange σ i px för simulering av cellstorleksfördelningen för röda, gröna och blå celler (från steg 5,9).
    3. Kontrollera "Delete" rutan i avsnittet "Celler i Mask". Med denna inställning, kommer programmet valde en ny position för en cell om den överlappar med åtminstone en pixel med en no-go område av masken. Markera rutan "Undvik cell överlappning? ̶1; i underavsnittet "Cell utanförskap".
    4. Ange det tillåtet minsta avståndet mellan centra för två celler i px.
       OBS: Det minsta avståndet måste bestämmas från de inspelade bilderna. Felaktigt uppmätta minimiavstånd kommer att leda till partiska / artificiella resultat för jämförelse av inspelade och simulerade bilder.
    5. Ställ in maximalt området överlappning till 100% om överlappn definieras av det minsta avståndet från centrum till centrum.
    6. Ställ simuleringsverktyg till 1000 repetitioner.
    7. Markera rutan "Autosave celler?" För att spara koordinaterna för de simulerade objekten för alla repetitioner av varje bild av partiet som .rect filer (text format). Markera rutan "Autosave bilder?" För att spara en .tiff fil för varje simulerad bild. Ange ett gemensamt tag för de sparade filerna.
       OBS! "? Autosave celler" alternativet minskar simulering gångtid och övergripande datastorlek, jämfört med när du sparar den verkliga simulerade imaGes. De .rect filer lagra koordinaterna för de simulerade celler som rektanglar och kan således konverteras till simulerade bilder om det behövs.
11. Starta simuleringen genom att klicka på "Kör simulering".
    OBS: simuleringsverktyg genererar automatiskt en CSV-fil för de 1000 simuleringar av varje bild, inklusive den genomsnittliga kontakt räknas med omnejd räknas för röda, gröna och blå celler med röda, gröna, blå, och stromaceller för varje uppsättning av upprepade simuleringar . Dessutom, för alla dessa värden är medelvärden av de 1000 simuleringar med standardavvikelse (STD) och standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) tillhandahålls.
12. Bestäm den genomsnittliga kontaktfrekvenser och omnejd frekvenser av en uppsättning av 1000 simulerade bilder. För detta, dela den genomsnittliga kontakten med omnejd räknas från den inspelade celltal per bild. Jämför frekvenserna till resultaten av den automatiserade samlokalisering analys av den inspelade bilden.
13. Tillämpa lämpliga statistical metoder beroende på analysen ¹⁹ (för fig 7, använde vi en två-tailed Wilcoxon signed rank test).

Representative Results

Skär kryosnitt av undecalcified benet med Kawamoto tejp metod tillåter hela benet som skall skäras som en intakt sektion, med benmärgen hos den endosteala regionen fortfarande fastsatt på mineraliserat ben, både i diafysen och i epifys områden med deras hög täthet av trabekulärt ben (Figur 1). Nukleär färgning av sektionerna visar att även om inte helt undvikas små sprickor i beredningen, strukturen på sinusoider och artärer samt retikulära nätverket av parenkymet förblir intakt.

Som ett exempel på en immunofluorescensfärgning av röd fluorescerande chimär benmärg och analysen därav är en färgning för eosinofiler (större grundprotein, MBP), datorer (κ och λ lätt kedja) och B-celler (B220) visas. Möss immuniserades med 100 ^ g av 4-hydroxi-3-nitrofenylacetyl hapten kopplat till kyckling γ-globulin (NP-CGG) i alun ip, 4 veckor efterberedning, förstärkt med 50 pg av NP-CGG i PBS iv 21 dagar senare och analyserades på dag 30 efter uppsving. Den automatiserade bildanalys resulterade i en mycket exakt erkännande av stromala strukturer, inklusive även mycket små fragment av reticular processer. Eftersom cellen antalet stromaceller inte kan fastställas med systemet som presenteras här (se även diskussion) ades ingen tröskelstorlek införs för den stromala kanalen, i syfte att detektera alla fragment i bilderna (figur 2). Datorer och eosinofiler är större än B-celler och visar också en mer heterogen form. Samtliga tre celltyper har väl erkänt vid första anblicken. Cellular kluster, särskilt av B-celler, var väl åtskilda. Verktyget analys är optimerad för de ovan nämnda celltyper (eosinofiler, persondatorer, B-celler). För andra celltyper, kan justeringar vara nödvändiga. .csv Filer som genereras av cellkontaktverktyget innehåller följande relevanta mätningar för hematopoetiska celler:celltal för varje cellpopulation; totala areal för varje cellpopulation i px; kontakt räkna av röda blodkroppar (i detta fall eosinofiler), gröna celler (här PC) eller blå celler (här B-celler) med röda, gröna, blå eller grå celler (stromala celler). .csv Filer som genereras av cell närhet verktyget innehålla följande mätningar för hematopoetiska celler: celltal för varje cellpopulation; totala areal för varje cellpopulation i px; närhet räkna av röda, gröna och blå celler med röda, gröna, blå och grå celler (stromala celler).

