Abstract
מיקרוסקופיה Confocal היא שיטת בחירה של הניתוח של לוקליזציה של סוגי תאים מרובים בתוך רקמות מורכבות כמו מוח העצם. עם זאת, הניתוח והכימות של לוקליזציה סלולרית הוא קשה, כמו במקרים רבים הוא מסתמך על ספירה ידנית, ובכך נושא בסיכון של החדרת הטיה מדרג תלוי והפחתת אמינות interrater. יתר על כן, לעתים קרובות קשה לשפוט אם שיתוף הלוקליזציה בין שני תאי תוצאות ממיקום אקראי, במיוחד כאשר סוגי תאים שונים מאוד בתדירות הופעתם. כאן, שיטה לכימות משוחדת של שיתוף לוקליזציה סלולרית במח העצם הוא הציג. הפרוטוקול מתאר את הכנת המדגם ששמשה לסעיפים היסטולוגית של עצמות ארוכות עכבריות כל כוללים מח העצם, כמו גם את הפרוטוקול מכתים ורכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה. עבודה ניתוח פורש מההכרה בhematopoietic ולא hematסוגי תאי opoietic בתמונות מח 2 ממדי עצם (2D) לכימות של מגעים הישירים בין התאים אלה מוצגים. זה כולל גם ניתוח שכונה, כדי לקבל מידע על מייקרו-הסביבה הסלולרית המקיפה סוג תא מסוים. על מנת להעריך האם שיתוף לוקליזציה של שני סוגי תאים היא התוצאה בלבד של מיצוב תא אקראי או משקפת עמותות מועדפים בין התאים, כלי סימולציה אשר מתאים לבדיקת השערה זו במקרה של היווצרות הדם, כמו גם תאי סטרומה, הוא בשימוש. גישה זו אינה מוגבלת למוח העצם, וניתן להרחיב לרקמות אחרות, כדי לאפשר ניתוח לשחזור, כמותי של נתונים היסטולוגית.
Introduction
בשל ההתפתחויות האחרונות טכנולוגיות מהירות במיקרוסקופ, כוללים הדמיה אופטית, הניתוח של תאים בהקשר של כל הרקמה הפך לנגיש יותר ויותר לאימונולוגים. האפיון של תאים בודדים בהשעיה מייצג שיטת ערך והחיונית להבנת תפקוד תאי ומולקולרי. עם זאת, הניתוח של התאים בתוך סביבת -anatomical (מיקרו) שלהם הוא חיוני להבנת יחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים המשתפים פעולה בתהליכים מורכבים כגון הפיתוח של מערכת חיסונית.
אמנם קל יחסית לmicroscopists להשיג מידע איכותי מתמונות, זה עדיין מהווה אתגר לכמת נתונים אלה, בין ההיתר בשל העובדה ששיטות ניתוח בתחום זה מפגרות מאחור בהשוואה למה שאפשרי ברכישת תמונה. חוקרים רבים עדיין מסתמכים על ספירת תאים ידנית בתמונות היסטולוגיה זמן רב,כך מציג הטיה בין מדרגים שונים ופוגע שכפול על ידי קבוצות אחרות. לעתים קרובות, תמונה אחת נציג נבחרה כדי להדגיש הצהרה על עמדה סלולרית או שיתוף לוקליזציה בפרסום, מה שהופך את זה קשה לקורא לשפוט את הרלוונטיות הסטטיסטיות של אירוע כזה.
יחד עם העובדה שתוכן המידע המלא של נתוני תמונה מנוצל לעתים רחוקות, זה מדגיש את הצורך בגישה יותר משוחדת, מהר יותר ומקיפה לנתח תמונות היסטולוגית.
מח העצם הוא רקמה מורכבת, אשר לוקחת על פונקציות חיוניות חשובות כמו האיבר של hematopoiesis בבעלי חוליות מבוגרות. מלבד היותו מקום הולדתו לתאי hematopoietic 1,2 ולשחק תפקיד חשוב בהתפתחות B לימפוציטים 3, היא פועלת גם כאתר שבו תגובה חיסונית הם יזמו 4 ותומך, הסירקולציה המחודשת תאי B בוגרים 5. בנוסף, תפקידה בשמירת iזיכרון mmunological הפך ממוערך יותר ויותר בעשור האחרון, כמספר סוגים של תאים המהווים זיכרון חיסוני נמצאו מתגוררים בי 6-9.
בין הארכיטקטורה המורכבת הרקמה של מוח העצם ואת תפקידיו ביחס עדיין להישאר חמקמק. שלא כמו איברי הלימפה משניים, אשר מאורגנים במקרו-תאים כגון אזורי תא T ו- B, מח העצם חסר מאקרו-מידור ברור. עד כה תאים שונים במוח עצם מוגדרים על ידי קרבתם לקליפת מוח העצם או לכלי דם. החשיבות של אוכלוסיות תאי סטרומה תושב השונות במוח העצם עבור מספר התהליכים כגון תאי גזע תמיכה, פיתוח של תאי B או תחזוקה של אוכלוסיות תאי זיכרון חיסוניים (כגון תאי פלזמה חיים ארוכים (מחשבים), CD4 + ו CD8 + תאי T הזיכרון) עולה בבירור כי יש מידה מסוימת של מיקרו-מידור במח העצם.
זה עדיין לא ברור באיזו מידת הנישות הללו חולקות תכונות משותפות ביחס לCompositio התאי והמולקולרי שלהםn, ובו אלמנטים להפוך נישה מסוימת ייחודית. בנוסף לתאי סטרומה, סוגי hematopoietic תא הוכחו לשחק תפקיד מכריע במתן אותות מסוימים לפחות לחלק מהנישות. ברור, את המורכבות של הרכב הנישה דורשת הניתוח שלהם באתר, וזה הפך להיות חשוב יותר ויותר עבור אימונולוגים והמטולוגים כדי להתמקד על מייקרו-ארכיטקטורת מח עצם, למשל, על ידי ניתוח היחסים מרחביים בין המרכיבים התאיים שלה.
כאן, אסטרטגיה לכמת יחסי שיתוף לוקליזציה ושכונה סלולריים במח העצם בצורה אוטומטית ובלתי משוחדת מוצגת. עבודה מפורטת הכולל את הדור של עכברי chimeric, חסת תאי ניאון סטרומה ותאי hematopoietic לא פלורסנט, הכנת סעיפים היסטולוגית מעצמות undecalcified, רכישה של תמונות confocal מכסים את כל העצם, כמו גם ניתוח התמונה האוטומטית של ג הסלולריo-לוקליזציה והאימות / אפליתה ממיקום האקראי על ידי כלי סימולציה מסופקת (איור 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדות המדינה המתאימות לרווחת בעלי החיים (Landesamt für Gesundheit und Soziales, ברלין) ובוצעו בהתאם להנחיות ותקנות הנוכחיות (G0194 רישיון ניסוי בבעלי החיים / 11).
1. דור של עכברים פלורסנט מח עצם כימרי
הערה: הדור של עכברי chimeric מח עצם ניאון לדמיין תאי סטרומה מח עצם מתבצעת כפי שתוארה קודם 9.
- התחל טיפול דל-Cre x עכברי ROSA-tdRFP (עכברים לבטא חלבון טנדם אדום ניאון (tdRFP) בכל מקום 11-13) כדי להכין אותם לקרינה. לחלופין, להשתמש בכל זן אחר עם ביטוי בכל מקום של חלבון פלואורסצנטי. נהל 1 מ"ג / מיליליטר של נאומיצין ו1 מ"ג / מיליליטר של ויטמינים (A, D3, E, C) דרך מי שתיית יומיים לפני ההקרנה.
- מכשיר את העכברים פעמיים עם 3.8 גריי עם wi-גמא irradiator צזיום-137דק מרווח של 3 שעות. לשם כך, למקם את העכברים בכלוב עוגת הקרנה מתאים לirradiator בהתאמה.
הערה: להקרנה של עכברים, המכון שלנו אינו דורש הרדמה. עקוב מדיניות מוסדית מקומית בנוגע להרדמה להקרנה. לטפל בבעלי חיים עם 5 מ"ג / קילוגרם של תת-עורית carprofen (sc) ליום לאחר ההקרנה אם יש סימנים של כאב. - למחרת, מחדש עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית של 3 x 10 6 תאי מח עצם שהוכנו מעצמות של עכברי C57BL / 6 תורם רבים בהעברת חיץ 9. שמור על העכברים בנאומיצין וויטמינים לתקופה של עד 2 שבועות ולעקוב אחר הרווחה והמשקל שלהם בתקופה זו. חכה לפחות 4 שבועות כדי לאפשר לכינון מחדש של מערכת החיסון לפני תחילת הטיפולים הניסיוניים מסוימים (לדוגמא, חיסון) 9.
