Abstract
Konfokale Mikroskopie ist das Verfahren der Wahl für die Analyse der Lokalisierung von mehreren Zelltypen in komplexen Geweben, wie Knochenmark. Jedoch ist die Analyse und Quantifizierung der zellulären Lokalisation schwierig, da es in vielen Fällen beruht auf manueller Zählung, wodurch damit das Risiko der Einführung einer Bewerterabhängigen Bias und Verringerung Interraterreliabilität. Darüber hinaus ist es oft schwierig, ob die Co-Lokalisation von zwei Zellen ergibt sich aus beliebiger Positionierung beurteilen, insbesondere wenn die Zelltypen unterscheiden sich stark in der Häufigkeit ihres Auftretens. Hier wird ein Verfahren zur Quantifizierung der zellulären unvoreingenommene Kolokalisation im Knochenmark eingeleitet. Das Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung zur histologischen Schnitten der gesamten murinen langen Knochen wie dem Knochenmark zu erhalten, sowie die Färbungsprotokoll und den Erwerb von hochauflösenden Bildern. Eine Analyse Workflow spannt sich von der Anerkennung der blutbildenden und nicht-Hematopoietic Zelltypen in 2-dimensionale (2D) Knochenmark Bilder in der Quantifizierung der direkt zwischen diesen Zellen präsentiert wird. Dies beinhaltet auch eine Nachbarschaftsanalyse, um Informationen über die zelluläre Mikroumgebung eines bestimmten Zelltyps zu erhalten. Um zu bewerten, ob die Co-Lokalisierung von zwei Zelltypen ist das bloße Ergebnis zufälliger Zellpositionierung oder reflektiert bevorzugte Verbindungen zwischen den Zellen, ein Simulationswerkzeug, das für die Prüfung dieser Hypothese im Falle von hämatopoetischen sowie Stromazellen, ist verwendet. Dieser Ansatz ist nicht auf die Knochenmark beschränkt und kann auf andere Gewebe verlängert werden, um reproduzierbare quantitative Analyse der histologischen Daten ermöglichen.
Introduction
Aufgrund der jüngsten schnellen technologischen Entwicklungen in der Mikroskopie, einschließlich optischer Bildverarbeitung, ist die Analyse von Zellen im Rahmen des gesamten Gewebes für Immunologen immer zugänglich. Die Charakterisierung der einzelnen Zellen in Suspension eine wertvolle und unverzichtbare Methode, um zelluläre und molekulare Funktion zu verstehen. Jedoch ist die Analyse der Zellen in ihrem (Mikro-) -anatomical Umgebung wesentlich für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, die in komplexen Prozessen zusammenarbeiten wie die Entwicklung von Immunantworten.
Während es relativ einfach für Mikroskopikern qualitative Informationen aus Bildern erhalten bleibt es eine Herausforderung, diese Daten zu quantifizieren, teilweise aufgrund der Tatsache, dass die Analyse-Methoden in diesem Bereich hinter Vergleich zu dem, was in der Bildaufnahme möglich zurückbleibt. Viele Forscher verlassen sich immer noch auf zeitraubende manuelle Zellzählung in der Histologie Bilder,damit die Einführung einer Vorspannung zwischen verschiedenen Rater und behindern die Replikation von anderen Gruppen. Oft wird ein repräsentatives Bild gewählt, um eine Aussage über zelluläre Position oder Co-Lokalisation in einer Publikation zu unterstreichen, dass es schwer für den Leser auf die statistische Relevanz eines solchen Ereignisses zu beurteilen.
Zusammen mit der Tatsache, dass das volle Informationsgehalt der Bilddaten wird nur selten genutzt, unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine unvoreingenommene, schneller und umfassender Ansatz zur histologischen Bilder analysieren.
Das Knochenmark ist ein komplexes Gewebe, die auf wichtige Lebensfunktionen als Organ der Hämatopoese bei erwachsenen Wirbeltieren findet. Abgesehen davon, dass der Geburtsort für hämatopoetische Zellen 1,2 und spielen eine wichtige Rolle in B-Lymphozyten-Entwicklung 3, wirkt es auch als ein Ort, an dem Immunreaktionen ausgelöst werden 4 und unterstützt reifen, rezirkulierenden B-Zellen 5. Zusätzlich ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung immunological Speicher wird zunehmend in den letzten zehn Jahren geschätzt, weil verschiedene Arten von Zellen Immungedächtnis bilden haben sich dort aufzuhalten, 6-9.
Die Beziehung zwischen der komplexen Gewebearchitektur des Knochenmarks und seine Funktionen nach wie vor schwer. Im Gegensatz zu sekundären lymphatischen Organe, die in Makro Fächer wie T- und B-Zell-Zonen organisiert sind, fehlt dem Knochenmark eine klare Makro Kompartimentierung. Bisher getrennte Kompartimente im Knochenmark sind durch ihre Nähe zu der Knochenrinde bzw. an Vaskulatur definiert. Die Bedeutung der verschiedenen resident stromalen Zellpopulationen im Knochenmark für eine Reihe von Prozessen, wie Stütz Stammzellen, die Entwicklung von B-Zellen oder die Wartung von Gedächtnis-Immunzellpopulationen (wie langlebige Plasmazellen (PCs), CD4 + und CD8 + Gedächtnis-T-Zellen), zeigt deutlich, dass es einen gewissen Grad von Mikro-Kompartimentierung im Knochenmark.
Es ist noch nicht klar, inwieweit diese Nischen gemeinsame Merkmale hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen composition, und welche Elemente machen eine bestimmte Nische einzigartig. Neben Stromazellen wurden hämatopoetischen Zelltypen wurde gezeigt, dass eine entscheidende Rolle, indem sie bestimmte Signale zumindest für einige der Nischen spielen. Offensichtlich ist die Komplexität der Nische Zusammensetzung erfordert deren Analyse in situ, und es wird immer wichtiger für Immunologen und Hämatologen zum Vergrößern auf das Knochenmark-Mikroarchitektur, zum Beispiel durch die Analyse der räumlichen Beziehungen zwischen ihren zellulären Komponenten.
Hier wird eine Strategie, um zelluläre Kolokalisation und Nachbarschaftsbeziehungen im Knochenmark in einem automatisierten und unvoreingenommene Weise zu quantifizieren wird vorgestellt. Eine detaillierte Arbeitsablauf einschließlich der Erzeugung von chimären Mäusen, Beherbergung Fluoreszenz Stromazellen und nichtfluoreszierenden hämatopoetischen Zellen, Herstellung von histologischen Schnitten von entkalkte Knochen, Akquisition von konfokalen Bildern, die den gesamten Knochen, sowie die automatische Bildanalyse der zellulären co-Lokalisierung und dessen Validierung / Diskriminierung aus zufälligen Positionierung durch ein Simulationstool zur Verfügung gestellt (Abbildung 8).
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Protocol
Die Tierversuche wurden von den zuständigen staatlichen Komitees für Tierschutz (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) zugelassen und wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften (Tierversuch Lizenz G0194 / 11) durchgeführt.
1. Erzeugung von Fluoreszenz-Knochenmark-Chimäre Mäuse
HINWEIS: Die Erzeugung von Fluoreszenzknochenmark chimäre Mäuse zu Knochenmarkstromazellen visualisieren ausgeführt wie zuvor 9 beschrieben.
- Starten Sie die Behandlung von Del-Cre x ROSA-tdRFP Mäusen (Mäusen Tandem rot fluoreszierendes Protein (tdRFP) ubiquitär 11-13 Ausdruck), um sie für die Bestrahlung vor. Alternativ können Sie auch eine andere Sorte mit ubiquitäre Expression des fluoreszierenden Proteins. Verabreichen 1 mg / ml Neomycin und 1 mg / ml von Vitaminen (A, D3, E, C) über das Trinkwasser zwei Tage vor der Bestrahlung.
- Bestrahlen Mäuse zweimal mit 3,8 Gray mit einem Cäsium-137 Gamma-Strahler widünn ein Intervall von 3 Stunden. Hierzu legen Mäusen in einer Bestrahlungs pie Käfig für den jeweiligen Bestrahlungs.
HINWEIS: Bei der Bestrahlung von Mäusen, unser Institut keine Narkose. Befolgen Sie die lokalen institutionellen Richtlinien bezüglich Anästhesie für die Bestrahlung. Behandeln Tiere mit 5 mg / kg von Carprofen subkutan (sc) am Tag nach der Bestrahlung, wenn Anzeichen von Schmerz. - Am nächsten Tag rekonstituieren Mäuse durch intravenöse Injektion von 3 x 10 6 Knochenmarkszellen von Röhrenknochen von C57BL / 6-Spendermäuse in Transferpuffer 9 hergestellt. Halten Sie die Maus auf Neomycin und Vitamine für bis zu 2 Wochen und ihr Wohlbefinden und das Gewicht in dieser Zeit zu überwachen. Warten Sie mindestens 4 Wochen bis zur Wiederherstellung des Immunsystems, bevor die spezifischen experimentellen Behandlungen ermöglichen (zB Impfungen) 9.
