Abstract
Confocale microscopie is de voorkeurswerkwijze voor de analyse van de lokalisatie van meerdere celtypen binnen complexe weefsels zoals het beenmerg. De analyse en kwantificering van cellulaire lokalisatie is moeilijk, omdat in veel gevallen het berust op handmatige telling, waardoor met het risico van het introduceren van een beoordelaar afhankelijke voorspanning en verminderen interwaarnemersbetrouwbaarheid. Bovendien is het vaak moeilijk te beoordelen of de co-lokalisatie tussen twee cellen resulteert uit willekeurige positie, vooral wanneer celtypen sterk verschillen in de frequentie van voorkomen. Hier wordt een werkwijze voor onpartijdige kwantificering van cellulaire co-localisatie in het beenmerg ingevoerd. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters gebruikt voor histologische coupes van de hele muizen lange botten, waaronder het beenmerg te verkrijgen, evenals de kleuringsprotocol en de overname van beelden met hoge resolutie. Een analyse workflow variërend van de erkenning van hematopoietische en niet-Hematopoietic celtypes in 2-dimensionale (2D) beenmerg beelden naar de kwantificering van de rechtstreekse contacten tussen die cellen wordt gepresenteerd. Dit omvat tevens een wijk analyse, om informatie over de cellulaire micromilieu rond een bepaald celtype verkrijgen. Om te beoordelen of co-lokalisatie van twee celtypen is de resultante van willekeurige cel positioneren of reflecteert preferentiële associaties tussen de cellen een simulatie instrument dat geschikt is voor het testen van deze hypothese bij hematopoïetische en stromale cellen, is gebruikt. Deze benadering is niet beperkt tot het beenmerg, en kan worden uitgebreid tot andere weefsels reproduceerbare, kwantitatieve analyse van histologische gegevens mogelijk.
Introduction
Door recente snelle technologische ontwikkelingen microscopie, waaronder optische, heeft de analyse van cellen in de context van het gehele weefsel steeds toegankelijker voor immunologen worden. De karakterisering van afzonderlijke cellen in suspensie een waardevolle en onmisbare methode cellulaire en moleculaire functie begrijpen. De analyse van de cellen in hun (micro) -anatomical milieu essentieel voor het begrijpen van de interacties tussen verschillende celtypen die samenwerken in complexe processen zoals de ontwikkeling van immuunresponsen.
Hoewel het relatief gemakkelijk microscopisten kwalitatieve informatie uit beelden te verkrijgen, blijft het een uitdaging om deze gegevens te kwantificeren, mede door het feit dat analysemethoden op dit gebied blijft achter met wat mogelijk is in beeldacquisitie. Veel onderzoekers nog steeds rekenen op tijdrovende handmatige cel tellen in hun histologie beelden,om zo voor een vertekening tussen de verschillende beoordelaars en belemmeren replicatie door andere groepen. Vaak wordt een representatief beeld gekozen om een verklaring over cellulaire positie of co-lokalisatie onderstrepen in een publicatie, waardoor het moeilijk voor de lezer om de statistische relevantie van een dergelijke gebeurtenis te beoordelen.
Samen met het feit dat de volledige informatie-inhoud van beeldgegevens zelden wordt uitgebuit, benadrukt dit de noodzaak van een meer onpartijdige, sneller en alomvattende aanpak van de histologische beelden te analyseren.
Het beenmerg een complex weefsel dat neemt belangrijke vitale functies als orgaan van hematopoiese bij volwassen vertebraten. Naast het feit dat de geboorteplaats van hematopoietische cellen 1,2 en spelen een belangrijke rol in de B-lymfocyten ontwikkeling 3, fungeert het ook als een site waar immuunreacties worden geïnitieerd 4 en ondersteunt volwassen, recirculatie B-cellen 5. Daarnaast zijn rol in het handhaven van immunological geheugen is steeds meer gewaardeerd in de afgelopen tien jaar, zoals verschillende soorten cellen vormen immunologisch geheugen zijn gevonden aldaar te verblijven 6-9.