- להקריב את העכברים ומניח אותם על קרש חיתוך, לעקר את הרגליים עם 70% אתנול. Euthanizעכברי דואר בהתאם למדיניות מוסדית מקומית. המכון שלנו מבצע נקע בצוואר הרחם.
- שימוש במלקחיים ומספריים כדי להסיר את העור מהירכיים. הסרה של רקמת שריר לחשוף את עצם הירך. Luxate עצם הירך ממפרק הירך והברך באמצעות מלקחיים ומספריים. היזהר שלא לשבור או לחתוך את העצם.
- מוציא בזהירות שנותרה חתיכות גדולות של רקמת שריר וסחוס מהעצם באמצעות מספריים. הסרה של רקמת שריר שנותרה על ידי שפשוף העצם בנייר טישו מעבדה. לאסוף את העצמות ניקו בצלחת פטרי עם ופר פוספט (PBS).
- תקן את עצמות הירך שלמות בparaformaldehyde 4% (PFA, כיתה מיקרוסקופ אלקטרונים) ל4-6 שעות.
- בטל PFA דגירה עצמות בסוכרוז 10% ב- PBS O / N. למחרת, דגירה העצמות ב -20% N / O סוכרוז. היום אחרי, דגירה העצמות בN / O סוכרוז 30%.
2. Cryosectioning של עצמות
הערה: לאחר 16-24 שעות בסוכרוז 30%, להקפיא את עצמות וcryosection אותם על פי שיטת הקלטת של Kawamoto 14,15.
- הכן כוס גדולה (2,000 מיליליטר נפח) עם קרח יבש ואצטון (כ 2: 1 יחס נפח, למשל, 400 מיליליטר של קרח יבש 200 מ"ל ושל אצטון) מתחת למכסת מנוע קטר. מניחים כוס קטנה (150-250 מיליליטר נפח) עם הקסאן בפנים (30 - 50 מיליליטר כ). חכה לתערובת להתקרר (כ -10 דקות, עד שהכפור מופיע בצד החיצוני של הכוס הגדולה).
- מלא ¾ של cryomold שכותרתו עם סופר Cryoembedding בינוני (SCEM); זהירות במקום עצמות בפנים עד שהם שקועים לחלוטין, דואגים שהם לא נוגעים בקצוות של העובש. עם מלקחיים גדולים להחזיק cryomold לתוך הכוס עם תחתית התבנית רק נגיעה במשטח של הקסאן.
- בואו קצוות החיצוניים של הקפאת SCEM (מסומנת באטימות, זה לוקח בערך 15 שניות). לאחר מכן שחרר באופן מלא את התבנית לתוך הקסאן ולתת לו freEze 1 - 2 דקות. קח את המדגם הקפוא ולעטוף בנייר צלופן ולאחר מכן רדיד אלומיניום (כדי להגן על המדגם מהתייבשות ולהימנע מחשיפה לאור). חנות ב -80 ° C עד cryosectioning.
- לcryosectioning של עצמות הירך להשתמש להבי microtome וmicrotome סטנדרטיים לרקמות קשות.
- הגדר את המדגם ולהב הטמפרטורה של microtome ל-24 מעלות צלזיוס. בואו המדגם לשבת בתוך microtome במשך כ -15 דקות לפני החיתוך.
- תקן את גוש המדגם לבעל מדגם מתכת עם SCEM או בינוני טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר). התאם את הכיוון של הבלוק במידת צורך. חתוך את הדגימה עד העצם נפתח במלואו והמח גלוי. התאם את עובי סעיף 7 מיקרומטר (להשליך את החלק הראשון).
- תקן את חתיכת סרט Kawamoto עם הצד הדביק בחלק העליון של בלוק המדגם בעזרת מרית עץ מכוסה עור צבי. בהמשך לכך, לחתוך את המדגם ולהפוך את הקלטת כך שהסעיף הואממוקם בצד העליון. העבר את הקלטת לזכוכית שקופית באמצעות מלקחיים. תקן את הקלטת לזכוכית השקופית עם סקוטש.
- בואו סעיפים להתייבש לפחות 30 דקות ולאחסן אותם ב -80 ° C עד שימוש. אחסן שקופיות בלא כתם ובלתי משובצות בקופסות שקופיות פלסטיק עם מפרידי בין שקופיות בודדות על מנת למנוע שהם להישאר ביחד. שקופיות מוכתמות ורכוב ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע בקרטון תיקיות שקופיות ב 4 מעלות צלזיוס.
אוסף 3. תמונה
- להפשיר וcryosections כתם על פי פרוטוקולי immunofluorescence נפוצים 9. כולל כתם גרעיני, למשל, 4, dihydrochloride '6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות שלמות רקמות.
הערה: כתם, למשל, לRFP לדמיין תאי סטרומה (אנטי-RFP ביוטין נוגדנים וstreptavidin-Alexa פלואוריד 555), אאוזינופילים כתם עם חלבון בסיסי נוגדן אנטי-עכברוש גדול (MBP) ואנטי-עכברוש-אלקסה פלואוריד 647 נוגדן , תאי Bעם נוגדן אנטי-עכברוש B220-Alexa פלואוריד 594 ומחשבים עם השרשרת והעמסת-iso-thiocyanate אנטי-κ אור (FITC) ונוגדני שרשרת-FITC אור אנטי-λ1 (פירוט שיטת הצביעה מתוארות ב9). - הר קטעים צבעוניים: לשים טיפה אחת של Fluoromount על הסעיף ואז לכסות עם כיסוי הזכוכית להחליק # 1, תוך הימנעות ההיווצרות של בועות אוויר בזהירות. בהמשך לכך, לבצע מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר עם מכשיר מצויד בקווי לייזר מתאימים לצביעה.
- כדי להקליט תמונות לניתוח שיתוף לוקליזציה אוטומטית של תאי hematopoietic מח עצם עם תאי סטרומה שימוש באפשרות Wimasis, להחיל את ההגדרות הבאות:
- השתמש בעדשה אובייקטיבית 20X ושדה ראייה של 708.15 x 708.15 מיקרומטר. לניתוח אוטומטי, לשמור על הגודל של כל התמונות עולות בקנה אחד ב2,048 x 2,048 פיקסל (px) על מנת לשמור על התוצאות דומות.
- להקליט ערוץ אחד למבני סטרומה (למשל, (למשל, DAPI, 405 ננומטר) וערוצים נוספים לתאי hematopoietic של עניין (למשל, 3 ערוצים, 488/594/633 ננומטר עבור אאוזינופילים, תאי B ומחשבים).
- תמונות שיא באמצעות קו עם ממוצע של 4 16. באופן אידיאלי, לכסות את כל סעיף הירך על ידי לקיחת תמונות סמוכות בודדות. לחלופין, לקחת תמונות שאינן סמוכות מאזורים שונים במח העצם (diaphyseal כמו גם epiphyseal).
הערה: היזהר שלא לייצר חפיפה בין תמונות סמוכות (כדי למנוע ניתוח חוזר ונשנה של תאים באזורים החופפים).
- שמור את התמונות בפורמט קובץ תמונה מיקרוסקופית. בדוק ואם יש צורך, להתאים ניגוד לכל הערוצים בתוכנת הצופה / ניתוח תמונה.
- יצוא 3 קבצי jpg לקובץ תמונה: קובץ .jpg אחד עבור ערוץ DAPI (אדום הפורמט / ירוק / כחול (RGB), צבע שווא המקודד בצבע צהוב), קובץ .jpg אחד עבור ערוץ סטרומה (גווני אפור) ו.jpg אחד קובץ המכילהערוצים לתאי hematopoietic (מקסימום 3 ערוצים, בפורמט RGB, למשל, FITC (מחשבים, צבע שווא: ירוק) / Alexa פלואוריד 594 (תאי B, צבע שווא: כחול) / (אאוזינופילים, צבע אלקסה פלואוריד 647 שווא: אדום)) .
4. ניתוח תמונה אוטומטית
- השתמש בכלי ניתוח תמונה כדי לבצע פילוח תמונה, כימות של שיתוף לוקליזציה וניתוח שכונה (ראה דיון).