- Sacrifice Mäusen und legen Sie sie auf einer Dissektion Bord, sterilisieren die Beine mit 70% Ethanol. EuthanizE-Mäuse gemäß den örtlichen Institutionelle Politiken. Unser Institut führt Genickbruch.
- Verwenden einer Pinzette und Schere, um die Haut von den Oberschenkeln zu entfernen. Entfernen Muskelgewebe um die Oberschenkelknochen aus. Luxieren die Oberschenkelknochen von der Hüfte und Kniegelenk mit einer Pinzette und Schere. Achten Sie darauf, nicht zu brechen oder schneiden Sie die Knochen.
- Entfernen Sie vorsichtig verbleibende große Stücke von Muskelgewebe und Knorpel vom Knochen mit einer Schere. Entfernen Sie verbleibende Muskelgewebe durch Reiben der Knochen mit Laborseidenpapier. Sammeln der gereinigten Knochen in einer Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Fix gesamten Femurknochen in 4% Paraformaldehyd (PFA, Elektronenmikroskopie-grade) für 4 - 6 Stunden.
- Entsorgen PFA und Inkubation Knochen in 10% Saccharose in PBS O / N. Am nächsten Tag, brüten die Knochen in 20% Saccharose O / N. Der Tag nach, brüten die Knochen in 30% Saccharose O / N.
2. Kryoschneiden of Bones
HINWEIS: Nach der 16-24 h in 30% Saccharose, einfrieren Knochen und Kryoschnitt sie nach Kawamoto der Bandmethode 14,15.
- Bereiten Sie einen großen Becher (2000 ml Volumen) mit Trockeneis und Aceton (etwa 2: 1 Volumenverhältnis, beispielsweise 400 ml trockenem Eis und 200 ml Aceton) unter einer Abzugshaube. Setzen Sie einen kleinen Becher (150 bis 250 ml Volumen) mit Hexan innen (30 - 50 ml ungefähr). Warten für die Mischung abkühlen (etwa 10 min, bis zum Frost an der Außenseite des großen Becher erscheint).
- Füllen ¾ des markierten cryomold Super Cryoembedding Medium (SCEM); Legen Sie das Knochen im Inneren, bis sie vollständig eingetaucht, wobei darauf geachtet, dass sie die Kanten der Form nicht berühren. Mit großen Zange halten Sie die cryomold in das Becherglas mit dem Boden der Form nur an der Oberfläche des Hexan berühren.
- Lassen die Außenkanten der SCEM Kühlschrank (durch Opazität deutet erfolgt dies etwa 15 sec). Dann die Form vollständig Drop in das Hexan und lassen Sie es freeze mit 1 - 2 Min. Nehmen Sie die gefrorene Probe und wickeln in Zellophan und Aluminiumfolie (die Probe vor dem Austrocknen zu schützen und Lichteinwirkung zu vermeiden). Lagerung bei -80 ° C bis Kryoschneiden.
- Für Kryoschneiden der Oberschenkelknochen mit einem Standard-Mikrotoms und Mikrotomklingen für Hartgewebe.
- Die Sample- und Schaufeltemperatur des Mikrotoms bis -24 ° C. Lassen Sie die Probe im Inneren des Mikrotoms sich für etwa 15 Minuten vor dem Schneiden.
- Befestigen Sie den Probenblock mit dem Metallprobenhalter mit SCEM oder optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium. Passen die Ausrichtung des Blocks, falls notwendig. Schneiden Sie die Probe, bis der Knochen vollständig geöffnet ist und das Mark zu sehen ist. Stellen Sie die Schnittdicke bis 7 um (verwerfen den ersten Abschnitt).
- Befestigen Sie ein Stück von Kawamoto Band mit der Klebeseite auf der Oberseite des Probenblocks mit einer Rotwild lederbezogenen Holzspachtel. Anschließend schneiden Sie die Probe, und schalten Sie das Band, so dass der Abschnittauf der Oberseite positioniert. Übertragen Sie das Band auf einem Objektträger mit einer Pinzette. Bringen Sie das Klebeband auf dem Objektträger mit Klebeband.
- Lassen Abschnitte trocken für mindestens 30 Minuten und speichert sie bei -80 ° C bis zur Verwendung. Bewahren ungefärbten und post Folien in Kunststoffschieber Boxen mit Abstandshalter zwischen den einzelnen Folien, um zu vermeiden, dass sie zusammenhalten. Stained und Dias können bis zu einer Woche im Karton Dia Ordner bei 4 ° C gelagert werden.
3. Bildsammlung
- Tauen und schmutz Kryoschnitte nach gemeinsamen Immun Protokolle 9. Umfassen eine Kernfärbung, beispielsweise, 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI), um die Gewebeintegrität zu visualisieren.
Hinweis: Beize, beispielsweise zur RFP Stromazellen (anti-RFP-Biotin-Antikörper und Streptavidin-Alexa Fluor 555), Flecken Eosinophilen mit Ratten-Anti-major basic protein (MBP) Antikörper und Anti-Ratten-Alexa Fluor 647-Antikörper zu visualisieren , B-Zellenmit Ratten-anti-B220-Alexa Fluor 594-Antikörper und PCs mit Anti-κ-Leichtkette-Fluorescein-iso-thiocyanat (FITC) und Anti-λ1 leichte Kette-FITC-Antikörper (Details des Färbungsverfahren sind in 9 beschrieben). - Montieren gefärbten Schnitten: setzen Sie einen Tropfen Fluoromount auf der Strecke und dann die Abdeckung mit einem # 1 Deckglas, wobei eine klare die Bildung von Luftblasen. Anschließend durchführen Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie mit einem Instrument mit Laserlinien für die Färbung ausgestattet.
- Um Bilder zur automatisierten Co-Lokalisation von Knochenmark hämatopoetischen Zellen mit Stromazellen mit dem Wimasis Werkzeug, gelten die folgenden Einstellungen auf:
- Verwenden Sie eine 20-fach Objektiv und ein Sichtfeld von 708,15 x 708,15 & mgr; m. Für automatisierte Analyse, halten Sie die Größe aller Bilder konsistent 2048 x 2048 Pixel (px), um die Ergebnisse vergleichbar zu halten.
- Nehmen einen Kanal für Stromazellen Strukturen (zB (zB DAPI, 405 nm) und zusätzliche Kanäle für die hämatopoetischen Zellen von Interesse (zB 3 Kanälen 488/594/633 nm für Eosinophile, B-Zellen und PCs).
- Nehmen Sie Bilder mit Hilfe Linie durchschnittlich 4 16. Idealerweise decken die gesamte Oberschenkelbereich, indem sie einzelne nebeneinander liegende Bilder. Alternativ können Sie auch nicht benachbarte Bilder aus verschiedenen Regionen des Knochenmarks (diaphysären sowie Epiphyse).
HINWEIS: Achten Sie darauf, Überschneidungen zwischen benachbarten Bilder (zum wiederholten Analyse von Zellen in den Überlappungsbereichen zu vermeiden) zu produzieren.
- Speichern Sie die Bilder in einem Mikroskopie-Bilddateiformat. Überprüfen und, wenn nötig, passen Sie den Kontrast für alle Kanäle in der Bildanzeige / Analyse-Software.
- Export 3 JPG-Dateien pro Bilddatei: eine JPG-Datei für die DAPI-Kanal (Rot / Grün / Blau (RGB) Format, falsche Farbe in gelb codiert), einer JPG-Datei für das Stroma Kanal (Graustufen) und einer .jpg Datei mitdie Kanäle für blutbildenden Zellen (3 Kanäle maximal, RGB-Format, zB FITC (PCs, falsche Farbe: grün) / Alexa Fluor 594 (B-Zellen, falsche Farbe: blau) / Alexa Fluor 647 (Eosinophilen, falsche Farbe: rot)) .
4. Automatisierte Bildanalyse
- Verwenden Sie ein Bild-Analyse-Tool zur Bildsegmentierung, Quantifizierung von Co-Lokalisation und Nachbarschaftsanalyse (siehe Diskussion) durchzuführen.