De verhouding tussen het complex weefsel architectuur van het beenmerg en de functies nog steeds blijven ongrijpbaar. In tegenstelling tot de secundaire lymfoïde organen, die worden georganiseerd in macro-compartimenten zoals T- en B-cel zones, het beenmerg ontbreekt een duidelijke macro-verkokering. Tot dusver verschillende compartimenten in het beenmerg worden gedefinieerd door hun nabijheid tot de botcortex of vasculatuur. Het belang van de verschillende resident stromale cel populaties in het beenmerg voor een aantal processen zoals ondersteuning stamcellen, ontwikkeling van B-cellen of het onderhoud van immuungeheugen celpopulaties (zoals langlevende plasmacellen (PC), CD4 + en CD8 + geheugen T-cellen) blijkt duidelijk dat er een zekere mate van micro-compartimentering in het beenmerg.
Het is nog niet duidelijk in hoeverre deze niches gemeenschappelijke kenmerken met betrekking tot hun cellulaire en moleculaire composition, en welke elementen maken een bepaalde niche uniek. Naast stromale cellen, hematopoëtische celtypen hebben aangetoond dat het een cruciale rol spelen door bepaalde signalen althans voor sommige niches. Is duidelijk dat de complexiteit van de niche preparaat vereist de analyse in situ, en het is steeds belangrijker geworden voor immunologen en hematologen inzoomen op beenmerg microarchitectuur, bijvoorbeeld door analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellulaire componenten.
Hier strategie cellulaire co-localisatie en buurt verhoudingen in het beenmerg op geautomatiseerde en onpartijdige wijze kwantificeren gepresenteerd. Een gedetailleerde workflow inclusief het genereren van chimere muizen harboring fluorescerende stromale cellen en niet fluorescerende hematopoietische cellen, bereiding van histologische coupes van niet ontkalkte beenderen, verwerving van confocale afbeeldingen die het gehele bot, en de geautomatiseerde beeldanalyse van cellulaire co-lokalisatie en de validatie / discriminatie van willekeurige positionering door een simulatie-tool is voorzien (Figuur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden goedgekeurd door de juiste staats-comités voor dierenwelzijn (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften (dierproef licentie G0194 / 11).
1. Generatie van TL-Bone Marrow Chimerische Muizen
Opmerking: Het genereren van fluorescente beenmerg chimere muizen beenmerg stromale cellen zichtbaar wordt uitgevoerd zoals beschreven voor 9.
- Gaan behandelen Del-Cre x ROSA-tdRFP muizen (muizen die tandem rood fluorescerend eiwit (tdRFP) alomtegenwoordig 11-13) om hen voor te bereiden op bestraling. U kunt ook een andere stam met alomtegenwoordige uitdrukking van fluorescerend eiwit. Dien 1 mg / ml neomycine en 1 mg / ml vitaminen (A, D3, E, C) via het drinkwater twee dagen voor de bestraling.
- Bestralen muizen tweemaal met 3,8 Gray met een Cesium-137 gamma-bestraler within een interval van 3 uur. Hiervoor plaatst u muizen in een bestraling taart kooi geschikt voor de respectieve bestraler.
OPMERKING: Voor de bestraling van muizen, doet ons instituut geen verdoving nodig. Volg de lokale institutionele beleid ten aanzien van anesthesie voor bestraling. Dieren behandelen met 5 mg / kg carprofen subcutaan (sc) per dag na bestraling bij tekenen van pijn. - De volgende dag, reconstitueren muizen door een intraveneuze injectie van 3 x 10 6 beenmergcellen bereid uit lange beenderen van C57BL / 6 donor muizen in transferbuffer 9. Houd de muizen op Neomycine en vitaminen voor maximaal 2 weken en het toezicht op hun welzijn en het gewicht in deze tijd. Wacht minstens 4 weken om voor reconstitutie van het immuunsysteem voordat de specifieke experimentele behandelingen (bijvoorbeeld immunisatie) 9.
- Offeren muizen en leg ze op een dissectie boord, steriliseren de benen met 70% ethanol. Euthanize muizen in overeenstemming met de lokale institutionele beleid. Ons Instituut voert cervicale dislocatie.
- Gebruik een tang en schaar om de huid van de dijen te verwijderen. Verwijder spierweefsel het dijbeen bloot. Ontwrichten de femorale bot van de heup en knie met behulp van een tang en schaar. Wees voorzichtig niet te breken of snijden het bot.