För att validera kvaliteten på bild analysverktyg, var resultatet av den automatiserade analys jämföras med en manuell räkning med 6 utbildade bedömare (Figur 3). Alla bedömare fått identiska bilder för analys. Stromala strukturer och hematopoetiska celler försiktigt skiss med en bild analysverktyg och dessa regioner av intresse räddades och analyserades. För stromala strukturer, den totala ytan per bildjämfördes mellan automatiserad och manuell analys. Stromala strukturer verkade vara svårt för de utbildade bedömare att inse exakt, vilket avspeglas i den stora variansen observeras för storleken på den totala arealen av stroma räknas manuellt (Figur 3A). Här fastställde automatiserad analys ett värde nära den genomsnittliga området upptäcktes av utbildade bedömare. För alla celler, den automatiserade analysverktyget fastställt en något lägre mängd celler än räknade manuellt. Men för PC och eosinofiler var antalet fortfarande i intervallet interbedömarreliabilitet varians observeras för de manuella räkningar. Antalet B-celler som detekteras av automatiserad analys, var dock något under detta intervall (Figur 3A). Den genomsnittliga cellstorleken (område px) som bestäms av automatiserad analys var 512 px för datorer, 436 px för eosinofiler, och 317 px för B-celler, medan utbildade bedömare bestäms en storlek på 515 px för datorer, 464 px för eosinofiler, och 291 px för B-celler. Således, den genomsnittliga cell storlek för B-celler, datorer och eosinofiler bestäms av automatiserad analys var jämförbar med den genomsnittliga cellstorlekar bestäms av manuella bedömare (Figur 3B). Denna automatiserade bild analysverktyg kan nu användas för att kvantifiera direkta kontakter kandidat benmärgstyper nisch cell. Dessutom kan frekvensen av celler av en viss celltyp angränsande stromala celler eller andra hematopoietiska celltyper bestämmas. En analys av benmärgs datorer och sina kontakter för att stromaceller, eosinofiler, B-celler, och andra datorer visas, liksom frekvensen av datorer grann dessa celltyper inom 10 och 20 ^ m (Figur 4A). Dessutom kan kontakt frekvenser av olika hematopoietiska celltyper med stroma kvantifieras (Figur 4B).

Innan en simulering av slumpmässig benmärgs positionering av dessa celler med simuleringsverktyget, de parametrar som beskriver fördelningen av cellstorleken som en Gaussian fördelning måste fastställas. För en Gauss-fördelning, som kan visualiseras som en symmetrisk och "klockformade" kurva, endast två parametrar behöver bestämmas: placeringen av centrum av kurvan (det läge, dvs, där toppen av kurvan är belägen ) och bredden av den symmetriska kurvan (detta beskrivs av ovannämnda σ parameter). Denna procedur visas här för datorer, eosinofiler och B-celler (figur 5B). Uppmätta cellstorleksfördel visar att, för B-celler, är mindre än för PC och eosinofiler bredden på fördelningskurva som beskrivs av σ. För simuleringen, var de relativa värdena för σ uppmätts för de tre cellpopulationer underhålls (dvs, var B-celler alltid simuleras av en dubbelt så snäv storleksfördelning än för datorer "och eosinofiler"), medan σ värden som definieras i px var set för att matcha utseendet på de inspelade cellerna (Figur6B). Detta fick oss att tillämpa en σ 2 px för B-celler och ett σ av 4 px för både PC och eosinofiler. Cellstorlek cutoff bestämdes från de uppmätta cellstorleksfördelningar. För PC-datorer och eosinofiler, en cutoff vid 300 px objekt storlek, vilket resulterar i 20 px diametern för ett cirkulärt objekt (omkring 7 | im) och för B-celler en cutoff vid 220 px, vilket leder till en 17 px diameter (ca 6 | im) användes för simulering.