- אם אתם משתמשים בכלי Wimasis, בצע את הפעולות הבאות:
- העלה קבוצות של 3 קבצי jpg לכל תמונה עם אותו שם הקובץ ואחריו קו תחתון ומספר המציין את הסוג של התמונה.
- השתמש _1 לקובץ .jpg עם תאי דם, _2 עבור קובץ .jpg לערוץ DAPI, _3 לקובץ .jpg לערוץ סטרומה. לדוגמא: Image1_1.jpg (תאי hematopoietic), Image1_2.jpg (ערוץ DAPI), וImage1_3.jpg (ערוץ סטרומה). להעלות את התמונות באמצעות חשבון הלקוח.
- לכימותי קשר תאלבחור את הקשר עם תא הכלי על ידי לחיצה על השדה המתאים. לכימות סביבת תא, לבחור את כלי קרבת תא ולהיכנס לרדיוס העדיף הסביבה במיקרומטר (הנמדד מקצוות של התאים).
- הורד את התוצאות.
הערה: קובץ ה- csv התוצאות מסופקות כקבצי jpg מראים את תאי hematopoietic וערוץ stroma עם הגבולות של האובייקטים מזוהים מודגש, כמו גם קבצי ה- csv יחיד המכילים את המידות לכל תמונה, בנוסף לסיכום ש מכיל את הנתונים עבור כל התמונות שהועלו.
- ממגע מדידות לקבוע את התדירות של תאי hematopoietic (אדום, ירוקים, או בתאים כחולים) במגע עם תאי סטרומה, או התדרים של תאים אדומים, ירוקים, כחולים או פנייה לסוגי תאי hematopoietic האחרים (למשל מוצגים בנציגי תוצאות , איור 4). על מנת לקבוע את התדרים, לחלק את קשר הספירות נתנו לכל תמונה על ידיהתא הכולל סופר לכל תמונה.
- בניסויים עם עכברים בודדים, לסכם את קשר הספירה הכוללת של כל התמונות לעכברים בודדים ולחלק אותם בסכום של ספירת תאים כוללת של כל התמונות.
- ממדידות הסביבה, לקבוע את התדירות של תאים אדומים, ירוקים או כחולים בתוך המרחק שנבחר מתאי סטרומה ו / או התדרים של תאים אדומים, ירוקים או כחולים בקרבה העדיפה סוגי תאים האחרים hematopoietic כמתואר בשלב 4.3 ( ראה גם נציגים תוצאות, איור 4).
5. סימולציה של אקראי מח עצם מיקום
- לפני ביצוע הסימולציות של מיצוב תא אקראי על תמונות היסטולוגית מח העצם ניתחו, להכין את הקבצים הבאים מראש: קבצי ה- csv יחידים הניתנים על ידי הכלי ליצירת קשר הסלולרי, הקבצים המקוריים .jpg לערוץ DAPI וקבצי jpg המקוריים לערוץ סטרומה.
- על מנת לבצעסימולציות אצווה על סדרה של תמונות (לדוגמא, את כל התמונות מסעיף אחד הירך), לאסוף את כל הקבצים המקוריים .jpg (_1, _2 ו_3) וקבצי ה- csv אחת המתאים בתיקייה אחת.
הערה: כלי הסימולציה למיקום תא במח עצם אקראי הינה זמינה לפי בקשה. - התחל כלי הסימולציה, סמן את התיבה "נתוני תמונה אוטומטי עומס".
הערה: התכנית תקרא את ספירת התאים וגודל תא ממוצע מקובץ csv באופן אוטומטי. ערכים אלה מוצגים בתיבות עבור "מספר תא" ו "AVG גודל תא" (איור 5 א). - הזן את התג המשותף לקבצי csv, כלומר, הגורם המשותף בשמות שלהם. הזן את מספר סטי תמונה שאמורה לשמש עבור סימולציה מצב אצווה.
- טען את קובץ .jpg שנוצר מערוץ סטרומה (עם _3 שם הקובץ שהסתיים).
- הזן את ההגדרות ליצירת המסכה מערוץ DAPI:
- סמן את התיבה "? למרוח את המסכה "קבע את הסף להמרת תמונת DAPI למסכת ינארי עד 10 (טווח 0-255).
- סמן את התיבה "8 סיביות?" סמן את התיבה "להתרחב?" ולהגדיר את הכיתה של התרחבות עד 5 px. סמן את התיבה "w / שחיקה?".
- הזן את הערך הרצוי לרדיוס הסביבה (רדיוס שכונה) שימש לניתוח של התמונות מדומה. לדמותו של 708.15 x 708.15 מיקרומטר עם גודל של 2,048 x 2,048 פיקסלים (XY דרוג פיקסל: .346 מיקרומטר), 29 px מתאים עד 10 מיקרומטר.
- תיבת סימון "השתמש Otsu?" להשתמש האלגוריתם של Otsu 17 לזיהוי אוטומטי של מבני סטרומה.
הערה: זהה אותו האלגוריתם המשמש את הכלי ליצירת קשר וקרבה. השימוש באותו האלגוריתם סגמנטציה בניתוח האוטומטי של התמונה המוקלטת והתמונה מדומה הוא חיוני על מנת לשמור את נתוני השוואה. - הזן את ההגדרות לתאי דם, אשר arדואר מדומה כצורות מעגליות.
הערה: המספרים הסלולריים לתאים אדומים, ירוק וכחול נטענות ישירות מקובץ csv (ראה גם צעד 5.6).- השתמש בכלי הסימולציה לחישוב הקוטר הממוצע בpx של תאים אדומים, ירוק וכחול. לקבוע את השטח הממוצע של תא בודד כפי שהשטח הכולל של כל סוג תא בתמונה בpx מחולק בספירת התאים הכוללת לכל תמונה. השתמש בשטח הממוצע לחשב את הרדיוס של דיסק באמצעות הנוסחה. להכפיל את הרדיוס כדי לקבוע את הקוטר הממוצע.
- מדוד את התפלגות גודל תא של הסוגים ניתחו תא עם כל תוכנת ניתוח תמונה הכוללת פונקציות פילוח אובייקט. לקבוע σ לכל סוגי תאי hematopoietic (18 ואיור 5).
הערה: מאחר שהפצות גודל תא של התאים הרשומים אינן נקבעו על ידי ניתוח תמונה האוטומטי, להשתמש הפצת גאוס כקירוב להפצות אמיתיות. הרוחב של tהוא עקומת ההתפלגות מתוארת על ידי σ ויכולה להיות שונה לגמרי לסוגי תאים שונים. (לפרטים, ראה איור 5).- ממדידות אלה, לקבוע את "הפסקת גודל תא": הקוטר בpx המתאר את האובייקט הקטן ביותר עדיין מוכר כתא שלם על ידי כלי ניתוח תמונה.
- הזן פרמטרים בתיבות המתאימות בממשק המשתמש הגרפי (איור 5 א ').
- הזן את גודל התא מנותק, כלומר, גודל התא המינימאלי מוותר בסימולציה, כקוטר בpx.
- הזן σ בpx לסימולציה של התפלגות גודל התא לתאים אדומים, ירוק וכחול (משלב 5.9).
- סמן את התיבה "מחק" בסעיף קטן "תאים במסכה". עם הגדרה זו, התכנית בחרה תפקיד חדש לתא אם זה חופף עם פיקסל אחד לפחות בשטח לא ללכת של המסכה. סמן את התיבה "הימנע מחפיפה סלולארי? ̶1; ב" הדרת התא "סעיף קטן.
- הזן את המרחק המינימאלי המוותר בין המרכזים של שני תאים בpx.
הערה: המרחק המינימאלי צריכה להיקבע מהתמונות שתועדו. שלא בצדק מרחקים מינימליים נמדדו יובילו לתוצאות מוטות / מלאכותיות להשוואה של תמונות שתועדו ומדומה. - הגדר את השטח המרבי של חפיפה עד 100% אם החפיפה מוגדרת על ידי המרחק המינימאלי ממרכז למרכז.
- הגדר את כלי סימולציה ל1,000 חזרות.
- סמן את התיבה "תאי שמירה אוטומטית?" כדי לשמור את הקואורדינטות של האובייקטים מדומים לכל החזרות של כל תמונה של המנה כקבצי .rect (פורמט טקסט). סמן את התיבה "שמירה אוטומטית של התמונות?" לשמור קובץ .tiff עבור כל תמונה מדומה. הזן תג משותף לקבצים שנשמרו.