- Verwijder voorzichtig resterende grote stukken van spierweefsel en kraakbeen van het bot met een schaar. Verwijder resterende spierweefsel door te wrijven op het bot met laboratorium vloeipapier. Verzamel de schoongemaakte botten in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fix geheel femorale bot in 4% paraformaldehyde (PFA, elektronenmicroscopie-kwaliteit) gedurende 4 - 6 uur.
- Gooi PFA en incubeer botten in 10% sucrose in PBS O / N. De volgende dag, incubeer de botten in 20% sucrose O / N. De dag na, incubeer de botten in 30% sucrose O / N.
2. cryosectioning van Bones
OPMERKING: Na 16-24 uur in 30% sucrose, botten bevriezen en cryosectie ze volgens Kawamoto's tape methode 14,15.
- Bereid een grote beker (2000 ml volume) met droog ijs en aceton (ongeveer 2: 1 volume-verhouding, bijvoorbeeld, 400 ml droge ijs en 200 ml aceton) onder een afzuigkap. Plaats een kleine beker (150-250 ml volume) met hexaan binnen (30 - 50 ml ongeveer). Wacht tot het mengsel afkoelen (ongeveer 10 min, tot de vorst op het buiten de grote beker).
- Vul ¾ van de gelabelde cryomold met Super Cryoembedding Medium (SCEM); de botten voorzichtig plaatsen in tot ze volledig ondergedompeld, zorg dat ze niet over de randen van de mal te raken. Met grote tang houdt de cryomold in de beker met de bodem van de matrijs slechts het oppervlak van de hexaan raken.
- Laat de buitenranden van de SCEM bevriezing (aangegeven dekking, dit duurt ongeveer 15 seconden). Vervolgens volledig te laten vallen de mal in de hexaan en laat het freEze voor 1-2 min. Haal de bevroren monster en verpakken in cellofaan en dan aluminiumfolie (om het monster tegen uitdrogen te beschermen en om de blootstelling aan licht te vermijden). Bewaren bij -80 ° C tot cryosectioning.
- Voor cryosectioning van dijbeen botten gebruiken een standaard microtoom en microtoom messen voor harde weefsels.
- Stel het monster en het blad temperatuur van het microtoom tot -24 ° C. Laat het monster in de microtoom zitten voor ongeveer 15 minuten voor het snijden.
- Fix het monster blok aan het metalen monster houder met SCEM of optimale snijtemperatuur (oktober) medium. Stel de oriëntatie van het blok indien nodig. Knip het monster totdat het bot volledig geopend en het merg zichtbaar. Stel de snijdikte tot 7 micrometer (gooi de eerste sectie).
- Bevestig een stukje Kawamoto tape met de kleverige kant op de bovenkant van het monster blok met behulp van een hert leder-overdekte houten spatel. Vervolgens snijd het monster en draai de tape, zodat de sectie iszich aan de bovenzijde. Breng de tape aan een dia glas met behulp van een tang. Bevestig de tape aan de dia glas met Scotch tape.
- Laat secties drogen gedurende ten minste 30 min en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. WINKEL ongekleurd en gemonteerde dia in plastic dozen dia afstandhouders tussen dia's uit om te voorkomen dat ze aan elkaar kleven. Gekleurd en gemonteerde dia's kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week in kartonnen mappen glijbaan bij 4 ° C.
3. Image Collection
- Ontdooien en vlek cryocoupes volgens gemeenschappelijke immunofluorescentie protocollen 9. Neem een nucleaire kleuring, bijvoorbeeld, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) voor weefselintegriteit visualiseren.
OPMERKING: Stain bijvoorbeeld voor RFP naar stromale cellen (anti-RFP-biotine antilichaam en streptavidine-Alexa Fluor 555), vlek eosinofielen met rat anti-major basic protein (MBP) antilichamen en anti-rat-Alexa Fluor 647-antilichaam visualiseren B-cellenmet rat anti-B220-Alexa Fluor 594 antilichaam en pc's met anti-κ lichte keten-fluoresceïne-iso-thiocyanaat (FITC) en anti-λ1 lichte keten-FITC antilichamen (details van de kleuringsprocedure worden beschreven in 9). - Monteer gekleurde coupes: zet één druppel Fluoromount op de afdeling en dan bedekken met een # 1 glas dekglas, terwijl de vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. Vervolgens voeren laser scanning confocale microscopie met een toestel met laserlijnen geschikt voor de kleuring.