För att definiera områden i den simulerade slumpmässig bild där celler får placeras av simuleringsverktyg, var en mask som genereras från kärnkrafts signaler i DAPI kanalen för en benmärgs histologisk bild (figur 6A). Ett värde på 10 bestämdes vara den optimala intensiteten tröskeln för att generera de binära bilder (övre panel, höger bild). Tröskel bestäms av Otsu algoritm inte leder till fullständigt erkännande av alla kärnor i bilden (övre panelen, center bild), i likhet med fasta intensitettrösklar för 50 eller 150 (nedre panelen, vänster och mitten bild) .Den relevans kontakter datorer, eosinofiler, eller B-celler med stromaceller (Figur 4B) testades med hjälp av simuleringsverktyg (Figur 7). Denna analys visade signifikant högre kontakthastigheter i de inspelade bilderna jämfört med simulering för PC och B-celler (figur 7A), i linje med begreppet stromala nischer som stöder dessa populationer. Detta bekräftades i fem enskilda fluorescerande chimera möss (figur 7B, D). Däremot var ingen tydlig skillnad bestämdes i fallet med eosinofiler (figur 7A, C).

Figur 1. Översikt fluorescens bild av ett längdsnitt av en murin lårben cryosectioned med Kawamoto s tejpmetoden. Bandet metoden medger cutting sektioner med en intakt endostal regionen, både i diafyseala liksom i epifys områden, från undecalcified ben. En 7 nm tjockt ben avsnitt av en naiv C57BL / 6-mus färgades för extracellulära matrixprotein laminin (röd), för Sca-1 att visualisera arterioler (grön) och för kärnor (blå, DAPI). 47 brickor av 1446 x 1088 um, upplösning 1360 x 1024 px registrerades och sydda för att skapa översiktsbild. Denna bild har förvärvats på ett brett fält fluorescensmikroskop, med en 10X objektiv (0,45 NA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Automatiserad detektering av stromala och hematopoietiska benmärgsceller. En femurbenet sektion av en röd fluorescerande chiMeric musen på dag 30 efter boost färgades för RFP (grå) för att visualisera stroma, MBP (röd, eosinofiler), κ och λ lätt kedja (grön, datorer) och B220 (blå, B-celler). Vänster: Ursprunglig bild förvärvas på ett konfokalt mikroskop, med användning av ett 20X objektiv (0,8 NA) och ett synfält av 708,15 x 708,15 xm. Höger: segmenterad bild. Konturerna av de erkända objekten är markerade. De vita rektanglarna markerar det område som visas i botten bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Validering av den automatiserade bildanalys av utbildade bedömare. (A) Det totala området stromala strukturer och totala cell antalet hematopoetiska celler räknas av utbildade bedömare i en (stromala strukturer), 10 (PC), två (eosinofiler) och en bild (B-celler) jämfört med cellnummer erhållits genom automatiserad bildanalys. Prickar representerar individuella bedömare (n = 5-6). Staplar indikerar medelvärden eller automatiskt bestämda värden. (B) Object storleksfördelning manuellt räknade objekten jämfört med den genomsnittliga objektstorleken bestäms av automatiserad analys. För att ta hänsyn till de olika frekvenserna för de olika celltyper, var datorer räknas i 10, eosinofiler i två och B-celler i en bild. Punkter representerar enskilda objekt. Linjer anger medelvärdet. (C) Manuell skisse av stromala strukturer av utbildad bedömare. Vänster: originalbilden. Mitten: Exempel på manuellt analyserade bilderna. Höger:. Stromala strukturer upptäckts av automatiserad analys Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Figur 4" src = "/ filer / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Figur 4. Automatiserad samlokalisering analys av datorer, eosinofiler, B-celler och stromaceller i lårbens benmärgen. (A) Vänster: Frekvens av datorer i direkt kontakt med stromala strukturer, eosinofiler, B-celler eller andra datorer i fluorescerande chimär möss på dag 30 efter uppsving. Mellanöstern och höger: Frekvens av datorer i 10 um närhet eller 20 pm närhet stromala strukturer, eosinofiler, B-celler eller andra datorer. Delar av denna siffra (direktkontakt, 10 mikrometer omnejd) ändras från Zehentmeier et al. ⁹ (B) Frekvens av datorer, eosinofiler och B-celler i direkt kontakt med stromala strukturer. 52-515 datorer, 918-3179 eosinofiler, 4146 till 13.063 B-celler i 10-21 bilder räknades från 5 fluorescerande chimära möss på dag 30 efter boost, poolade från två oberoende experiment. Punkter representerar individuella möss. Linjer indikerar medianen.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Bestämning av cellstorleksfördelning av benmärgsdatorer, eosinofiler och B-celler. (A) Skärmdump på det grafiska användargränssnittet (GUI) i simuleringsverktyg. (B) Fördelningen cellstorlek (område px) datorer (κ och λ lätt kedja, grön), eosinofiler (MBP, röd) och B-celler (B220, blå) visas i histogram mätt efter objektigenkänning av Volocity programvara (övre panel). I lårbensbenmärgsbilder (undre panelen), upptäckta datorer är markerade i rött (overlay gul), eosinofiler i blått (overlay violett) och B-celler i gult (overlay grått). Bildsegmente utfördes genom att sätta en storlek tröskel på 180 px minimum för datorer,300 px för eosinofiler och 220 px för B-celler. 250 föremål mättes för PC, 650 föremål för eosinofiler och 3000 föremål för B-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Generation av masken för simulerad slumpmässig cellpositionering. (A) Den ursprungliga DAPI kanalen (gul) samt överlägg i DAPI med binära bilder som genereras med hjälp av olika trösklar visas. Masken som genereras från den binära bilden (tröskelvärde satt till 10) visas nedan (nedre panelen, högra bilden). Svarta områden representerar förbjudna områden, vita områden representerar områden där celler tillåts att placeras. (B) Den inspelade bilden (vänster) och motsvarande simulerade bilden (höger) visar hög visuelllikheten. Eosinofiler (MBP), datorer (κ och λlight kedja), B-celler (B220) och stromaceller (RFP) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. Direktkontakt av hematopoetiska celltyper med stromala strukturer i inspelade vs simulerade bilder. (A) Frekvens av datorer, eosinofiler och B-celler i direkt kontakt med stroma i simulerad jämfört med inspelade bilder av fluorescerande chimär möss på dag 30 efter uppsving. Linjer ansluter motsvarande simuleras och inspelade bilder (punkter). Bilder från en representant mus visas i varje tomt. (B) Frekvenser av datorer, eosinofiler och B-celler i direkt kontakt med stroma i simulerad jämfört med inspelade bilder av 5 individuella möss från två oberoende experiment. Wilcoxon signed rank test, två-tailed (PC: *** p = 0,0001; * p = 0,0371; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001, eosinofiler: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; * p = 0,0161, p = 0,4143; *** p = 0,0007, B-celler: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Punkter representerar enskilda bilder. Staplarna anger medelvärdet. P-värden 0.05 anses betydande skillnader. Asterisker i siffror visar följande P-värden: ns: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Delar av denna siffra (direkt kontakt med datorer med stromala strukturer) ändras från Zehentmeier et al. ⁹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