הערה: "? תאי שמירה אוטומטית" אפשרות מפחיתה סימולציה זמן ריצה וגודל נתונים כולל, בהשוואה לעת שמירת ima המדומה בפועלGES. קבצי .rect להציל את הקואורדינטות של התאים מדומים כמלבנים ולכן ניתן להמיר את תמונות מדומה במידת הצורך.
- התחל הסימולציה על ידי לחיצה על "סימולציה הפעלה".
הערה: כלי הסימולציה יוצרת באופן אוטומטי קובץ csv ל1,000 סימולציות של כל תמונה, כוללים ספירה הממוצעת קשר וספירת קרבה לתאים אדומים, ירוק וכחול עם תאים אדומים, ירוקים, כחולים, וסטרומה לכל סט של סימולציות חוזרות ונשנות . בנוסף, לכל הערכים הללו, ממוצעים של הסימולציות 1000 עם סטיית תקן (STD) וסטיית התקן של ממוצע (SEM) מסופקים. - לקבוע את תדרי קשר ותדרי קרבת סט אחד של 1,000 תמונות מדומה הממוצע. לשם כך, לחלק את הקשר ממוצע וספירת סביבה על ידי ספירת התאים נרשמו לכל תמונה. השווה את התדרים לתוצאות ניתוח שיתוף הלוקליזציה האוטומטית של התמונה המוקלטת.
- החל stati המתאיםשיטות stical בהתאם לניתוח 19 (לאיור 7, השתמשנו Wilcoxon שני זנב חתם מבחן דרגה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חיתוך cryosections של עצם undecalcified עם שיטת קלטת Kawamoto מאפשר כל העצם להיחתך כסעיף בשלמות, עם מח העצם של אזור endosteal עדיין מחובר לעצם mineralized, הן בdiaphysis כמו גם באזורי epiphyseal עימם צפיפות גבוהה של עצם trabecular (איור 1). הכתמה גרעינית של הסעיפים עולה, כי למרות שלא ניתן להימנע מסדקים קטנים בהכנה מלאה, מבנה sinusoids והעורקים, כמו גם את רשת רשתי של parenchyma נשארת ללא פגע.
כדוגמא לצביעת immunofluorescence של מח עצם אדום ניאון chimeric והניתוח הבא שלה, צביעה לאאוזינופילים (שרשרת κ וλ אור) (חלבון בסיסי עיקרי, MBP), מחשבים ותאי B (B220) מוצגים. עכברים שחוסנו עם hapten 100 מיקרוגרם של 4-3-הידרוקסי nitrophenylacetyl מצמידים את גלובולין γ העוף (NP-CGG) בip אלום, 4 שבועות לאחרהכינון מחדש, שיפר עם 50 מיקרוגרם של NP-CGG בiv PBS 21 ימים לאחר מכן ונותח ביום 30 אחרי הדחיפה. ניתוח התמונה האוטומטית הביא להכרה מאוד מדויקת של מבני סטרומה, כולל גם שברים קטנים מאוד של תהליכי רשתי. מאז את המספר הסלולרי של תאי סטרומה לא ניתן לקבוע עם המערכת שהוצגה כאן (ראה גם דיון), אין סף גודל הוצג לערוץ סטרומה, על מנת לאתר את כל שברים בתמונות (איור 2). מחשבים ואאוזינופילים הם גדולים יותר מתאי B וגם להראות צורה הטרוגנית יותר. כל שלושה סוגי התאים הוכרו גם במבט ראשון. אשכולות סלולריים, במיוחד של תאי B, הופרדו גם. כלי הניתוח מותאם לסוגי התאים הנ"ל (אאוזינופילים, מחשבים, תאי B). לסוגי תאים אחרים, התאמות עשויות להיות נחוצות. קבצי ה- csv שנוצרו על ידי הכלי ליצירת קשר התא מכילים את המידות הרלוונטיות הבאות לתאי hematopoietic:תא ספירה לכל אוכלוסיית תא; שטח כולל עבור כל אוכלוסיית תאים בpx; קשר ספירה של תאים אדומים (במקרה זה אאוזינופילים), תאים ירוקים (כאן מחשבים) או תאים כחולים (כאן תאי B) עם תאים אדומים, ירוקים, כחולים או אפורים (תאי סטרומה). קבצי ה- csv שנוצרו על ידי כלי קרבת התא מכילים את המידות הבאות לתאי hematopoietic: תא ספירה לכל אוכלוסיית תא; שטח כולל עבור כל אוכלוסיית תאים בpx; ספירת קרבת תאים אדומים, ירוק וכחול עם תאים אדומים, ירוקים, כחולים, ואפורים (תאי סטרומה).
כדי לאמת את האיכות של כלי ניתוח תמונה, התוצאות של הניתוח האוטומטי הושוו לזה של ספירה ידנית על ידי 6 מדרגים מאומנים (איור 3). כל המדרגים קיבלו תמונות זהות לניתוח. מבני סטרומה ותאי hematopoietic הותוו בזהירות עם כלי ניתוח תמונה והאזורים של עניין אלה ניצלו ונותחו. למבני סטרומה, השטח הכולל לכל תמונההיה השוואה בין ניתוח האוטומטי וידני. מבני סטרומה נראים קשה למדרגים המאומנים לזהות בדיוק, כפי שמשתקפים בשונות הגדולות שנצפו לגודל השטח הכולל של stroma נספר באופן ידני (איור 3 א). כאן, הניתוח האוטומטי נקבע ערך קרוב לאזור הממוצע זוהה על ידי מדרגים מאומנים. לכל התאים, כלי הניתוח האוטומטיים נקבעו סכום מעט נמוך יותר של תאים מאשר לספור ידני. עם זאת, עבור מחשבים אישיים ואאוזינופילים, המספר היה עדיין בטווח של שונות interrater נצפו לספירה הידנית. מספר תאי B זוהו על ידי ניתוח אוטומטי, לעומת זאת, היה מעט מתחת לטווח (איור 3 א) זה. הגודל הממוצע התא (האזור בpx) כפי שנקבע על ידי הניתוח האוטומטי היה 512 px למחשבים, 436 px לאאוזינופילים, ו 317 px לתאי B, ואילו מדרגים מאומנים נקבעו גודל של 515 px למחשבים, 464 px לאאוזינופילים, וpx 291 לתאי B. לפיכך, ג הממוצעגודל ell לתאי B, מחשבים, ואאוזינופילים שנקבעו על ידי הניתוח האוטומטי היה דומה לגדלי תא הממוצע שנקבעו על ידי מדרגים ידניים (איור 3). כלי ניתוח תמונה אוטומטי זה עכשיו יכול לשמש כדי לכמת קשר ישיר של סוגי תאי מח עצם מועמד נישה. יתר על כן, בתדירות של תאים מסוג תא מסוים תאי סטרומה שכנים או סוגים אחרים תאי hematopoietic ניתן לקבוע. ניתוח של מחשבי מח העצם והקשר שלהם לתאי סטרומה, אאוזינופילים, תאי B, ומחשבים אחרים מוצגים, כמו גם את התדירות של מחשבים שכנים סוגי התאים בתוך 10 ו -20 מיקרומטר (איור 4 א). בנוסף, קשר התדרים של סוגי תאים שונים hematopoietic עם stroma ניתן לכמת (איור 4).
לפני ביצוע סימולציה של מיצוב מח עצם האקראי של תאים אלה עם כלי הסימולציה, הפרמטרים המתארים את התפלגות גודל התא כGausהפצת סיאן צריכה להיות נחושה. להפצה גאוס, אשר יכול להיות דמיין כעקומה "פעמון" סימטרית ו, רק שני פרמטרים צריכים להיות נחושים: מיקומו של מרכז העקומה (המצב, כלומר, שבו השיא של העקומה ממוקם ) והרוחב של העקומה סימטרית (זה מתואר על ידי פרמטר σ הנ"ל). הליך זה המוצג כאן עבור מחשבים אישיים, אאוזינופילים, ותאי B (איור 5). הפצות גודל תא נמדדו מראות כי, לתאי B, הרוחב של עקומת ההתפלגות שתוארה על ידי σ הוא קטן יותר מאשר למחשבים אישיים ואאוזינופילים. לסימולציה, הערכים היחסי של σ נמדד בשלוש אוכלוסיות התאים נשמרו (כלומר, תאי B היו מדומים תמיד על ידי חלוקת פעמיים צרה כגודל מזה של מחשבים 'ואאוזינופילים'), בעוד שערכי σ המוגדרים בpx היו סט כדי להתאים את המראה החזותי של התאים שנרשמו (איור6 ב). זה הוביל אותנו ליישם σ של 2 px לתאי B וσ של 4 px לשני מחשבים ואאוזינופילים. הפסקת גודל התא נקבעה מהפצות גודל תא שנמדדו. עבור מחשבים אישיים ואאוזינופילים, הפסקת בגודל אובייקט 300 px, וכתוצאה מכך 20 קוטר px לחפץ עגול (כ 7 מיקרומטר) ולתאי B הפסקת ב 220 px, שמוביל לקוטר 17 px (כ 6 מיקרומטר) שימש לסימולציה.