- Om de beelden voor automatische co-lokalisatie analyse van beenmerg hematopoietische cellen met stromale cellen met behulp van de Wimasis tool, de volgende instellingen toe te passen op te nemen:
- Gebruik een 20X objectief en een gezichtsveld van 708,15 x 708,15 urn. Voor geautomatiseerde analyse houdt de grootte van alle beelden dat ten 2048 x 2048 pixels (px) om de resultaten vergelijkbaar te houden.
- Noteer één kanaal voor stromale structuren (bijvoorbeeld, (bijvoorbeeld DAPI, 405 nm) en extra kanalen voor de hematopoietische cellen van belang (bijvoorbeeld, 3 kanalen, 488/594/633 nm voor eosinofielen, B-cellen en PC's).
- Beelden opnemen met lijn van gemiddeld 4 16. In het ideale geval het gehele dijbeen sectie door het nemen van enkele aangrenzende beelden. U kunt ook niet-aangrenzende foto's uit verschillende regio's van het beenmerg (diafysaire evenals epiphyseal).
LET OP: Wees voorzichtig niet te overlappingen tussen aangrenzende beelden (tot herhaalde analyse van cellen in de overlappende gebieden te vermijden) te produceren.
- Sla de beelden in een microscopie beeldbestandsformaat. Controleren en eventueel contrast voor alle kanalen in de viewer / analysesoftware passen.
- Export 3 .jpg bestanden per beeldbestand: een .jpg-bestand voor de DAPI kanaal (rood / groen / blauw (RGB) formaat, valse kleur gecodeerd in het geel), een .jpg-bestand voor het stroma kanaal (grijswaarden) en één .jpg bestand metde kanalen voor hematopoietische cellen (maximaal 3 kanalen, RGB-formaat, bijvoorbeeld FITC (pc's, valse kleur: groen) / Alexa Fluor 594 (B-cellen, valse kleur: blauw) / Alexa Fluor 647 (eosinofielen, valse kleur: rood)) .
4. Automated Image Analysis
- Gebruik een afbeelding analyse tool om beeldsegmentatie, kwantificering van co-lokalisatie en buurt analyse (zie Discussie) uit te voeren.
- Bij gebruik van de Wimasis gereedschappen, gaat u als volgt te werk:
- Upload de sets van 3 .jpg bestanden per beeld met dezelfde bestandsnaam, gevolgd door een underscore en een vermelding van het type van het beeld.
- Gebruik _1 voor de .jpg-bestand met hematopoietische cellen, _2 voor de .jpg-bestand voor de DAPI kanaal, _3 voor de .jpg-bestand voor het stroma kanaal. Bijvoorbeeld: Image1_1.jpg (hematopoietische cellen), Image1_2.jpg (DAPI kanaal), en Image1_3.jpg (stroma-kanaal). Upload de foto's via de klant rekening.
- Voor celcontact kwantificeringkies de cel contact instrument door te klikken op de respectievelijke veld. Voor mobiele omgeving kwantificeren, kiest de cel omgeving gereedschap en voer de voorkeur omgeving straal in micrometer (die wordt gemeten vanaf de randen van de cellen).
- Download de resultaten.
Opmerking: De resultaten worden als .jpg bestanden waarin de hematopoietische cellen en stroma kanaal met de grenzen van de gedetecteerde objecten gemarkeerd, evenals enige CSV bestanden met de metingen voor elke afbeelding, naast een overzicht CSV bestand bevat de gegevens voor alle geüploade afbeeldingen.
- Van contactmetingen bepalen de frequentie van hematopoietische cellen (rood, groen of blauw cellen) in contact met stromale cellen of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen contact andere hematopoëtische celtypen (een voorbeeld is getoond in Representatieve resultaten Figuur 4). Om de frequentie te bepalen, verdeel het de contact tellingen per afbeelding doorde totale cel telt per beeld.