700 "/>
. Figur 8. Komplett arbetsflöde för kvantifieringen strategi för hematopoetisk cell - stromala cell interaktioner i murina benmärg Ansatsen är indelad i tre huvuddelar: 1. murina benmärgs sektioner är beredda och rådata samlas in av laserskanning konfokalmikroskopi, 2 . den automatiserade analysen av de inspelade bilderna och simulering av slumpmässig placering av benmärgsceller utförs, 3. kontakt och grannskaps räknas som erhållits från inspelade och simulerade bilder jämförs. Ingången (bildfiler) och utgång (textfil) av automatiserad analys visas i blått, är ingången (bildfiler) och output (textfiler och eventuellt bildfiler) av simuleringsverktyg som anges i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Trots framstegen i moderna optiska avbildningsmetoder, är analysen av histologiska uppgifter fortfarande ofta hindras av bristen på ordentliga kvantifiering verktyg och metoder, eller genom partiska analyser som fokuserar på ett litet område av intresse. Den synergistiska synsätt som presenteras här kombinerar bildanalys täcker hela benmärgen region automatiserade segmentering och objektdetektering av olika hematopoetiska och stromala celltyper, samlokalisering analys, och slutligen ett valideringsverktyg för icke-slumpmässigt förekommande kontakter som tillhandahålls av en ny kun- utformade simuleringsprogram.

Histologi av hela ben inklusive benmärgen har varit svårt att utföra på grund av de olika vävnadstätheterna som är närvarande i en sektion - å ena sidan det mycket hårda, mineraliserat ben, å andra sidan av den extremt svåra märgen, vilket blir lätt störs när man skär tillsammans med benet. Som ett alternativ, bandmetod för att skära ben sektioner presterade här ^14,15 har den fördelen att den stabiliserar den vävnaden och lämnar därigenom de endostala områdena intakta (Figur 1). Förutom att vara rik på osteoblaster, har dessa områden föreslagits att spela en roll i stamcells underhåll ^20.