על מנת להגדיר אזורים בתמונה האקראית מדומה שבו תאים מותר להיות ממוקמים על ידי כלי הסימולציה, מסכה נוצרה מאותות גרעיניים בערוץ DAPI של תמונה היסטולוגית מח עצם (איור 6 א). ערך של 10 נקבע לסף העצמה האופטימלי להפקת התמונות בינארי (פנל עליון, תמונה מימין). הסף שנקבע על ידי האלגוריתם של Otsu אינו מוביל להכרה מלאה של כל הגרעינים בתמונה (פנל עליון, תמונה במרכז), באופן דומה לעצמה קבועהספים של 50 או 150 (פנל תחתון, שמאל ומרכז תמונה) .the רלוונטי של אנשי קשר של מחשבים, אאוזינופילים, או תאי B עם תאי סטרומה (איור 4) נבדקה באמצעות כלי סימולציה (איור 7). ניתוח זה חשף שיעורי מגע גבוהים יותר משמעותי בתמונות שתועדו בהשוואה לסימולציה עבור מחשבים אישיים ותאי B (איור 7 א), בקנה אחד עם הרעיון של נישות סטרומה קידום אוכלוסיות אלה. זו אושרה ב5 עכברי chimeric ניאון בודדים (איור 7, D). בניגוד לכך, אין הבדל ברור נקבע במקרה של אאוזינופילים (איור 7 א, ג).
תמונת איור 1. סקירת הקרינה של סעיף אורך של עצם ירך עכברית cryosectioned עם שיטת הקלטת של Kawamoto. השיטה מאפשרת קלטת חיתוךסעיפי g עם אזור endosteal שלם, הן בdiaphyseal כמו גם באזורי epiphyseal, מעצם undecalcified. סעיף עצם עבה 7 מיקרומטר של C57BL / 6 עכבר נאיבי היה מוכתם לחלבון מטריצה תאי Laminin (אדום), לSCA-1 לדמיין arterioles (ירוק) ולגרעינים (כחול, DAPI). 47 אריחים של 1,446 x 1,088 מיקרומטר, ברזולוציה 1,360 x 1,024 px נרשם ותפרו כדי ליצור את תמונת הסקירה. תמונה זו נרכשה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום, עם עדשה אובייקטיבית 10X (0.45 NA). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
זיהוי איור 2. אוטומטי של תאי סטרומה ומח עצם היווצרות הדם. סעיף עצם הירך של צ'י ניאון אדוםעכבר meric ביום 30 אחרי הדחיפה היה מוכתם עבור RFP (אפור) כדי לחזות סטרומה, MBP (אדום, אאוזינופילים), שרשרת κ וλ אור (ירוק, מחשבים) וB220 (כחול, תאי B). משמאל: תמונה מקורית שנרכשה על מיקרוסקופ confocal, באמצעות עדשה 20X אובייקטיבית (0.8 NA) ושדה ראייה של 708.15 x 708.15 מיקרומטר. מימין: תמונה מקוטעת. קווי המתאר של האובייקטים המוכרים מודגשים. המלבנים הלבנים סמנו את השטח שמוצג בתמונות למטה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אישור של ניתוח תמונה האוטומטית על ידי מדרגים מאומנים. שטח כולל של מבני סטרומה ומספרים סלולריים כולל של תאי hematopoietic נספרו על ידי מדרגים הוכשרו באחד (מבני סטרומה) (א), 10 (מחשבים), שני (אאוזינופילים) ותמונה אחת (תאי B) בהשוואה למספרים סלולריים מתקבלים על ידי ניתוח תמונה אוטומטי. נקודות מייצגות מדרגים בודדים (n = 5 - 6). ברים לציין ערכים ממוצעים או ערכים נקבעו באופן אוטומטי. התפלגות גודל אובייקט (B) של אובייקטים נספרים באופן ידני בהשוואה לגודל האובייקט הממוצע נקבע על ידי ניתוח אוטומטי. על מנת להסביר את התדרים השונים של סוגי התאים השונים, מחשבים נספרו ב 10, אאוזינופילים בשני ותאים B בתמונה אחת. נקודות מייצגות אובייקטים בודדים. קווים מצביעים על ממוצע. התוויית ידנית של מבני סטרומה על ידי מדרגים מאומנים (C). משמאל: תמונה מקורית. התיכון: דוגמאות של תמונות ניתחו באופן ידני. מימין:. מבני סטרומה זוהו על ידי ניתוח אוטומטי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
src "איור 4" = "/ קבצים / ftp_upload / 52,544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
ניתוח איור 4. אוטומטי שיתוף לוקליזציה של מחשבים, אאוזינופילים, תאי B ותאי סטרומה במח עצם הירך. (א) משמאל: תדר של מחשבים במגע ישיר עם מבני סטרומה, אאוזינופילים, תאי B או מחשבים אחרים בעכברי chimeric ניאון ביום 30 אחרי הדחיפה. תדר של מחשבים בסביבת 10 מיקרומטר או 20 מיקרומטר קרבת מבני סטרומה, אאוזינופילים, תאי B או מחשבים אחרים: התיכון ותקין. חלקים של נתון זה (מגע ישיר, 10 מיקרומטר סביבה) הם שונה מZehentmeier et al. 9 תדר (B) של מחשבים אישיים, אאוזינופילים ותאי B במגע ישיר עם מבני סטרומה. 52-515 מחשבים, 918-3,179 אאוזינופילים, 4,146-13,063 תאים B ב10-21 תמונות נספרו מ -5 עכברים chimeric ניאון ביום 30 אחרי הדחיפה, נקוו משני ניסויים בלתי תלויים. נקודות מייצגות עכברים בודדים. קווים מצביעים על חציון.: "Target =" //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. קביעת התפלגות גודל תא של מחשבי מח עצם, אאוזינופילים ותאי B. (א) צילום המסך של ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של כלי הסימולציה. התפלגות גודל התא (האזור בpx) (ב) למחשבים (שרשרת κ וλ אור, ירוק), אאוזינופילים (MBP, אדום) ותאי B (B220, כחול) מוצג בהיסטוגרמות כפי שנמדד לאחר הכרת אובייקט על ידי תוכנת Volocity (פנל עליון). בתמונות מח עצם הירך (פנל תחתון), זוהה מחשבים מסומנים באדום (שכבה צהובה), אאוזינופילים ב( סגול כיסוי) הכחול ותאי B בצהוב (שכבה אפורים). סגמנטציה בוצעה על ידי קביעת סף גודל מינימאלי של 180 px עבור מחשבים אישיים,300 px לאאוזינופילים ו -220 px לתאי B. 250 אובייקטים נמדדו למחשב, 650 אובייקטים לאאוזינופילים ו3,000 אובייקטים לתאי B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. דור של המסכה למיקום תא אקראי מדומה. () הערוץ המקורי DAPI (צהוב), כמו גם שכבות של DAPI עם תמונות בינארי שנוצרו על ידי יישום ספים שונים מוצגים. המסכה שנוצרה מהתמונה בינארי (סף מוגדר 10) מוצגת להלן (פנל תחתון, בתמונה מימין). אזורים שחורים מייצגים לא ללכת אזורים, אזורים לבנים מייצגים אזורים שבם תאים מותר להיות ממוקמים. (ב) התמונה המוקלטת (משמאל) והתמונה מדומה המקבילה (מימין) להראות גבוהה חזותיתדמיון. אאוזינופילים (MBP), מחשבים (κ ושרשרת λlight), תאי B (B220) ותאי סטרומה (RFP) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. מגע ישיר של סוגי תאי hematopoietic עם מבני סטרומה בתמונות הדמיה רשמו לעומת. () תדר של מחשבים, אאוזינופילים ותאי B במגע ישיר עם סטרומה בהדמיה בהשוואה לתמונות שתועדו של עכברי chimeric