- Voor experimenten met individuele muizen, een samenvatting van de totale contact tellingen van alle beelden die voor de enkele muizen en verdeel ze door de som van de totale cel tellingen van alle afbeeldingen.
- Uit de nabijheid metingen bepaalt de frequentie van rood, groen of blauw cellen in de geselecteerde afstand van stromale cellen en / of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen in de gewenste nabijheid van de andere hematopoietische celtypes zoals beschreven in stap 4.3 ( zie ook Representatieve resultaten, figuur 4).
5. Simulatie van Random Bone Marrow Positioning
- Voor het uitvoeren van de simulaties van willekeurige cel positionering op de geanalyseerde beenmerg histologische beelden, de voorbereiding van de volgende bestanden op voorhand: de enkelvoudige .csv-bestanden die door de cel contact tool, de originele .jpg bestanden voor de DAPI kanaal en de originele .jpg bestanden voor de stromale kanaal.
- Om voerenbatch simulaties op een reeks beelden (bijvoorbeeld alle afbeeldingen van de ene dij sectie), het verzamelen van alle originele .jpg bestanden (_1, _2 en _3) en de corresponderende enkele CSV-bestanden in een map.
OPMERKING: De simulatietool voor willekeurige beenmergcel positionering is op aanvraag beschikbaar. - Start de simulatie-tool, vink het vakje "Auto-load beeldgegevens".
OPMERKING: Het programma zal de cellen en gemiddelde celgrootte van het CSV-bestand automatisch gelezen. Deze waarden worden weergegeven in de vakjes "Cell number" en "Vakgrootte AVG" (figuur 5A). - Voer de gemeenschappelijke tag voor de CSV-bestanden, dat wil zeggen, de gemeenschappelijke factor in hun naam. Voer het nummer van de afbeelding sets die moeten worden gebruikt voor batch-modus simulatie.
- Laad het .jpg-bestand gegenereerd uit de stroma-kanaal (met bestandsnaam die eindigt _3).
- Voer de instellingen voor het genereren van het masker van de DAPI kanaal:
- Vink het vakje "? Breng het masker "Stel de drempel voor het de DAPI omzetten in een binair masker tot 10 (range 0-255).
- Vink het vakje "8-bit?" Vink het vakje "Homothetie?" En stel de rang van dilatatie tot 5 px. Vink het vakje "w / erosie?".
- Geef de waarde voor de nabijheid radius (buurt radius) gebruikt bij de analyse van de gesimuleerde afbeeldingen. Voor een beeld van 708,15 x 708,15 urn met een grootte van 2048 x 2048 px (pixel scaling xy: 0,346 micrometer), 29 px overeen met 10 micrometer.
- Vakje "Gebruik Otsu?" Naar Otsu's algoritme 17 te gebruiken voor automatische detectie van stromale structuren.
Opmerking: Dit is hetzelfde algoritme dat wordt gebruikt door het contact en omgeving tool. Met behulp van dezelfde afbeelding segmentatie-algoritme in de geautomatiseerde analyse van het opgenomen beeld en de gesimuleerde afbeelding is van cruciaal belang om de gegevens vergelijkbaar te houden. - Voer de instellingen voor hematopoietische cellen, die are gesimuleerd als ronde vormen.
OPMERKING: De mobiele nummers voor rood, groen en blauw cellen zijn, worden rechtstreeks van het CSV-bestand (zie ook stap 5.6).- Gebruik het simulatieprogramma de gemiddelde diameter berekenen px rode, groene en blauwe cellen. Bepaal het gemiddelde oppervlak van een cel als het totale oppervlak van elk celtype in de afbeelding px gedeeld door het totale aantal cellen per beeld. Gebruik de gemiddelde gebied om de straal van een schijf met de formule berekenen. Dubbele straal tot de gemiddelde diameter bepalen.
- Meet de celgrootteverdeling van de geanalyseerde celtypen met elke software voor beeldanalyse dat object segmentatie functies omvat. Bepaal σ voor hematopoëtische celtypen (18 en figuur 5B).