Den avgörande roll för stromaceller i utvecklingsprocesser och cellulära underhåll i benmärgen blir allt tydligare. Dock har analysen av dessa sällsynta, sköra celler visat sig vara svårt av två skäl: För det första, de är svåra att isolera från benmärgen; andra, är graden av heterogenitet bland stromal befolkningen inte känt, och därför kan man missar en viktig population med hjälp av vissa markörer som har beskrivits för stromaceller. Metoden för att generera fluorescerande benmärgs chimärer är användbar för fluorescensmärke och därefter analysera benmärgs stromala cellpopulationen som helhet. Emellertid bör det noteras att det i dessa mice alla mesenkymala celler i benmärgen visualiseras, inklusive endotelceller och osteoblaster. Detta måste beaktas om data från sådana chimära möss analyseras. Även om det också finns en risk för hematopoetiska celler av mottagarens ursprung överlevande bestrålningen, dessa celler normalt endast omfatta ett mycket litet område per synfält jämfört med donator CD45 ⁺ celler, alltså inte påverkar histologisk analys ^9. Tydligt, bör denna metod kombineras i ett efterföljande steg med en mer specifik detektion av stromala (under) populationer. För närvarande är analysen av dessa celler oftast görs av histologi på grund av de skäl som anges ovan, om införande av en gräns för hur många parametrar som kan analyseras samtidigt. Utvecklingen av flera parametrar analyser i mikroskopi kommer att bidra till att övervinna dessa begränsningar.

Under bildanalys ades segmente utförs med hjälp av original Otsu algoritm. VäsentligenBestämmer detta klustring baserad tröskling metoden automatiskt intensitetströskeln för den optimala separationen av förgrunden (signal) och bakgrund (buller) pixlar i två grupper med den lägsta statistiska divergens i en given kanal, vilket resulterar i en binär bild ^17. Här var Otsu metod tillämpas på naturliga logaritmen version av den ursprungliga bilden, är att:

Ingång bild till Otsu = ln (Ingång bild)

Detta fungerar bättre för fluorescens bilder sedan Otsu metod kan identifiera dim celler som bakgrund. Lägga den logaritmiska funktionen möjliggör en bättre separation av cellerna och bakgrund i två olika klasser av Otsu algoritm. Dock är ensam intensitetströskel inte tillräckligt för att exakt identifiera enskilda objekt. Det fungerar effektivt när detektering väl separerade objekt i bilder, men det är inte tillräckligt att separata enkelceller ligger inom kluster. Som några av de celltyper somvar av intresse för oss, såsom eosinofiler eller B-celler, ofta grupperade tillsammans i vävnaden, deras kärnor i DAPI kanalen segmente med hjälp av en algoritm baserad på k-means klustring av intensiteten histogram med k = 10 ^21. Den cellsegmente algoritm rita den ljusaste till de mörkast pixlar (klustrade i 10 lådor) och ständigt leta efter bildandet av cellliknande föremål. Dessa ändamål kommer då definieras som celler. När alla pixlar har använts, är de resulterande kärnorna dilaterade att generera en mask som sedan tillämpas på de andra kanalerna för klusterseparation.

Det bör noteras att denna analys fungerar bra för hematopoetiska celler som är kompakt, men att det är begränsat med avseende på stromaceller, eftersom det inte är möjligt att bestämma gränserna för dessa stora, sprids ut celler på grund av sammankopplingen av deras dendritiska förlängningar som bildar ett reticular nätverk. Sålunda räknar cell för stromacellerkan inte lämnas. Märkning enstaka celler via ödet karterings reportrar under kontroll av stroma specifika promotorer kommer att lösa det här problemet, enligt vad som publicerats för neuroner (med hjälp av "Brainbow" systemet ²²⁾ och för märkning av follikulära dendritiska celler i lymfkörtlarna ^23.