ניאון ביום 30 אחרי הדחיפה. קווים מקבילות מתחברים מדומים ונרשמו תמונות (נקודות). תמונות של עכבר אחד נציג מוצגות בכל חלקה. תדרים (B) של מחשבים אישיים, אאוזינופילים ותאי B במגע ישיר עם סטרומה בהדמיה בהשוואה לתמונות שתועדו 5 עכברים בודדים משני ניסויים בלתי תלויים. מבחן Wilcoxon rank test, שני זנב (מחשבים: *** p = 0.0001; * p = .0371; * p = .0161; p = 0.0012 **; **** p <0.0001; אאוזינופילים: *** p = .0007 ; P = .1055; * p = .0161; p = .4143; *** p = .0007; תאי B: **** p <0.0001; ** p = .0020; p = 0.0005 ***; p = 0.0012 ** ; **** P <0.0001). נקודות מייצגות תמונות בודדות. ברים לציין ממוצע. ערכי P 0.05 נחשבים הבדלים משמעותיים. כוכביות בנתוני מצביעות על ערכי P הבאים: ns: p> 0.05; *: P 0.05; **: P 0.01; ***: P 0.001; ****: P 0.0001. חלקים של נתון זה (מגע ישיר של מחשבים עם מבני סטרומה) משתנים מet al Zehentmeier. 9 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
700 "/>
. איור 8. עבודה מלאה של גישת כימות לתא hematopoietic - אינטראקציות תא סטרומה במח עצם עכברי הגישה מחולקת לשלושה חלקים עיקריים: 1. חלקי מוח עצם עכברי מוכנים ונתונים גולמיים שנאספו על ידי מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר, 2 . הניתוח האוטומטי של התמונות שתועדו והסימולציה של מיקום של תאי מח עצם אקראי מתבצע, 3. ספירת קשר ושכונה המתקבלת מתמונות שתועדו ומדומה הן בהשוואה. הקלט (קבצי תמונה) והפלט (קובץ טקסט) של הניתוח האוטומטי מצויינים בכחול, הקלט (קבצי תמונה) ופלט (קבצי טקסט, לחלופין, קבצי תמונה) של כלי סימולציה מצויינים בירוק. אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות ההתקדמות בשיטות הדמיה אופטיות מודרניות, הניתוח של נתונים היסטולוגית עדיין לעתים קרובות הפריע חוסר הכלים המתאימים כימות ושיטות, או על ידי ניתוח מוטה המתמקדים באזור קטן של עניין. הגישה סינרגיסטי מוצגת כאן משלבת ניתוח תמונה המכסה את האזור כולו מח עצם, פילוח אוטומטי והכרת אובייקט מסוגים שונים hematopoietic וסטרומה תא, ניתוח שיתוף לוקליזציה, ולבסוף כלי אימות של אנשי קשר המתרחשים באופן אקראי-שאינם מסופקים על ידי שמנהג חדש תוכנת סימולציה שנועדה.
היסטולוגיה של כל עצמות כוללים מח העצם הייתה קשה לביצוע בשל צפיפות הרקמה השונה הנמצאת בסעיף אחד - מצד אחד, עצם mineralized מאוד קשה, מצד השני מח השביר מאוד, אשר מקבל שיבש כאשר לחתוך בקלות יחד עם העצם. כחלופה, שיטת הקלטת לחיתוך פרה חלקי עצםented יש כאן 14,15 יתרון שזה מייצב את הרקמה, ובכך מותיר את תחומי endosteal שלמים (איור 1). מלבד היותו עשיר בosteoblasts, אזורים אלה כבר הציעו לשחק תפקיד בתחזוקת תאי גזע 20.
התפקיד המכריע של תאי סטרומה בתהליכים התפתחותיים ותחזוקה סלולרית במח העצם הופך ברור יותר ויותר. עם זאת, הניתוח של תאים הנדירים, שבירים אלה הוכיח להיות קשים משתי סיבות: ראשית, הם קשים לבודד ממח העצם; שני, את מידת ההטרוגניות של אוכלוסיית סטרומה אינה ידועה, ולכן עלול להחמיץ אוכלוסייה חשובה באמצעות סמנים מסוימים שתוארו לתאי סטרומה. השיטה ליצירת מפלצות מח עצם ניאון שימושית לסימן fluorescently ולאחר מכן לנתח את אוכלוסיית תאי סטרומה מח העצם בכללותו. עם זאת, יש לציין כי במיל אלהתאי mesenchymal ce כל מח העצם הם דמיינו, כוללים תאי אנדותל וosteoblasts. זה צריך להילקח בחשבון אם הנתונים מעכברי chimeric כגון מנותח. למרות שיש גם סיכון של תאי hematopoietic ממוצא הנמען ששרדו את הקרינה, תאים אלה בדרך כלל רק לכסות שטח קטן מאוד לכל שדה ראיה בהשוואה לCD45 התורם + תאים, ולכן לא משפיע על הניתוח היסטולוגית 9. ברור, בשיטה זו צריכה להיות משולבת בשלב הבא עם זיהוי ספציפי יותר של אוכלוסיות סטרומה (תת). נכון לעכשיו, הניתוח של תאים אלה נעשה בעיקר על ידי היסטולוגיה בשל הסיבות שהוזכרו לעיל, הטלת מגבלה על מספר הפרמטרים שיכולים להיות מנותח באותו הזמן. הפיתוח רב-פרמטרי הניתוחים במיקרוסקופיה יעזור להתגבר על מגבלות אלה.
במהלך ניתוח תמונה, הפילוח בוצע באמצעות האלגוריתם של Otsu המקורי. בעיקרו של דבר, שיטת thresholding מבוסס אשכולות זו קובעת באופן אוטומטי את סף העצמה להפרדה האופטימלית של החזית (אות) ורקע (רעש) פיקסלים לשתי קבוצות עם הסטייה הסטטיסטית הנמוכה ביותר בערוץ נתון, וכתוצאה מכך תמונה בינארי 17. כאן, השיטה של Otsu הייתה מוחלת על גרסת הלוגריתם הטבעית של התמונה המקורית, כלומר:
תמונת קלט לOtsu = ln (תמונת קלט)
זה עובד טוב יותר עבור תמונות הקרינה מאחר והשיטה של Otsu יכולה לזהות תאים עמומים כרקע. הוספת הפונקציה הלוגריתמית מאפשרת הפרדה טובה יותר של התאים ורקע לשתי מעמדות שונות על ידי האלגוריתם של Otsu. עם זאת, קביעת ערכי סף עוצמה לבדו אינה מספיק כדי לזהות בדיוק אובייקטים בודדים. זה עובד בצורה יעילה כאשר גילוי אובייקטים מופרדים היטב בתמונות, אבל זה לא מספיק כדי תאים בודדים נפרדים הממוקמים בתוך אשכולות. כחלק מסוגי התאים שהיו עניין לנו, כגון אאוזינופילים או תאי B, לעתים קרובות התקבצו יחד ברקמה, הגרעינים שלהם בערוץ DAPI היו מפולחים באמצעות אלגוריתם המבוסס על אשכולות k-המשמעות של ההיסטוגרמה העצמה עם k = 10 21. אלגוריתם פילוח תא העלילה המבריק לפיקסלים הקלושים ביותר (אשכולות ב 10 פחים) וכל הזמן לחפש את ההיווצרות של אובייקטי תא דמוי-. אובייקטים אלה לאחר מכן ניתן יהיו מוגדרים כתאים. כאשר כל הפיקסלים היו בשימוש, הגרעינים וכתוצאה מכך מתרחבים כדי ליצור מסכה שלאחר מכן פנתה לאפיקים האחרים להפרדת אשכול.
יש לציין כי ניתוח זה עובד היטב עבור תאי hematopoietic שהם קומפקטיים, אבל שהוא מוגבל ביחס לתאי סטרומה, כפי שלא ניתן לקבוע את הגבולות של תאים גדולים, התפשטו החוצה אלה בשל החיבור שלהם הרחבות דנדריטים שיוצרות רשת רשתי. לפיכך, ספירת תאים לתאי סטרומהלא ניתן לספק. תיוג תאים בודדים באמצעות כתבי גורל מיפוי תחת שליטתו של יזמי stroma ספציפי יפתור בעיה זו, על פי מה שפורסם לנוירונים (באמצעות "Brainbow" מערכת 22) ולתיוג של תאים דנדריטים זקיקים בבלוטות לימפה 23.