- Bei Verwendung der Wimasis Werkzeuge, wie folgt vorgehen:
- Laden Sie die Gruppen von 3 JPG-Dateien pro Bild mit dem gleichen Dateinamen, gefolgt von einem Unterstrich und einer Zahl, die die Art des Bildes.
- Verwenden _1 für die JPG-Datei mit blutbildenden Zellen, _2 für die JPG-Datei für die DAPI-Kanal, _3 für die JPG-Datei für das Stroma-Kanal. Zum Beispiel: Image1_1.jpg (blutbildenden Zellen), Image1_2.jpg (DAPI-Kanal) und Image1_3.jpg (Stroma-Kanal). Laden Sie die Bilder über das Kundenkonto.
- Für Zellkontakt Quantifizierungwählen Sie die Zell-Kontakt-Tool, indem Sie auf das entsprechende Feld. Für Zell Nähe Quantifizierung, wählen Sie die Zelle Nähe Werkzeug und geben Sie die bevorzugte Umgebung Radius um (die aus den Zellen "Kanten gemessen wird).
- Laden Sie die Ergebnisse.
HINWEIS: Die Ergebnisse werden als JPG-Dateien, die die blutbildenden Zellen und die Stroma-Kanal mit den Grenzen der erfassten Objekte hervorgehoben, ebenso wie einzelne CSV-Dateien, die die Messwerte für jedes Bild auf eine Zusammenfassung zur Verfügung gestellt, die neben CSV-Datei, enthält die Daten für alle hochgeladenen Bilder.
- Von der Kontaktmessungen bestimmen die Frequenz der hämatopoetischen Zellen (rote, grüne oder blaue Zellen) in Kontakt mit Stromazellen oder die Frequenzen der roten, grünen oder blauen Zellen Inkontaktbringen der anderen hämatopoetischen Zelltypen (ein Beispiel ist in Repräsentative Ergebnisse gezeigt , Abbildung 4). Um die Frequenzen zu bestimmen, teilen Sie die angegebenen Kontaktdaten Zählungen pro Bild durchdie Gesamtzellzahlen pro Bild.
- Für Experimente mit einzelnen Mäusen, fassen die Gesamtkontaktzahl aller Bilder für die einzelnen Mäuse und teilen sie durch die Summe der Gesamtzellzahl aller Bilder.
- Aus der Umgebung Messungen bestimmen die Frequenz der roten, grünen oder blauen Zellen in der ausgewählten Entfernung von Stromazellen und / oder der Frequenzen der roten, grünen oder blauen Zellen in der bevorzugten Nähe zu den anderen hämatopoetischen Zelltypen, wie in Schritt 4.3 beschrieben ( siehe auch Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4).
5. Simulation von Zufallsknochenmarkpositionierung
- Vor der Ausführung der Simulation von zufälligen Zellpositionierung auf den analysierten Knochenmark histologische Bilder, bereiten Sie die folgenden Dateien im Voraus: die einzigen CSV-Dateien, die vom Zellkontakt-Tool, den ursprünglichen JPG-Dateien für die DAPI-Kanal und den ursprünglichen JPG-Dateien zur Verfügung gestellt für die Stroma-Kanal.
- Zur DurchführungBatch-Simulationen auf einer Reihe von Bildern (zB alle Bilder von einer Oberschenkelbereich), sammeln Sie alle Original-JPG-Dateien (_1, _2 und _3) und die entsprechenden einzelnen CSV-Dateien in einem Ordner.
HINWEIS: Das Simulationstool für zufällige Knochenmarkzellpositionierung ist auf Anfrage erhältlich. - Starten Sie das Simulationswerkzeug, das Kontrollkästchen "Auto-Load-Bilddaten".
HINWEIS: Das Programm wird die Zellzahl und durchschnittliche Zellgröße von der CSV-Datei automatisch gelesen. Diese Werte werden in den Feldern für "Die Zellzahl" und "Zellgröße AVG" (5A) angezeigt. - Geben Sie den gemeinsamen Tag für die CSV-Dateien, dh der gemeinsame Faktor in ihrem Namen. Geben Sie die Anzahl der Bilder, die für die im Batch-Verfahren Simulation verwendet werden sollen.
- Laden Sie die vom Stroma Kanal erzeugt JPG-Datei (mit Dateiname endet _3).
- Geben Sie die Einstellungen zur Erzeugung der Maske von der DAPI-Kanal:
- Markieren Sie das Kästchen "? Die Maske "Stellen Sie den Schwellenwert für die Umwandlung der DAPI-Bild in ein binäres Masken bis 10 (0 - 255).
- Markieren Sie das Kästchen "8-bit?" Das Kontrollkästchen "Dilate?" Und stellen Sie den Grad der Erweiterung um 5 Pixel. Aktivieren Sie das Feld "w / Erosion?".
- Der gewünschte Wert für die Umgebung Radius (Nachbarschaft Radius) zur Analyse der simulierten Bildern verwendet. Für ein Bild von 708.15 x 708.15 & mgr; m mit einer Größe von 2.048 x 2.048 Pixel (Pixelskalierung xy: 0,346 um), 29 Pixel entsprechen 10 & mgr; m.
- Kontrollkästchen "Otsu?", Um Otsu-Algorithmus 17 für die automatische Erkennung von Stroma-Strukturen verwenden.
Anmerkung: Dies ist das gleiche Algorithmus, der durch die Kontaktregion Werkzeug verwendet wird. Unter Verwendung des gleichen Bildsegmentierungsalgorithmus in der automatisierten Analyse der aufgezeichneten Bild und dem simulierten Bild ist, um die Daten vergleichbar zu halten entscheidend. - Geben Sie die Einstellungen für die blutbildenden Zellen, die are als Kreisformen simuliert.
HINWEIS: Die Zellzahlen für Rot, Grün und Blau Zellen direkt aus der CSV-Datei geladen wird (siehe auch Schritt 5.6).- Verwenden Sie das Simulations-Tool, um den mittleren Durchmesser in Pixel des roten, grünen und blauen Zellen zu berechnen. Bestimmung der durchschnittlichen Fläche einer einzelnen Zelle als die Gesamtfläche jedes Zelltyps in dem Bild in Pixel geteilt durch die Gesamtzellzahl pro Bild. Verwenden des Durchschnittsfläche, um den Radius einer Scheibe unter Verwendung der Formel berechnet werden. Verdoppeln des Radius, um den Durchschnittsdurchmesser zu bestimmen.
- Messung der Zellgrößenverteilung der untersuchten Zelltypen bei jedem der Bildanalyse-Software, die Objektsegmentierung Funktionen umfasst. Bestimmen σ für alle hämatopoetischen Zelltypen (18 und 5B).
Anmerkung: Da die Zellgrößenverteilung der aufgenommenen Zellen werden nicht durch die automatisierte Bildanalyse bestimmt, mit einem Gauß-Verteilung als eine Annäherung an die realen Verteilungen. Die Breite ter Verteilungskurve wird durch σ beschrieben und kann ziemlich unterschiedlich für verschiedene Zelltypen sein. (Weitere Einzelheiten finden Sie 5B).- Aus diesen Messungen bestimmen die "Zellgrße Cutoff": den Durchmesser in Pixel, die das kleinste Objekt noch als komplette Zelle durch das Bildanalysewerkzeug erfasst beschreibt.
- Eingeben von Parametern in die entsprechenden Felder auf der grafischen Benutzerschnittstelle (5A).
- Geben Sie die Zellgröße abgeschnitten, dh die minimale Zellgröße in der Simulation erlaubt, als Durchmesser in Pixel.
- Geben σ in Pixel für die Simulation der Zellgrößenverteilung für Rot, Grün und Blau-Zellen (aus Schritt 5.9).
- Überprüfen Sie die "Löschen" Box in der Unterabschnitt "Cells in Mask". Bei dieser Einstellung wird das Programm eine neue Position für eine Zelle ausgewählt, wenn sie mit mindestens einem Pixel mit einem Sperrgebiet der Maske überlappt. Markieren Sie das Kästchen "Vermeiden Zelle überlappen? ̶1; im Unterabschnitt "Zell Ausgrenzung".
- Geben Sie den zulässigen Mindestabstand zwischen den Zentren von zwei Zellen in Pixel.
HINWEIS: Der Mindestabstand muss von den aufgezeichneten Bildern bestimmt werden. Falsch gemessene Mindestabstände werden zu verzerrten / Kunst Ergebnisse für den Vergleich der aufgezeichneten und simulierten Bildern führen. - Stellen Sie die maximale Überlappungsbereich auf 100%, wenn die Überlappung durch den minimalen Abstand von Mitte zu Mitte definiert.
- Stellen Sie den Simulationstool zu 1.000 Wiederholungen.