Förutom att tillämpa en brusreducering steg till alla kanaler genom att utesluta föremål under 30 px, var storleksuteslutnings tillämpades i processen för objektigenkänning för hematopoetisk men inte stromaceller. Små fragment av celler som skars genom sektione kan uteslutas; dock kan försummas förlusten i det här fallet till förmån för ett entydigt erkännande av cellerna. Förlänga analys och simulering från två till tre dimensioner kommer att övervinna denna begränsning. Utveckling av metoder för att studera cellulära distribution i hela fästen, t.ex. genom fler foton mikroskopi eller ljus plåt mikroskopi / SPIM, kommer säkerligen att hjälpa i thär respekt. För att studera den komplexa cellulära sammansättningen av flerkomponents nischer, kommer det också att bli nödvändigt att utöka antalet parametrar som analyseras på plats. Lovande metoder för multi analys av histologiska uppgifter i kombination med cytometrisk kvantifiering har publicerats nyligen ^{24, 25.}

Kontaktanalys utfördes genom att kvantifiera överlappningen av två objekt. Direkt kontakt definierades som en överlappning av åtminstone en pixel. Viktigt är denna analys begränsas av upplösningen av mikroskopiska bilder och därför är beroende av våglängden och sättet excitation, liksom på numeriska apertur objektiv som används i mikroskopet, och hål storlek. I analysen visas här, en 0,8 NA 20X objektiv med fluorokroma kombinationer upphetsad med 488, 561, 594 och 633 nm med en foton excitation applicerades. Därför värderar lateral upplösning mellan0,372 och 0,483 nm uppnåddes. Detta gör påståenden göras om sammanställning av olika cellgrupper; Men, inte ge någon information om förmodade molekylära mekanismer som är involverade i cellulära interaktioner. Dessutom är andra metoder såsom 2-foton intravital mikroskopi behövs för att förbättra karakteriseringen av dessa intercellulära kontakter ^9. Förster-resonansenergiöverföring (FRET) -baserade system kan bidra till att bekräfta om dessa interaktioner är faktiskt funktionella ^26.

För att utvärdera den cellulära mikromiljön av vävnads nischer, är det inte bara viktigt att analysera de direkta cellkontakter, men också för att kvantifiera de celltyper i närheten av en viss celltyp av intresse ("närhet analys"). Tidigare publicerade studier uppmätta avstånd mellan celler och vävnadsstrukturer såsom fartyg baserade på positionen av kärnan ^27. Eftersom vi var intresserade av fastställbaraing avståndet olika celltyper, bland annat med varierande förhållanden av nukleär cytoplasma volym, vi föredrog att mäta avståndet mellan ytorna. För detta ändamål beräknade vi närhet radien genom att bestämma den Euklidiska avståndet från en cellens gräns efter konvertering av värdena från xm till px. Den euklidiska avståndet är linjärt avstånd mellan två pixlar och kan beskrivas med formeln ^28:

Celler med pixlar av sina gränser inom ett euklidiskt avstånd av t ex 10 | im från bildelementen i en målcell gränser räknades som angränsande denna cell.

I sin nuvarande form, bestämmer analysen bara huruvida en cell bringas i kontakt eller kontaktats av en annan cell i samma eller olika typ, vilket ger endast en binär JA / NEJ karakterisering. Det faktiska antalet cells som kontaktar cellen av intresse eller ligger inom en viss radie från det beräknas inte. Nästa steg blir att förlänga den nuvarande analysen på ett sätt som gruppstorleken för att kontakta eller angränsande celler kan detekteras och jämföras mellan olika målceller av samma typ. Detta kommer att leda till ytterligare viktig information om sammansättningen av benmärgs nischer, exempelvis överlevnad nisch för benmärgsplasmaceller, där en varierande bidrag hematopoetiska accessoriska celler har diskuterats ^29-33.

De igenkänningsalgoritmer objekt optimerades tillsammans med specialister från Wimasis använder sin kommersiellt tillgänglig anpassad lösning service och finns tillgängliga på begäran. Ett annat alternativ är att använda antingen kommersiellt tillgänglig programvara för bildanalys, såsom definiens, Volocity eller Imaris eller freeware såsom CellProfiler.