בנוסף להחלת צעד הפחתת רעש לכל הערוצים על ידי לא כולל אובייקטים מתחת ל -30 px, הדרת גודל יושמה בתהליך של זיהוי אובייקט לhematopoietic אבל לא סטרומה תאים. שברים קטנים של תאים שנחתכו על ידי חתך עשוי להיות שלילי; עם זאת, ההפסד יכול להיות מוזנח במקרה זה לטובת הכרה חד משמעית של התאים. הארכת הניתוח וסימולציה משניים לשלושה ממדים יהיה להתגבר על מגבלה זו. פיתוח השיטות ללמוד הפצה סלולרית בכל mounts, למשל, על ידי מיקרוסקופ פוטון רב או מיקרוסקופיה / SPIM גיליון אור, בהחלט לסייע בההוא הכבוד. על מנת ללמוד את הרכב הסלולר המורכב של נישות מרובות רכיבים, זה יהיה גם יהיה צורך להאריך את מספר הפרמטרים הלהיות מנותחים באתר. גישות מבטיחות לניתוח פרמטרים מרובה של מידע היסטולוגית בשילוב עם כימות cytometric פורסמו לאחרונה 24, 25.
הניתוח בוצע על ידי מגע כימותי החפיפה של שני אובייקטים. קשר ישיר הוגדר כחפיפה של פיקסל אחד לפחות. חשוב לציין, ניתוח זה הוא מוגבל על ידי הרזולוציה של תמונות מיקרוסקופיה ולכן תלוי באורך הגל ומצב של עירור, כמו גם על הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית המשמשת במיקרוסקופ, ואת גודל חריר. בניתוח שמוצג כאן, אובייקטיבי 0.8 NA, 20X עם שילובי fluorochrome נרגש עם 488, 561, 594, 633 ננומטר ובאמצעות עירור פוטון אחד יושם. לפיכך, החלטה לרוחב ערכים בין0.372 ו.483 מיקרומטר הושג. זה מאפשר טענות להיעשות על הסמיכות של תת תא שונים; עם זאת, זה לא נותן שום מידע על מנגנונים מולקולריים המשוערת המעורבים באינטראקציות הסלולר. בנוסף, יש צורך בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה intravital 2-פוטון על מנת לשפר את האפיון של אנשי קשר בין תאית אלה 9. מערכות פורסטר תהודת העברת אנרגיה (סריג) מבוססות יכולות לעזור כדי לאשר אם אינטראקציות אלה הן פונקציונליות 26 למעשה.
על מנת להעריך את המיקרו-הסביבה התאית של נישות רקמה, זה לא רק חיוני כדי לנתח את הקשר הישיר תא, אלא גם לכמת את סוגי התאים בשכונה מסוג מסוים של תאים של עניין ("ניתוח הסביבה"). מחקרים שפורסם בעבר נמדדו מרחקים בין תאים ומבני רקמות כגון כלי המבוססים על מיקומו של הגרעין 27. מאז שהיינו מעוניינים בdetermining המרחק של סוגי תאים שונים, בחלק עם משתנה יחסים של גרעין לנפח cytoplasmic, העדפנו למדוד את המרחק בין משטחים. לשם כך, חישבנו את רדיוס הסביבה על ידי קביעת המרחק האיאוקלידי מגבול של תא לאחר המרת הערכים ממיקרומטר px. מרחק אוקלידי הוא המרחק בקו ישר בין שני פיקסלים ויכולים להיות מתואר על ידי הנוסחה 28: 
תאים עם פיקסלים של הגבולות שלהם בתוך מרחק האוקלידית של דוגמא, 10 מיקרומטר מפיקסלים של הגבולות של תא מטרה, נספרים כשכנים תא זה.
במתכונתה הנוכחית, הניתוח קובע רק אם תא הוא קשר או פונה אל תא אחר מאותו הסוג או שונה, ובכך לספק רק כן / לא אפיון ינארי. המספר האמיתי של תאים שקשר עם התא של עניין או ברדיוס מסוים מזה אינו מחושב. הצעד הבא יהיה להאריך את הניתוח הנוכחי באופן שגודל הקבוצה של פנייה או תאי שכנים יכול להיות מזוהה והשוואה בין תאי מטרה שונים מאותו הסוג. זה יוביל למידע נוסף חשוב על הרכב של נישות מח עצם, כגון הנישה ההישרדות לתאי פלזמה במח עצם, שבי תרומה שונה של תאי אבזר hematopoietic כבר דנה 29-33.
אלגוריתמי זיהוי האובייקט היו מותאמים יחד עם המומחים מWimasis באמצעות שירות הפתרון מותאם אישית זמין המסחרית שלהם, והם זמינים לפי בקשה. אפשרות נוספת היא להשתמש בתוכנה זמינה באופן מסחרי לניתוח תמונה, כגון Definiens, Volocity, או Imaris, או תוכנה חופשית כגון CellProfiler.
הכלים פילוח תא וניתוח תמונה האוטומטייםמחדש תוקף על ידי השוואת התוצאות שלהם עם הנתונים מנותחים באופן ידני המסופקים על ידי 6 מדרגי תמונה מאומנים ביחס לשני פרמטרים, כלומר גודל האובייקט ואת מספר התאים באוכלוסיות תאים שונים. כפי שניתן לראות באיור 3, גודל האובייקט הממוצע לתאי hematopoietic (מחשבים, אאוזינופילים, ותאי B) היה דומה בין שני השיטות, עם שונות גבוהות יותר לקביעת גודל ידנית לתאי פלזמה ואאוזינופילים, ככל הנראה בשל הצורה לא סדירה יותר שלהם בהשוואה לתאי B. זיהוי האוטומטי של מספרים סלולריים הניב ערכים מעט נמוכים יותר מאלה שאותרו באופן ידני. יש לציין, הם היו עדיין בטווח של הערכים ידניים במקרה של אאוזינופילים ומחשבים, בזמן שהם היו מתחת לערכים אלה במקרה של תאי B, ככל הנראה בשל ההטרוגניות גבוהה יותר של ביטוי של B220, ששמשה כסמן לתאי B. B220 ידוע להיות במהלך התמיינות תאי B במח העצם מוסדר, ותאי B עם נמוך, כמו גם גבוהה iצביעת ntensity לB220 ניתן לצפות. תאי B עם אותות B220 נמוכים ירד מתחת לסף שימושי, שייתכן שהוביל להרחקה של תאי B המוקדם בשלב. סף נמוך יותר עבור זיהוי האוטומטי עשוי לפתור את הבעיה. לתאי סטרומה, שהם קשים יותר לאתר בשל דנדריטים פחות הקומפקטי, יותר, ומורפולוגיה מתוחה, זיהוי הידני הביא סטיות גבוהות בין מדרגים בודדים. מעניין לציין, כי השטח הכולל הממוצע של סטרומה היה שווה לשטח הכולל נקבע באופן אוטומטי, מצביע על כך שהניתוח מתאים גם כדי לפצות על הטיה פרט על ידי המדרגים. יחדיו, נתונים אלה מראים כי התוצאות האוטומטיות בדרך כלל מייצגות את הערכים הממוצע של ניתוחים ידניים ומתאימות גם להפחתת שונות interrater בניתוח.
כדי להפלות מיצוב של תאים בתוך המגבלות המבניות של הרקמה אקראי ולא אקראי, כלי סימולציה פותחו. משךing הסימולציה, תמונה מלאכותית עם תאי hematopoietic ממוקמים באופן אקראי נוצר עבור כל תמונה היסטולוגית מח עצם שנרשם. ראשית, תמונת ערוץ stroma מנוצלת במתכונתו המקורית. מסכה מופקת מתמונת DAPI על ידי יישום סף מבוסס עוצמה קבועה, ובכך להמיר את התמונה לפורמט בינארי; מסכת ינארי לאחר מכן עוברת שלבים מרובים של התרחבות פיקסל מבוסס ושחיקה. המסכה מגדירה אזורים בשדה התמונה שבו תאים מדומים מותר להיות ממוקמים. הקואורדינטות של המרכזים של התאים מדומים מסופקות על ידי מחולל מספרים אקראי אחיד, הגבולות שבי נקבעים על ידי גודל התמונה. מידע על מספר התא וגודל תא ממוצע לכל אוכלוסייה שנקבעה על ידי ניתוח תמונה אוטומטית של התמונות שתועדו משמש כדי להגדיר את אוכלוסיות תאי hematopoietic מדומה. קוטר התא המדומה הנחה הוא לעקוב הפצת גאוס חד-ממדית שממנו בפועלקוטר תא נבחר באקראי: הקוטר לאחר מכן שונתה כך שגודל התא לחתוך מחיקות לגודל האובייקט המינימאלי המותר הם הציגו. במקרה התא המדומה היה להיות ממוקם כך פיקסל אחד או יותר חופף בשטח לא ללכת או יהיה במרחק מוגדר מראש מתא אחר כבר הניח (4 מיקרומטר ממרכז למרכז, כפי שנקבע בתמונות מוקלטות), קואורדינטות אקראיות חדשות ייבחר תוך הקוטר נשאר ללא שינוי. זה יחזור על עצמו עד שמספרם של תאים מדומים שווה למספר תאים בתמונה המוקלטת.