- Aktivieren Sie das Feld "Autosave-Zellen?", Um die Koordinaten der simulierten Objekte für alle Wiederholungen jeder Bild der Charge als .rect Dateien (Text Format) speichern. Aktivieren Sie das Feld "Autosave Bild?", Um eine TIFF-Datei für jeden simulierten Bild zu speichern. Geben Sie einen gemeinsamen Tag für die gespeicherten Dateien.
HINWEIS: Die "? Autosave-Zellen" Option reduziert Simulationslaufzeit und die Gesamtdatenmenge im Vergleich zu beim Speichern des tatsächlichen simulierten images. Die .rect Dateien speichern die Koordinaten der simulierten Zellen als Rechtecke und kann so in simulierte Bilder bei Bedarf umgesetzt werden.
- Starten Sie die Simulation, indem Sie auf "Run Simulation".
HINWEIS: Das Simulationstool generiert automatisch eine CSV-Datei für die 1000-Simulationen von jedem Bild, darunter die durchschnittliche Kontaktzahlen und Umgebung zählt für rote, grüne und blaue Zellen mit roten, grünen, blauen und Stromazellen für jeden Satz wiederholte Simulationen . Zusätzlich wird für alle diese Werte Durchschnittswerte der 1.000 Simulationen mit Standardabweichung (STD) und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) vorgesehen sind. - Bestimmen Sie die durchschnittliche Kontaktfrequenzen und Umgebung Frequenzen von einem Satz von 1000 simuliert Bilder. Dazu teilen Sie die durchschnittliche Kontakt und Umgebung zählt durch die aufgenommenen Zellzahl pro Bild. Vergleichen der Frequenzen zu den Ergebnissen des automatisierten Kolokalisation Analyse des aufgezeichneten Bildes.
- Tragen Sie geeignete statistical Methoden abhängig von der Analyse 19 (für 7 haben wir ein zweiseitigen Wilcoxon-Test).
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Representative Results
Schneid Kryoschnitte nichtentkalkter Knochen mit der Kawamoto Band-Methode ermöglicht schneiden den ganzen Knochen zu werden als intakte Abschnitt, mit dem Knochenmark des endostalen Region noch mit dem mineralisierten Knochen befestigt, die beide in der Diaphyse sowie in den Epiphysen Gebiete mit ihren hohe Dichte von trabekulären Knochen (Abbildung 1). Kernfärbung der Abschnitte zeigt, dass, obwohl kleine Risse in der Herstellung nicht vollständig vermieden werden können, die Struktur der Sinusoide und Arterien sowie die retikuläre Netzwerk des Parenchyms intakt bleibt.
Als ein Beispiel für eine Immunfluoreszenz-Färbung von rot fluoreszierenden chimären Knochenmark und seine nachfolgende Analyse wird eine Färbung für Eosinophile (major basic protein, MBP), PCs (κ und λ-Leichtkette) und B-Zellen (B220) dargestellt ist. Mäuse wurden mit 100 & mgr; g von 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Haptens an Hähnchen γ-Globulin (NP-CGG) in Alaun ip gekoppelt, 4 Wochen nach der immunisiertenRekonstitution steigerte mit 50 ug NP-CGG in PBS iv 21 Tage später und nach dem Boost analysiert am Tag 30. Die automatisierte Bildanalyse ergab eine sehr genaue Erkennung der Stromazellen Strukturen, einschließlich auch sehr kleine Fragmente von retikulären Prozesse. Da die Zellzahl von Stromazellen können nicht mit dem hier vorgestellten System bestimmt werden (siehe auch Diskussion) wurde keine Größenschwelle stromalen Kanal eingeführt, um alle Bruchstücke in den Bildern zu erkennen (Abbildung 2). PCs und Eosinophilen sind größer als B-Zellen und zeigen auch eine heterogene Form. Alle drei Zelltypen sind gut auf den ersten Blick erkennen. Mobilcluster, insbesondere von B-Zellen wurden auch getrennt. Das Analysewerkzeug für die oben genannten Zelltypen (Eosinophile, PCs, B-Zellen) optimiert. Für andere Zelltypen, könnten Anpassungen erforderlich sein. Die CSV-Dateien, die vom Zellkontakt-Tool generiert enthalten die folgenden relevanten Messungen für blutbildenden Zellen:Zellzahl für jede Zellpopulation; Gesamtfläche für jeden Zellpopulation in Pixel; Kontakt Zählung der roten Blutkörperchen (in diesem Fall Eosinophilen), Grün-Zellen (hier PCs) oder blauen Zellen (hier B-Zellen) mit roten, grünen, blauen oder grauen Zellen (Stromazellen). Die CSV-Dateien von der Zelle Nähe Tool generiert enthalten die folgenden Messungen für blutbildenden Zellen: Zellzahl für jede Zellpopulation; Gesamtfläche für jeden Zellpopulation in Pixel; Nähe Anzahl der roten, grünen und blauen Zellen mit roten, grünen, blauen und grauen Zellen (Stromazellen).
Um die Qualität der Bildanalysetools zu validieren, wurden die Ergebnisse der automatischen Analyse der einer manuellen Zählung von 6 geschulten Beurteilern (Figur 3) verglichen. Alle Rater erhalten identische Bilder für die Analyse. Stroma-Strukturen und blutbildenden Zellen wurden vorsichtig mit einem Bildanalyse-Tool beschrieben und diese Bereiche von Interesse wurden gespeichert und analysiert. Für Stroma-Strukturen, die Gesamtfläche pro Bildwar im Vergleich zwischen automatisierte und manuelle Analyse. Stromazellen Strukturen schien schwierig für den geschulten Beurteilern genau erkennen, wie die große Varianz für die Größe der Gesamtfläche der Stroma manuell gezählt (3A) beobachtet reflektiert. Hier bestimmt die automatisierte Analyse einen Wert nahe dem von geschulten Beurteilern erkannt durchschnittliche Fläche. Für alle Zellen, bestimmt die automatisierte Analyse-Tool eine etwas geringere Menge an Zellen als manuell gezählt. Für PCs und Eosinophilen, war die Zahl noch im Bereich von für die manuellen Zählungen beobachtet Interrater Varianz. Die Anzahl von B-Zellen durch automatisierte Analyse nachgewiesen, war jedoch etwas unterhalb dieses Bereichs (3A). Das durchschnittliche Zellgröße (Fläche in Pixel), wie durch die automatisierte Analyse bestimmt 512 Pixel für PCs, 436 Pixel für Eosinophilen und 317 Pixel für B-Zellen, während geschulte Rater bestimmt eine Größe von 515 Pixel für PCs, 464 Pixel für Eosinophilen, und 291 Pixel für B-Zellen. Somit ist die durchschnittliche cell Größe für B-Zellen, PCs und Eosinophile durch die automatisierte Analyse bestimmt wurde, war vergleichbar mit der durchschnittlichen Zellgröße durch manuelle Beurteilern (3B) bestimmt. Dieser automatisierte Bildanalyse-Tool kann nun verwendet werden, um den direkten Kontakt von Kandidatenknochenmarknische Zelltypen zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Häufigkeit von Zellen eines bestimmten Zelltyps benachbarten Stromazellen oder anderen hämatopoetischen Zelltypen bestimmt werden. Eine Analyse von Knochenmarks PCs und ihre Kontakte zu den Zellen, Eosinophile, B-Zellen, Stromazellen und andere PCs angezeigt wird, als auch die Frequenz des PCs benachbarten diese Zelltypen innerhalb von 10 und 20 & mgr; m (4A). Zusätzlich können die Kontakt Frequenzen verschiedenen hämatopoetischen Zelltypen mit Stroma quantifiziert werden (4B).
Vor der Durchführung einer Simulation Zufallsknochenmark Positionierung dieser Zellen mit dem Simulationsprogramm, die Parameter, die die Zellgrößenverteilung beschreiben als Gaussian Verteilung müssen festgelegt werden. Für eine Gauß-Verteilung, die als symmetrische und "glockenförmige" Kurve dargestellt werden kann, müssen nur zwei Parameter bestimmt: die Position der Mitte der Kurve (der Modus, dh, wo die Spitze der Kurve befindet, ) und der Breite des symmetrischen Kurve (dies wird durch die oben erwähnten Parameter σ beschrieben). Dieses Verfahren wird hier für PCs, Eosinophilen und B-Zellen (5B) dargestellt. Gemessene Zellgrößenverteilungen zeigen, daß für B-Zellen, die kleiner als für PCs und Eosinophilen ist die Breite des von σ beschriebenen Verteilungskurve. Bei der Simulation wurden die relativen Werte von σ für die drei Zellpopulationen gemessen aufrechterhalten (dh B-Zellen wurden stets durch einen doppelt so engen Größenverteilung als die von PCs und Eosinophilen 'simuliert), während die Werte σ in px definiert sind Set, um das Erscheinungsbild der aufgenommenen Zellen überein (Abbildung6B). Dies führte uns zu einem σ von 2 Pixel für B-Zellen und eine σ von 4 Pixel für PCs und Eosinophilen anzuwenden. Die Zellengröße Cutoff wurde aus den gemessenen Zellgrößenverteilungen bestimmt. Für PCs und Eosinophilen, einem Cutoff bei 300 Pixel Objektgröße, was in 20 Pixel Durchmesser für einen kreisförmigen Objekt (etwa 7 & mgr; m) und für B-Zellen einem Cutoff bei 220 Pixel, was zu einem 17 Pixel Durchmesser (etwa 6 & mgr; m) verwendet wurde, für die Simulation.