De automatiska cellsegmentering och bild analysverktyg vire validerats genom att jämföra sina resultat med manuellt analyserade uppgifter från 6 utbildade bild bedömare med avseende på två parametrar, nämligen objektstorlek och antalet celler i olika cellpopulationer. Som visas i figur 3B, den genomsnittliga objektstorleken för hematopoetiska celler (PC, eosinofiler och B-celler) var likartad mellan de båda metoderna, med en högre varians för manuell storleksbestämning för plasmaceller och eosinofiler, troligen på grund av deras mer oregelbunden form jämfört till B-celler. Den automatiserade upptäckt av cellantal gav något lägre värden än de manuellt upptäckta sådana. Noterbart var de fortfarande inom intervallet av de manuella värdena när det gäller eosinofiler och datorer, medan de var under dessa värden när det gäller B-celler, förmodligen på grund av en högre heterogenitet uttryck av B220, som användes som markör för B-celler. B220 är känd för att vara uppreglerad under B-cellsdifferentiering i benmärgen, och B-celler med låg samt hög ikan observeras ntensity färgning för B220. B-celler med låga B220 signaler föll under den tillämpade tröskeln, vilket kan ha lett till uteslutning av de tidigaste skede B-celler. En lägre tröskel för automatisk detektion kan lösa det här problemet. För stromaceller, som är svårare att upptäcka på grund av deras mindre kompakt, mer dendritiska och sträckte ut morfologi, resulte manuell detektering i höga variationer mellan enskilda bedömare. Intressant, den genomsnittliga totala arealen av stroma var lika med den totala fastställda automatiskt område, vilket indikerar att analysen är väl lämpad för att kompensera för enskilda partiskhet av bedömare. Sammantaget visar dessa data att de automatiserade resultat representerar generellt medelvärdena för manuella analyser och är väl lämpade för att minska interbedömarreliabilitet variabilitet i analysen.

För att diskriminera slumpmässiga och icke-slumpmässig positionering av celler inom de strukturella begränsningarna hos vävnaden, var ett simuleringsverktyg utvecklats. During simuleringen, är en artificiell bild med slumpvis placerade hematopoietiska celler skapas för varje inspelad benmärg histologisk bild. Först stroma kanal bilden används i originalformat. En mask genereras från DAPI bild genom att använda en fast intensitetsbaserade tröskeln, därigenom att bilden omvandlas till binärt format; den binära masken genomgår sedan flera steg av pixelbaserad dilation och erosion. Masken definierar områden i bildfältet där simulerade celler tillåts att placeras. Koordinaterna för centrumen av de simulerade cellerna tillhandahålls av en likformig slumptalsgenerator, vars gränser där den fastställda av bildstorleken. Information om cellantalet och medelcellstorlek för varje population bestämdes genom automatiserad bildanalys av de inspelade bilderna används för att definiera de simulerade hematopoietiska cellpopulationer. Den simulerade celldiameter antas följa en endimensionell Gauss-fördelning av vilken den verkligacelldiameter väljs slumpmässigt: Diametern sedan modifieras så att cellstorlek cut-offs för minsta tillåtna objektstorlek införs. Om den simulerade cellen skulle placeras så att en eller flera pixlar lappar med en no-go område eller skulle vara inom ett fördefinierat avstånd från en annan redan placerade cell (4 um från centrum till centrum som fastställts i inspelade bilder), nya slumpmässiga koordinater kommer att väljas, medan diametern lämnas oförändrat. Detta kommer att upprepas tills antalet simulerade celler är lika med antalet celler i den inspelade bilden.

Verktyget var baserad på antagandet att hematopoietiska celler kan placeras fritt i benmärgen, medan stromala strukturer fungera som en fast matris inuti vävnaden. Verktyget var optimerad för att situationen i benmärgen där parenkyma områden korsas av ett komplext system av sinuskurvor. Ett liknande modellering publicerades nyligen av Frenette och medarbetare för attanalysera placeringen av hematopoetiska stamceller i förhållande till stromaceller och vaskulära strukturer, som utgör ca 30% av den totala lårbensbenmärgsvolymen ^25. För att korrigera för denna effekt är simuleringsverktyg som presenteras här bygger på en mask av områden cellerna får placeras. Detta uppnåddes genom att använda en nukleär fläckbild, där föremålen representerar kärnorna utökades med en 5-steg dilatation (se figur 6) efter binärisering. Områden med låg cellulär densitet, dvs låg densitet av kärnor såsom ben och sinuskurvor, kommer inte att bidra till masken och därför blivit förbjudna områden. För att undvika en konstlad minskning av dessa förbjudna områden vid dilatation förfarandet, var en 5-stegs erosion ansökte därefter, vilket nyöppning större uteslutningsområden, samtidigt som den höga kärn densitet (därav "tillåtet") områden oförändrade. Denna metod kan lätt anpassas för andra lymfoida organ. I de tfrågor var denna metod kanske inte fungerar (t.ex. i områden där celler med hög cytoplasma / kärna förhållande före), andra metoder såsom cytoplasmatisk märkning kan användas för att skapa masken.