הכלי היה מבוסס על ההנחה שניתן למקם תאי hematopoietic בחופשיות בתוך מח העצם, ואילו מבני סטרומה לפעול כמטריצה קבועה בתוך הרקמה. הכלי היה מותאם למצב במח העצם שבו אזורי parenchymal מצליבים על ידי מערכת מורכבת של sinusoids. גישה של מודל דומה פורסמה לאחרונה על ידי Frenette ועמיתים לעבודה על מנתלנתח את המיקום של תאי גזע hematopoietic ביחס לתאי סטרומה ומבנים של כלי דם, שהם כ- 30% ממוח עצם הירך הכולל הנפח 25. על מנת לתקן את האפקט הזה, כלי הסימולציה המובאים כאן מבוססים על מסכה של שטחי תאים מותר להיות ממוקם. זו הושגה על ידי שימוש בתמונת כתם גרעיני, שבו האובייקטים המייצגים את הגרעינים הורחבו על ידי התרחבות 5 שלבים (ראה איור 6) לאחר binarization. אזורים עם צפיפות נמוכה סלולרית, כלומר, צפיפות נמוכה של גרעינים כמו עצם וsinusoids, לא יתרמו למסכה ולכן הפכו לא ללכת אזורים. על מנת להימנע מהפחתה מלאכותית של האזורים האסורים בכניסה אלה על ידי הליך התרחבות, שחיקת 5-צעד יושמה לאחר מכן, ובכך לפתוח מחדש אזורי הדרה גדולים יותר, תוך השארת הצפיפות הגרעינית הגבוהה (ומכאן "מותר") אזורים ללא שינוי. שיטה זו ניתן להתאים בקלות לאיברי הלימפה אחרות. באותם tנושאים היו בשיטה זו לא יכולה לעבוד (לדוגמא, באזורים שבם תאים עם יחס ציטופלסמה / גרעין גבוה נוכחים), שיטות אחרות כגון תיוג cytoplasmic ניתן להשתמש כדי ליצור המסכה.
תאי hematopoietic היו מדומים כאובייקטים עגולים הגודל שנקבע על ידי שימוש במחולל מספרים אקראי גאוס, ממוצע שהסכים עם הקוטר הממוצע המחושב של כל סוג תא. הרוחב של ההפצה היה מבוסס על חלוקת גודל תא שנמדדה בתמונות שתועדו כפי שנקבעו על ידי תוכנת ניתוח תמונה. על מנת לקחת בחשבון שברים סלולריים קטנים לא נכללו בניתוח התמונה האוטומטי, גודל התא לחתוך מחיקות הוכנסו כפי שיקבעו מהפצות גודל תא שנמדדו לכל סוג תא (ראה איור 5).
באופן טבעי, זה עובד היטב עבור סוגי תאים שהם אחידים יחסית בגודל ובצורה שלהם, אבל יכול להוביל לבעיות במקרה של תאים שמחדש הטרוגנית מאוד ביחס לפרמטרים אלה. יש לציין כי ניתוח זה הוא מותאם לסוגי תאי hematopoietic במח העצם (גרנולוציטים, אבות hematopoietic ולימפוציטים), שיש להם במשותף שיש להם צורה קבועה, כמעט מעוגלת. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לתאים דנדריטים או מאקרופאגים, סוגי תאים בגוף תא מאוד לא סדיר. תאים כאלה ניתוח יציגו אתגרים חדשים לניתוח התמונה האוטומטי שלנו, כמו גם לגישת הסימולציה, כולל הצורך באלגוריתמים משופרים אשכול תא הפרדת 24, כמו גם צורה-ניתוח מפורט וסימולציה של לא רק תאים בגדלים שונה, אלא גם בצורה שונה. אלטרנטיבה תהיה גישת סימולציה שעובדת עם הצורות המדויקות כפי שנרשם. עם זאת, יש לציין כי שיטה זו תגדיל את ההתנהגות הדטרמיניסטית של מערכת המודל באופן משמעותי.
לexpe המדומהriments, 1000 חזרות של הסימולציה לכל תמונה המוקלטות שנוצרו. באמצעות חזרות רבות זה יקטין את השגיאה היחסית שנתרמו על ידי תהליך הסימולציה עצמו לכ -3%. כלומר, אם ערכי שיתוף לוקליזציה תאי תאים מחושבים מסימולציות שהן אקראיים, אז תהליך הסימולציה עצמה להיות מאופיין על ידי פונקצית שגיאת N -1 / 2, כאשר N הוא מספר סימולציות לכל תמונה שנמדדה. זוהי התרומה על ידי תהליך הסימולציה עצמה לשגיאה המצטברת של ערכי שיתוף הלוקליזציה נמדדו. לפיכך, עבור N = 1,000 השגיאה תרמה היא 3.16%. הסימולציות המוצגות כאן רצו במשך 20 עד 60 דקות לכל תמונה לכל 1,000 חזרות בעת השמירה רק תמונות מדומה כקבצי .rect (פורמט טקסט פשוט) ולא תמונות אמיתיות כמו בפורמט JPEG או .tiff (גם אופציה בתוכנה ).
יחדיו, גישה זו מאפשרת לניתוח תמונה היסטולוגית משוחד, תפוקה גבוההs ומאפשרת את הדור של נתונים רלוונטיים מבחינה סטטיסטית. זה עשוי להיות שימושי בהשוואת לוקליזציה סלולרית בתנאים שונים. יתר על כן, המרכיב הזמני יכול בעתיד להשתלב בגישה של מודל של תנועות תא במח עצם, ככל שיותר נתונים על תנועתיות של תאים מסוגים שונים במוח העצם הופך להיות זמין. שיטה זו יכולה לשמש כדי לדמות הפרעות של המערכת, כגון הגיוס של תאים ממח העצם למחזור הדם, למשל, נויטרופילים במקרה של דלקת חריפה 34. על מנת להבהיר את הפונקציה של מח העצם כמקום אחסון לתאי זיכרון חיסוניים נוסף, אפשר גם לדמיין הארכת מודל התחרות לגורמי הישרדות. כמו כן, crosstalk האפשרי בין נישות שונות ניתן לטפל, כמו גם הגיוס של נישות. יחד, זה יעזור להבין את השינויים הפיסיולוגיים (למשל, מפעיל להתנהגות משובי בתאי גזע) כwell כהפרעות פתולוגיות של המערכת כולה, למשל במקרה של הפרעות אוטואימוניות, neoplasia, או דלקת חריפה. כחלק מקונספט איטרטיבי של ניסוי ודוגמנות, יכולות להיות שנוצרו השערות חדשות המבוססות על הסימולציות, אשר בתורו יכול שוב להיבדק בניסוי, ובכך מסייע להבין את התפקיד ואת האינטראקציה של סוגי תאים שונים בתוך המורכבות של רקמות נוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים אנדריאס רדברוך לדיונים חשובים. אנו מודים לסבין Gruczek, פטריק טימן והמנואלה Ohde לקבלת סיוע בטיפול בבעלי החיים ורוברט גינטר לקבלת סיוע טכני מעולה. אנו מודים המדרגים המיומנים שלנו לורה Oehme, Jannike ביאת-Sarmadi, Karolin Pollok, קתרין רוט, פירנצה Pache וקתרינה הורן להערכת דגימות היסטולוגיה ורנדי Lindquist להגהה של כתב היד. אנו מודים ג 'ונ' לי, Mayo Clinic, סקוטסדייל, אריזונה, ארצות הברית לנוגדני MBP הספציפיים.
עבודה זו נתמכה על ידי DFG HA5354 / 4-1, על ידי ג'ימי-מענק רשת מתקן גרעין DFG למיקרוסקופיה intravital ועל ידי TRR130 / TP17, וDFG ל2,165 (HA5354 / 6-1) לAEHSZ נתמכה על ידי הבינלאומי מקס פלנק בית הספר למחלות זיהומיות ואימונולוגיה (IMPRS-IDI), ברלין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al.
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E.
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