Um Bereiche in dem simulierten Zufallsbild, bei dem Zellen an, die der Simulationswerkzeug platziert werden soll, wurde eine Maske aus Kernsignalen in der DAPI Kanal eines Knochenmark histologischen Bild (6A) erzeugt. Ein Wert von 10 war fest entschlossen, das optimale Intensitätsschwelle zur Erzeugung der binären Bilder (oben, rechtes Bild) sein. Die von Otsu-Algorithmus bestimmt Schwelle gilt nicht für die volle Anerkennung aller Kerne im Bild (oben, Bildmitte), der an Intensität führen, ähnlich wieSchwellen von 50 bzw. 150 (unten, links und Mitte image) .Die Relevanz der Kontakte des PCs, Eosinophile oder B-Zellen mit Stromazellen (4B) wurde mit der Simulationsprogramm (7) getestet. Diese Analyse zeigte deutlich höhere Kontaktraten in den aufgezeichneten Bildern im Vergleich zur Simulation für PC und B-Zellen (7A), im Einklang mit dem Konzept der Stroma-Nischen Unterstützung dieser Bevölkerungsgruppen. Dieses wurde in 5 einzelne fluoreszierende chimären Mäusen (7B, D) bestätigt. Im Gegensatz dazu wurde kein deutlicher Unterschied im Fall von Eosinophilen (7A, C) bestimmt.
Abbildung 1. Überblick Fluoreszenzbild für einen Längsschnitt eines murinen Femurs Kawamoto Kassette von Verfahren gefriergeschnitten. Das Bandverfahren ermöglicht cutting Abschnitte mit intaktem endostalen Region sowohl im diaphysären sowie in den epiphysären Bereiche von entkalkte Knochen. A 7 um dicke Knochenschnitt eines naiven C57BL / 6-Maus wurde für den extrazellulären Matrixprotein Laminin (rot) gefärbt, für Sca-1 bis Arteriolen (grün) und für Zellkerne (blau, DAPI) zu visualisieren. 47 Fliesen von 1446 x 1088 um, Auflösung 1360 x 1024 px wurden aufgezeichnet und genäht, um das Übersichtsbild zu erstellen. Dieses Bild wurde an einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop erfasst, mit einem 10x Objektiv (0,45 NA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Automatisierte Erfassung von Stroma und hämatopoetische Knochenmarkszellen. Ein Oberschenkelknochen Abschnitt einer rot fluoreszierenden chinumerischen Maus an Tag 30 nach der Schub für RFP (grau) gefärbt, um Stroma, MBP (rot, Eosinophilen), κ und λ-Leichtkette (grün, PCs) und B220 (blau, B-Zellen) zu visualisieren. Links: Originalbild auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen, unter Verwendung eines 20X-Objektivlinse (0,8 NA) und ein Sichtfeld von x 708.15 708.15 & mgr; m. Rechts: segmentierte Bild. Die Umrisse der Objekte erkannt werden hervorgehoben. Die weiße Rechtecke markieren die in den unteren Bildern dargestellten Bereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Die Validierung der automatisierten Bildanalyse von geschulten Beurteilern. (A) Die Gesamtfläche der Stromazellen Strukturen und Gesamtzellzahlen von hämatopoetischen Zellen von geschulten Beurteilern gezählt in einer (stromal Strukturen) 10 (PCs), zwei (Eosinophile) und ein Bild (B-Zellen) im Vergleich zu Zellzahlen durch automatisierte Bildanalyse erhalten. Punkte stehen für individuelle Rater (n = 5-6). Die Balken zeigen Mittelwerte oder automatisch ermittelten Werte. (B) Objektgrößenverteilung manuell gezählt Objekte im Vergleich zum Durchschnitt der Objektgröße durch automatisierte Analyse bestimmt. Um für die verschiedenen Frequenzen der verschiedenen Zelltypen zu berücksichtigen, PCs wurden in 10 in zwei Teile und B-Zellen in einem Bild gezählt wird, Eosinophilen. Punkte stehen für einzelne Objekte. Linien zeigen Mittelwert. (C) Hand Skizzierung Stroma-Strukturen durch geschulte Rater. Links: Originalbild. Mitte: Beispiele manuell analysiert Bilder. Rechts:. Durch automatisierte Analyse nachgewiesen Stromatumoren Strukturen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 4. Automatisierte Kolokalisation Analyse von PCs, Eosinophilen, B-Zellen und Stromazellen in der Oberschenkelknochenmark. (A) links: Häufigkeit des PCs in direktem Kontakt mit Stromazellen Strukturen, Eosinophile, B-Zellen oder anderen PCs in fluoreszierendem chimären Mäusen am Tag 30 nach dem Boost. Mitte und rechts: Häufigkeit der PCs in 10 & mgr; m oder 20 & mgr; m Umgebung Nähe Stroma-Strukturen, Eosinophilen, B-Zellen oder andere PCs. Teile dieses Bild (direkter Kontakt, 10 & mgr; m Umgebung) aus Zehentmeier et al modifiziert. 9 (B) Häufigkeit der PCs, Eosinophilen und B-Zellen in direktem Kontakt mit Stroma-Strukturen. 52-515 PCs, 918-3179 Eosinophilen 4.146-13.063 B-Zellen in 10-21 Bilder wurden aus 5 Leuchtstofflampen chimären Mäusen am Tag 30 nach dem Boost gezählt, aus zwei unabhängigen Experimenten gepoolt. Punkte stehen für einzelne Mäuse. Linien zeigen Median.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 5: Bestimmung der Zellgrößenverteilung von Knochenmark PCs, Eosinophilen und B-Zellen. (A) Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) des Simulationstools. (B) Die Zellgrößenverteilung (Fläche in Pixel) des PCs (κ und λ-Leichtkette, grün), Eosinophilen (MBP, rot) und B-Zellen (B220, blau) in Histogrammen dargestellt, wie nach der Objekterkennung durch Volocity Software (oben) gemessen. In Oberschenkelknochenmark Bilder (unten), erkannt PCs sind rot markiert (Overlay gelb), Eosinophilen in blau (Overlay-violett) und B-Zellen in gelb (Overlay grau). Bildsegmentierung wurde, indem Sie einen Mindestbetrag von 180 Pixel für PCs durchgeführt,300 Pixel für Eosinophilen und 220 Pixel für B-Zellen. 250 Objekte wurden für PC gemessen, 650 Objekte für Eosinophilen und 3.000 Objekte für B-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Erzeugung der Maske für die simulierten Zufallszellpositionierung. (A) Die ursprüngliche DAPI Kanal (gelb) als auch Überlagerungen von DAPI mit binären Bilder durch die Anwendung verschiedener Schwellwerte erzeugt werden angezeigt. Die aus dem binären Bild (Schwelle auf 10 gesetzt) erzeugte Maske ist unten (unteres Bild, Bild rechts) angezeigt. Schwarze Flächen stellen keine Sperrzonen, weißen Bereiche stellen Bereiche, in denen Zellen werden aufgestellt werden. (B) Die aufgezeichnete Bild (links) und die entsprechende simulierte Bild (rechts) zeigen eine hohe visuelleÄhnlichkeit. Eosinophilen (MBP), PC (κ und λlight Kette), B-Zellen (B220) und Stromazellen (RFP) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 7. Der direkte Kontakt von hämatopoetischen Zelltypen mit Stroma-Strukturen im aufgenommenen gegen simulierte Bilder. (A) Die Häufigkeit der PCs, Eosinophilen und B-Zellen in direktem Kontakt mit Stroma simuliert gegenüber aufgezeichneten Bildern von fluoreszierenden chimären Mäusen am Tag 30 nach dem Boost. Linien verbinden entsprechende simuliert und die aufgenommenen Bilder (Punkte). Bilder aus einem Vertreter der Maus in jeder Parzelle in gezeigt. (B) Frequenzen von PCs, Eosinophilen und B-Zellen in direktem Kontakt mit Stroma simuliert, verglichen mit aufgezeichneten Bildern von 5 einzelne Mäuse aus zwei unabhängigen Experimenten. Wilcoxon-Test, zweiseitig (PCs: *** p = 0,0001; * p = 0,0371; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001; Eosinophilen: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; * p = 0,0161, p = 0,4143; *** p = 0,0007; B-Zellen: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Punkte stehen für einzelne Bilder. Balken zeigen die mittlere. P-Werte 0,05 werden als signifikante Unterschiede. Sternchen in Zahlen zeigen die folgenden P-Werte: kA: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Teile dieses Bild (direkter Kontakt von PCs mit Stroma-Strukturen) von Zehentmeier et al modifiziert. 9 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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. Abbildung 8. komplette Workflow des Quantifizierungsansatz für hämatopoetischen Zell - Stroma-Zellinteraktionen in murinen Knochenmark Die Vorgehensweise ist in drei Hauptteile gegliedert: 1. murine Knochenmarkschnitte sind vorbereitet und Rohdaten wird durch Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie, 2 gesammelt . die automatisierte Analyse der aufgezeichneten Bilder und die Simulation beliebiger Positionierung von Knochenmarkszellen durchgeführt wird, 3. die Kontakt und Nachbarschafts Zählungen von erfasst und simulierte Bilder erhalten wurden, verglichen werden. Der Eingang (Bilddateien) und Ausgang (Textdatei) der automatisierten Analyse wird in blau dargestellt, wird der Eingang (Bilddateien) und Ausgang (Textdateien und, optional, Bilddateien) des Simulationswerkzeug in grün angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Trotz der Fortschritte in der modernen optischen Bildgebungsverfahren, die Analyse von histologischen Daten oft noch durch das Fehlen von geeigneten Quantifizierungs Werkzeuge und Methoden, oder durch vorgespannte Analysen, die auf einer kleinen Fläche von Interesse konzentrieren behindert. Die synergistische hier vorgestellte Ansatz kombiniert Bildanalyse für die gesamte Knochenmark Region, automatisierte Segmentierung und Objekterkennung von verschiedenen hämatopoetischen und Stroma-Zelltypen, die Co-Lokalisierung Analyse und schließlich ein Validierungstool von nicht-zufällig auftretenden Kontakte von einem neuen Kunden zur Verfügung gestellt entwickelt Simulationssoftware.