Hematopoetiska celler simulerades som cirkulära objekt vars storlek bestämdes genom användning av en Gauss-slumptalsgenerator, medelvärdet av vilka överenskommits med den beräknade medeldiametern hos varje celltyp. Bredden av fördelningen var baserad på uppmätt cellstorleksfördelningar i inspelade bilder som fastställts av en bildanalysmjukvara. För att ta hänsyn till att små cellulära fragment uteslöts i automatiserade bildanalys, var cellstorlek cut-offs introduceras som bestäms utifrån de uppmätta cellstorleksfördel för varje celltyp (se figur 5).

Naturligtvis fungerar detta väl för celltyper som är relativt enhetliga i deras storlek och form, men kan leda till problem i fallet med celler som enre mycket heterogen med avseende på dessa parametrar. Det bör noteras att denna analys är optimerad för de stora hematopoetiska celltyper i benmärgen (granulocyter, hematopoetiska progenitorer och lymfocyter), som har det gemensamt att de har en regelbunden, nästan rundad form. Dock har denna metod inte testats för dendritiska celler eller makrofager, celltyper med starkt oregelbundna cellkroppar. Analysera sådana celler kommer att presentera nya utmaningar för vårt automatiserade bildanalys samt tillvägagångssätt simulering, inklusive behovet av förbättrade cellklusterseparationsalgoritmer ²⁴ samt detaljerade formanalys och simulering av inte bara olika storlek men också annorlunda formade celler. Ett alternativ skulle vara en metod simulering som fungerar med de exakta formerna som registrerats. Emellertid måste det noteras att denna metod avsevärt skulle öka den deterministiska modellens beteende systemet.

För den simulerade experiments, 1000 repetitioner av simulering för varje inspelad bild alstrades. Använda här många repetitioner kommer att minska den relativa felet bidrar med processimulering självt till ca 3%. Nämligen, om cell-cell samlokalisering värden beräknas från simuleringar som är slumpmässigt, då processen simulering i sig kommer att kännetecknas av en N ^-1/2 fel funktion, där N är antalet simuleringar per uppmätt bilden. Detta är bidrag från processimulering sig till den ackumulerade felet av de uppmätta co-värden för lokalanpassning. Således, för N = 1000 den bidrog felet är 3,16%. Simuleringarna visas här körde för 20 till 60 minuter per bild per 1.000 repetitioner när endast spara simulerade bilder som .rect filer (en enkel textformat) och inte som faktiska bilder i .jpeg eller .tiff format (också ett alternativ i programvaran ).

Sammantaget ger detta tillvägagångssätt för en opartisk, hög genomströmning analys av histologiska bilds och möjliggör generering av statist relevanta data. Detta kan vara användbart vid jämförelse av cellulär lokalisering under olika förhållanden. Dessutom, den temporala komponenten kan i framtiden integreras i en modellering av benmärgscellrörelser, eftersom mer data på motiliteten hos olika celltyper i benmärgen blir tillgänglig. Denna metod kan sedan användas för att simulera störningar i systemet, såsom mobilisering av celler från benmärgen in i cirkulationen, t.ex. neutrofiler i fallet med en akut inflammation ^34. För att ytterligare belysa funktionen av benmärgen som en förvaringsplats för immunminnesceller, kan man också tänka sig att utvidga det till modell konkurrensen om överlevnadsfaktorer. Dessutom kan den möjliga överhörning mellan olika nischer åtgärdas, samt framkallande av nischer. Tillsammans kommer detta att bidra till att förstå de fysiologiska förändringar (t.ex. triggers för regenerativ beteende stamceller) som well som de patologiska störningar i systemet som helhet, till exempel i fallet med autoimmuna sjukdomar, neoplasi, eller akut inflammation. Som en del av en iterativ begreppet experimentet och modellering, nya hypoteser kan genereras baserat på simuleringar, som i sin tur kan återigen testas experimentellt på så sätt bidra till att ytterligare förstå funktionen och samverkan mellan olika celltyper inom komplexiteten i vävnader.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin)	Sigma	P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade)	Science Services	15713	EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
Dry ice
Acetone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Kawamoto's SCEM embedding medium	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit	Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. and N. Lee		available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC			produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma	D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium	DAKO	S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laser scanning confocal microscope			equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow	Wimasis, Munich		The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime	Microsoft		free download
Simulation tool for random cell positioning			available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions			We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software			free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).