Histologie ganze Knochen einschließlich des Knochenmarks ist schwierig durchzuführen aufgrund der verschiedenen Gewebe in einem Abschnitt vorhanden Dichten - einerseits die sehr hart, mineralisiertem Knochen, andererseits die sehr fragil Mark, die leicht aufgebrochen wird, wenn sie geschnitten zusammen mit dem Knochen. Alternativ kann der Band Verfahren zum Schneiden Knochenabschnitte prestierten hier 14,15 hat den Vorteil, dass sie stabilisiert das Gewebe, wodurch die endostalen Bereiche intakt (Figur 1). Abgesehen davon, dass reich an Osteoblasten, haben diese Gebiete vorgeschlagen worden, um eine Rolle bei der Stammzell-Wartung 20 zu spielen.
Die entscheidende Rolle der Stromazellen in Entwicklungsprozesse und Zell Wartung im Knochenmark wird immer deutlicher. Allerdings zeigt die Analyse dieser seltenen, fragile Zellen erwies zwei Gründen schwierig sein: erstens schwierig, aus dem Knochenmark zu isolieren sind; Zweitens wird der Grad der Heterogenität zwischen den Stromazellen Bevölkerung nicht bekannt, und daher eine wichtige Population durch Verwendung von bestimmten Markern, die für Stromazellen beschrieben wurden verpassen. Verfahren zum fluoreszierenden Knochenmark-Chimären zu erzeugen, ist nützlich, um fluoreszenz Mark und später analysiert die Knochenmarkstromazellen Zellpopulation als Ganzes. Es sollte jedoch beachtet werden, dass in diesen mice alle mesenchymalen Zellen des Knochenmarks werden visualisiert, einschließlich Endothelzellen und Osteoblasten. Dies muss berücksichtigt werden, wenn Daten von solchen chimären Mäusen analysiert wird. Obwohl es auch ein Risiko von hämatopoetischen Zellen des Empfängers Ursprungs überleben die Bestrahlung sind diese Zellen in der Regel nur auf eine sehr kleine Fläche pro Sichtfeld im Vergleich zu dem Spender CD45 + -Zellen, wodurch die histologische Analyse 9 nicht beeinträchtigen. Offensichtlich sollte dieses Verfahren in einem nachfolgenden Schritt mit einer spezifischeren Nachweis von Stromazellen (sub) Populationen kombiniert werden. Derzeit ist die Analyse dieser Zellen wird hauptsächlich durch Histologie aufgrund der oben genannten Gründe erfolgt, zur Einführung eines Grenze für die Anzahl von Parametern, die gleichzeitig analysiert werden können. Die Entwicklung von Multiparameter-Analysen in der Mikroskopie wird dazu beitragen, diese Grenzen zu überwinden.
Während der Bildanalyse wurde die Segmentierung unter Verwendung der ursprünglichen Otsu-Algorithmus. Im WesentlichenBestimmt diese Clusterbasis Schwellwertverfahren automatisch die Intensitätsschwelle für die optimale Abtrennung des Vordergrund (Signal) und Hintergrund (Rauschen) Pixel in zwei Gruppen mit dem niedrigsten statistischen Abweichung in einem bestimmten Kanal, was zu einem binären Bild 17. Hier wurde Otsu-Verfahrens gegenüber dem natürlichen Logarithmus Version des Originalbildes angewendet wird, ist, dass:
Bild Eingang für Otsu = ln (Bild Input)
Das funktioniert besser für Fluoreszenzaufnahmen, da Verfahren von Otsu kann dim Zellen als Hintergrund zu identifizieren. Addieren des logarithmischen Funktion ermöglicht eine bessere Trennung der Zellen und Hintergrund in zwei verschiedene Klassen von Otsu-Algorithmus. Allerdings ist Intensität Schwellen allein nicht genug, um präzise zu erfassen einzelne Objekte. Es arbeitet effizient beim Erfassen gut getrennten Objekten in Bildern, aber es ist nicht ausreichend, um getrennte Einzelzellen in Clustern angeordnet. Da einige der Zelltypen,wurden von Interesse für uns, wie Eosinophile oder B-Zellen, werden häufig zusammen in dem Gewebe geclustert wurden ihre Kerne in der DAPI-Kanal unter Verwendung eines Algorithmus auf der Grundlage der k-Mittel-Clustern des Intensitätshistogramms mit k = 10 21. Die segmentierte Zellensegmentierungsalgorithmus wird die hellsten zu den dunkelsten Pixel (in 10 bins geclustert) geplottet und ständig für die Bildung von zell ähnelnden Objekten suchen. Diese Objekte werden dann als Zellen definiert werden. Wenn alle Pixel verwendet worden sind, werden die erhaltenen Kerne geweitet, um eine Maske, die dann auf die anderen Kanäle für die Cluster-Trennung angewendet erzeugen.
Es sei darauf hingewiesen, dass diese Analyse funktioniert gut für blutbildende Zellen, die kompakt sind, sondern dass es im Hinblick auf Stromazellen beschränkt, da es nicht möglich ist, um die Grenzen dieser großen ausgebreiteten Zellen zu bestimmen aufgrund der Verschaltung werden ihre dendritische Fortsätze, die eine netzartige Netzwerk bilden. Somit zählt Zelle für Stromazellennicht erbracht werden kann. Beschriftung einzelner Zellen über Schicksal-Mapping Reporter unter der Kontrolle von Stroma-spezifische Promotoren wird dieses Problem zu lösen, nach dem, was für Neuronen veröffentlicht (unter Verwendung des "Brainbow" System 22) und für die Kennzeichnung von follikulären dendritischen Zellen in den Lymphknoten 23.
Zusätzlich zur Anwendung eines Rauschreduktionsschritt für alle Kanäle durch die Möglichkeit Objekte unter 30 Pixel wurde Größenausschlusschromatographie bei der Objekterkennung für hämatopoetische Zellen angewendet, aber nicht Stromazellen. Kleine Fragmente von Zellen, die durch die Unterteilung kann ausgeschlossen werden geschnitten wurden; Jedoch kann der Verlust in diesem Fall ist für eine eindeutige Erkennung der Zellen vernachlässigt werden. Verlängerung der Analyse und Simulation von zwei auf drei Dimensionen wird diese Einschränkung zu überwinden. Die Entwicklung von Methoden, um zelluläre Verteilung im ganzen Reittiere, zum Beispiel durch Mehrphotonenmikroskopie oder Lichtschnittmikroskopie / SPIM studieren, wird sicherlich in th helfenist der Respekt. Um die komplexen zellulären Zusammensetzung des Mehrkomponenten-Nischen zu studieren, wird es auch erforderlich sein, die Anzahl der Parameter, die in situ analysiert erweitern. Vielversprechende Ansätze für Multiparameteranalyse von histologischen Informationen in Kombination mit cytometric Quantifizierung wurden kürzlich 24 veröffentlicht worden, 25.
Die Kontaktanalyse wurde durch die Quantifizierung der Überlappung von zwei Objekten durchgeführt. Direkter Kontakt wurde als eine Überlagerung zumindest ein Pixel definiert. Wichtig ist, daß diese Analyse durch die Auflösung der Mikroskopiebilder begrenzt und hängt daher von der Wellenlänge und der Art der Anregung, sowie von der numerischen Apertur der Objektivlinse in dem Mikroskop verwendet wird, und der Lochblendengröße. In der hier gezeigten Analysen wird eine 0,8 NA, 20x-Objektiv mit Fluorochrom Kombinationen mit 488, 561, 594 erregt wird, und 633 nm mit einer Photonenanregung aufgebracht. Daher schätzt die laterale Auflösung von0,372 und 0,483 & mgr; m erreicht. Dies ermöglicht Aussagen über die Gegenüberstellung von verschiedenen Zell-Untergruppen vorgenommen werden; jedoch ist es nicht geben keine Informationen über mutmaßliche molekularen Mechanismen zellulärer Interaktionen beteiligt. Zusätzlich sind andere Verfahren, wie 2-Photonen-Intravitalmikroskopie benötigt, um die Charakterisierung dieser interzellulären Kontakte 9 zu verbessern. Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden Systeme können helfen, um zu bestätigen, ob diese Interaktionen sind eigentlich funktionale 26.
Um die zelluläre Mikroumgebung des Gewebenischen bewerten, ist es nicht nur entscheidend, den direkten Zell-Kontakte zu analysieren, sondern auch, um die Zelltypen in der Umgebung eines bestimmten interessierenden Zelltyp ("Umgebungsanalyse") zu quantifizieren. Zuvor wie Gefäße basierend auf der Position des Kerns 27 veröffentlichten Studien gemessenen Abstände zwischen Zellen und Gewebestrukturen. Da waren wir interessiert Findunging der Abstand von verschiedenen Zelltypen, zum Teil mit unterschiedlichen Verhältnissen von Kern zytoplasmatischen Volumens, bevorzugt man, um den Abstand zwischen den Oberflächen zu messen. Zu diesem Zweck haben wir durch die Bestimmung des euklidischen Abstand zu einem cell's Grenze nach der Konvertierung der Werte von & mgr; m auf Pixel berechnet, die die Umgebung Radius. Der euklidische Abstand ist der geradlinige Abstand zwischen zwei Pixeln und kann durch die Formel 28 beschrieben werden: 
Zellen, die mit Pixeln ihrer Grenzen innerhalb eines euklidischen Abstand von beispielsweise 10 & mgr; m von den Pixeln von Grenzen eines Zielzelle als Nachbar diese Zelle gezählt.
In seiner gegenwärtigen Form, bestimmt die Analyse nur, ob eine Zelle in Kontakt gebracht wird oder genähert durch eine andere Zelle des gleichen oder verschiedener Art, die also nur eine binäre Ja / Nein Charakterisierung. Die tatsächliche Anzahl von Zellens, die die Zelle von Interesse von ihm wenden oder in einem gewissen Radius wird nicht berechnet. Der nächste Schritt wird sein, die aktuelle Analyse in einer Weise, die Gruppengröße der Kontaktaufnahme oder Nachbarzellen erkannt und im Vergleich zwischen verschiedenen Zielzellen des gleichen Typs werden zu verlängern. Dies wird zu einer wichtigen zusätzlichen Informationen über die Zusammensetzung von Knochenmark-Nischen, wie etwa die Überlebensnische für Knochenmarkplasmazellen, für die ein unterschiedlicher Beitrag hämatopoetischer akzessorischen Zellen wurde diskutiert 29-33 führen.
Die Objekterkennungsalgorithmen wurden zusammen mit den Spezialisten aus Wimasis mit ihren handelsüblichen maßgeschneiderte Lösung Service und sind auf Anfrage erhältlich optimiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, entweder im Handel erhältliche Software für die Bildanalyse, wie Definiens Volocity oder Imaris oder Free wie CellProfiler verwenden.
Die automatisierten Zell Segmentierung und Bildanalyse-Tools, die wirre durch Vergleich ihrer Ergebnisse mit manuell analysiert Daten, die durch 6 ausgebildeten Bild Beurteilern bezüglich zweier Parameter, nämlich der Objektgröße und der Anzahl von Zellen in verschiedenen Zellpopulationen bereitgestellt validiert. Wie in 3B, die durchschnittliche Größe bei der hämatopoetischen Zellen (PCs, Eosinophilen und B-Zellen) gezeigt, wurde ähnlich zwischen den beiden Verfahren, wobei ein höherer Varianz für manuelle Grßenbestimmung für Plasmazellen und Eosinophilen, wahrscheinlich aufgrund ihrer unregelmäßiger Form gegen B-Zellen. Die automatische Erkennung von Zellzahlen ergab etwas niedrigere Werte als die manuell erfasst diejenigen. Hervorzuheben ist, dass sie immer noch im Bereich der Handwerte im Fall von Eosinophilen und PCs, während sie unterhalb dieser Werte in dem Fall von B-Zellen waren, wahrscheinlich aufgrund einer höheren Heterogenität der Expression von B220, die als Marker verwendet wurde, für B-Zellen. B220 ist bekannt, hochreguliert wird während der B-Zell-Differenzierung im Knochenmark sein, und B-Zellen mit niedriger als auch hoher intensity Färbung für B220 beobachtet werden kann. B-Zellen mit niedriger B220 Signale fiel unter den angewandten Schwelle, die zum Ausschluß der frühesten stufigen B-Zellen geführt haben könnten. Eine niedrigere Schwelle für die automatische Erkennung kann dieses Problem lösen. Für Stromazellen, die schwerer zu erkennen aufgrund ihrer weniger kompakter, dendritischen sind, und ausgestreckten Morphologie führte die manuelle Erkennung in hoher Abweichungen zwischen einzelnen Rater. Interessanterweise ist die durchschnittliche Gesamtfläche der Stroma war gleich der Gesamtfläche automatisch bestimmt, was darauf hinweist, dass die Analyse gut geeignet, um für individuelle Vorspannung von den Beurteilern kompensieren. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die automatischen Ergebnisse allgemein repräsentativ für die Durchschnittswerte der manuellen Analysen und sind gut geeignet, um Interrater Variabilität in der Analyse zu reduzieren.
Um zufällige und nicht zufälligen Positionierung der Zellen innerhalb der strukturellen Grenzen des Gewebes zu unterscheiden, wurde ein Simulationswerkzeug entwickelt. Durder Simulation kommen, wird eine künstliche Bild mit zufällig positionierten hämatopoetischen Zellen für jeden aufgezeichneten Knochenmark histologische Bild geschaffen. Zuerst wird das Stroma Kanalbild im Originalformat verwendet. Eine Maske wird von der DAPI Bild durch Anlegen einer festen Intensität basierenden Schwellenwert, wodurch die Umwandlung des Bildes in Binärformat erzeugt; die binäre Maske erfährt dann mehrere Schritte pixelbasierten Dilatation und Erosion. Die Maske definiert Bereiche im Bildfeld in dem simulierten Zellen werden gespeichert. Die Koordinaten der Zentren der simulierten Zellen werden durch eine einheitliche Zufallszahlengenerator versehen ist, dessen Begrenzungen in denen durch die Bildgröße bestimmt. Informationen über die Anzahl von Zellen und durchschnittlichen Zellgröße für jede durch eine automatische Bildanalyse der aufgenommenen Bilder bestimmt Population verwendet werden, um die simulierten hämatopoetischen Zellpopulationen zu definieren. Die simulierte Zelldurchmesser im Verdacht, eine eindimensionale Gauß-Verteilung folgen, aus dem der eigentlicheZelldurchmesser wird zufällig ausgewählt: Der Durchmesser wird dann so modifiziert, dass die Zellgröße Abschaltungen für die minimal zulässige Objektgröße eingebracht werden. Für den Fall, würde die simulierte Zelle positioniert ist, dass ein oder mehrere Pixel überlappen mit einem Sperrgebiet oder würde in einem vorgegebenen Abstand von einem anderen bereits platzierte Zelle (4 & mgr; m von Mitte zu Mitte, wie in den aufgenommenen Bildern bestimmt), neue Zufallskoordinaten sein wird gewählt, während der Durchmesser unverändert. Dies wird wiederholt, bis die Anzahl der simulierten Zellen gleich der Anzahl von Zellen in dem aufgezeichneten Bild.
Das Werkzeug wurde auf der Annahme, dass die hämatopoetischen Zellen können frei innerhalb des Knochenmarks angeordnet werden, während stromal Strukturen fungieren als feste Matrix innerhalb des Gewebes beruht. Das Werkzeug wurde auf die Situation im Knochenmark, wo parenchymalen Bereiche sind durch ein komplexes System von Sinusoiden gekreuzt optimiert. Eine ähnliche Modellierungsansatz wurde vor kurzem von Frenette und Mitarbeiter, um veröffentlicht zuAnalyse der Positionierung von hämatopoetischen Stammzellen im Zusammenhang mit Stromazellen und Gefäßstrukturen, die etwa 30% des gesamten Oberschenkelknochenmarkvolumen 25. Um diesen Effekt zu korrigieren, wird das Simulationswerkzeug hier präsentierten auf einer Maske von Bereichen basierend wurden Zellen werden gespeichert. Dies wurde durch die Verwendung eines Kernbildflecken, wobei die Objekte, die die Kerne wurden durch eine 5-stufige Erweiterung erweitert erreicht (siehe Figur 6) nach der Binarisierung. Gebiete mit geringer Zelldichte, dh, geringe Dichte der Kerne, wie Knochen und Sinuskurven, werden nicht auf die Maske tragen und damit zu Sperrzonen. Um eine künstliche Verringerung dieser Sperrzonen durch die Dilatation Verfahren zu vermeiden, wurde ein 5-Schritt-Erosion nachfolgend aufgebrachte, damit die Wiedereröffnung größere Sperrbereichen, während gleichzeitig das hohe Keimdichte (daher "erlaubt") Bereiche unverändert. Diese Methode kann für andere lymphatischen Organen angepasst werden. In die tProbleme waren diese Verfahren nicht funktionieren könnte (beispielsweise in Bereichen, in denen Zellen mit einer hohen Cytoplasma / Kern-Verhältnis vorhanden sind), andere Verfahren, wie zytoplasmatische Markierung kann verwendet werden, um die Maske zu erzeugen.
Hämatopoetische Zellen wurden als kreisförmige Objekte, deren Größe unter Verwendung einer Gaußschen Zufallszahlengenerator, der Mittelwert, der mit dem berechneten Durchschnittsdurchmesser jedes Zelltyps vereinbarten bestimmt simuliert. Die Breite der Verteilung auf gemessene Zellgrößenverteilungen in den aufgenommenen Bildern, wie durch eine Bildanalyse-Software bestimmt wird. Um zu berücksichtigen, daß kleine Zellbruchstücke wurden in der automatisierten Bildanalyse ausgeschlossen tragen, wurden die Zellgröße Abschaltungen eingeführt, wie aus den gemessenen Zellgrößenverteilungen für jeden Zelltyp bestimmt (siehe Abbildung 5).
Natürlich funktioniert dies auch für die Zelltypen, die in ihrer Größe und Form relativ einheitlich sind, kann aber zu Problemen im Falle von Zellen, die einen führenerneut stark heterogen in Bezug auf diese Parameter. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Analyse für die Haupt hämatopoetischen Zelltypen im Knochenmark (Granulozyten, hämatopoetische Vorläuferzellen und Lymphozyten), denen gemeinsam ist, dass sie eine regelmäßige, annähernd runde Form besitzen, optimiert werden. Jedoch ist dieses Verfahren nicht für dendritische Zellen oder Makrophagen Zelltypen mit stark unregelmäßige Zellkörpern getestet. Die Analyse solcher Zellen wird neue Herausforderungen für unsere automatische Bildanalyse sowie auf den Simulationsansatz zu präsentieren, einschließlich der Notwendigkeit einer verbesserten Zellverband Trennalgorithmen 24 sowie detaillierte Form-Analyse und Simulation nicht nur unterschiedlich große, sondern auch unterschiedlich geformten Zellen. Eine Alternative wäre ein Simulationsansatz, mit den exakten Formen arbeitet als aufgezeichnet werden. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Methode würde signifikant die deterministisches Verhalten des Modellsystems zu erhöhen.
Für die simulierte Erfahriments 1000 Wiederholungen der Simulation für jeden aufgezeichneten Bildes erzeugt wurden. Unter Verwendung dieser Anzahl der Wiederholungen der relative Fehler von dem Simulationsverfahren selbst beigetragen bis etwa 3% zu reduzieren. Nämlich, wenn die Zell-Zell-Co-Lokalisation Werte werden aus Simulationen, die zufällig sind, berechnet, dann die Simulationsverfahren selbst wird durch einen N -1/2 Fehlerfunktion, wobei N die Anzahl von Simulationen pro Messbild charakterisiert werden. Dies ist der Beitrag von dem Simulationsverfahren selbst zu dem akkumulierten Fehler der gemessenen Kolokalisation Werten. So kann N = 1000 die beigetragen Fehler 3,16%. Die hier gezeigten Simulationen lief für 20 bis 60 Minuten pro Bild 1.000 Wiederholungen, wenn nur die Speicherung der simulierten Bilder als .rect Dateien (eine einfache Textformat) und nicht als tatsächliche Bilder im JPEG oder TIFF-Format (auch eine Option in der Software ).
Zusammengenommen können diese Vorgehensweise für eine unvoreingenommene, Hochdurchsatz-Analyse von histologischen Bilds und ermöglicht die Erzeugung von statistisch relevanten Daten. Dies kann nützlich beim Vergleich zelluläre Lokalisierung unter verschiedenen Bedingungen. Darüber hinaus ist die zeitliche Komponente in der Zukunft in einem Modellierungsansatz von Knochenmarkzellbewegungen, wenn mehr Daten auf die Motilität von verschiedenen Zelltypen im Knochenmark integriert werden, zur Verfügung steht. Dieses Verfahren kann dann verwendet werden, wie beispielsweise die Bereitstellung von Zellen aus dem Knochenmark in den Kreislauf, beispielsweise Neutrophilen im Fall einer akuten Entzündung 34 auf Störungen des Systems simulieren. Zur weiteren Aufklärung der Funktion des Knochenmarks als Aufbewahrungsort für Immunspeicherzellen, kann man sich auch vorstellen, Ausdehnung auf den Wettbewerb für Lebensfaktoren zu modellieren. Auch könnte das mögliche Übersprechen zwischen verschiedenen Nischen adressiert werden, ebenso wie die Induktion der Nischen. Zusammen wird dies dazu beitragen, um die physiologischen Veränderungen zu verstehen (zB Auslöser für regenerative Verhalten in Stammzellen) als well als den pathologischen Störungen des Gesamtsystems, beispielsweise im Falle von Autoimmunerkrankungen, Neoplasien oder akuten Entzündung. Als Teil eines iterativen Konzept des Experiments und der Modellierung, neue Hypothesen basierend auf den Simulationen, die ihrerseits wiederum experimentell getestet werden, erzeugt werden, um dadurch zu helfen, die Funktion und das Zusammenwirken verschiedener Zelltypen in der Komplexität des Gewebes weiter zu verstehen.
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Acknowledgments
Wir danken Andreas Radbruch für wertvolle Diskussionen. Wir danken Gruczek, Patrick Thiemann und Manuela Ohde um Unterstützung bei der Tierpflege und Robert Günther für hervorragende technische Unterstützung Sabine. Wir danken unseren geschulten Beurteilern Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florenz Pache und Katharina Horn zur Auswertung der histologischen Proben und Randy Lindquist für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken J. und N. Lee, Mayo Clinic in Scottsdale, Arizona, USA für MBP-spezifische Antikörper.
Diese Arbeit wurde von der DFG HA5354 / 4-1, von JIMI eines DFG-Core Facility Netzwerk Zuschuss für Intravitalmikroskopie und unterstützt von TRR130 / TP17 und DFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1), um AEHSZ wurde von der International Max Planck unterstützt Schule für Infektionskrankheiten und Immunologie (IMPRS-IDI), Berlin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
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