Opmerking: omdat de celgrootte verdelingen van de opgenomen cellen niet worden bepaald door de geautomatiseerde beeldanalyse gebruikt een Gaussische verdeling als een benadering van de werkelijke verdelingen. De breedte van de thij verdelingskromme wordt door σ en kan heel verschillend voor verschillende celtypen. (Voor meer informatie, zie figuur 5B).- Uit deze metingen, bepalen de "cel grootte cutoff": de diameter in px dat de kleinste object nog steeds erkend als een complete cel door het beeld analyse-instrument beschrijft.
- Voer parameters in de respectievelijke vakken op de grafische gebruikersinterface (figuur 5A).
- Voer de celgrootte afgesneden, dat wil zeggen, de minimale celgrootte toegelaten in de simulatie, een diameter px.
- Voer σ in px voor de simulatie van de celgrootteverdeling voor rood, groen en blauw cellen (uit stap 5.9).
- Vink het vakje "Verwijderen" in de subsectie "Cellen in Mask". Met deze instelling zal het programma een nieuwe positie gekozen voor een cel als het overlapt met ten minste één pixel met een verboden gebied van het masker. Vink het vakje "Vermijd cel overlap? ̶1; in de subsectie "Cell uitsluiting".
- Voer de toegestane minimale afstand tussen de middelpunten van twee cellen in px.
OPMERKING: De minimale afstand moet worden bepaald op basis van de opgenomen beelden. Verkeerd gemeten minimale afstanden zal leiden tot vertekende / kunstmatige resultaten voor de vergelijking van opgenomen en gesimuleerde afbeeldingen. - Stel de maximale oppervlakte van overlap tot 100% indien de overlap wordt bepaald door de minimale afstand van centrum tot centrum.
- Stel de simulatietool tot 1.000 herhalingen.
- Vink het vakje "Automatisch opslaan cellen?" Om de coördinaten van de gesimuleerde objecten sparen voor alle herhalingen van elk beeld van de partij als .rect bestanden (tekst-formaat). Vink het vakje "Automatisch opslaan beelden?" Naar een .tiff bestand op te slaan voor elk beeld gesimuleerd. Voer een gemeenschappelijke tag voor de opgeslagen bestanden.
OPMERKING: De "? Automatisch opslaan cellen" optie vermindert simulatie looptijd en de totale hoeveelheid gegevens, in vergelijking met het opslaan van de werkelijke gesimuleerde images. De .rect bestanden de coördinaten van de gesimuleerde cellen rechthoeken en kunnen dus worden omgezet in gesimuleerde beelden indien nodig.
- Start de simulatie door te klikken op "Run simulatie".
OPMERKING: De simulatie-tool genereert een CSV-bestand automatisch voor de 1.000 simulaties van elk beeld, inclusief de gemiddelde contact tellingen en omgeving telt voor rood, groen en blauw cellen met rood, groen, blauw, en stromale cellen voor elke set van herhaalde simulaties . Bovendien, voor al deze waarden gemiddelden van 1000 simulaties met standaarddeviatie (STD) en standaardfout van het gemiddelde (SEM) zijn voorzien. - Bepaal de gemiddelde contact frequenties en omgeving frequenties van een set van 1000 gesimuleerde afbeeldingen. Voor deze, verdeel de gemiddelde contactgegevens en omgeving tellingen door de opgenomen celgetal per beeld. Vergelijk de frequenties de resultaten van het geautomatiseerde co-lokalisatie analyse van het opgenomen beeld.
- Pas geschikte statistical methoden, afhankelijk van de analyse 19 (voor figuur 7, hebben we gebruik gemaakt van een tweezijdig Wilcoxon signed rank test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Snijden cryosecties van ontkalkte bot met Kawamoto tape methode maakt het hele bot te snijden als een intact deel, het beenmerg van de endosteale regio nog aan de gemineraliseerde bot, zowel in de diafyse als in de epifyse gebieden met hun hoge dichtheid van trabeculair bot (Figuur 1). Nucleaire kleuring van secties blijkt dat hoewel kleine barsten in het preparaat niet volledig kan worden vermeden, de structuur van de sinusoïden en slagaders en de reticulaire netwerk van het parenchym blijft intact.
Als voorbeeld van een immunofluorescentie kleuring van rode fluorescerende chimere beenmerg en de daaropvolgende analyse wordt een kleuring voor eosinofielen (grote basic protein, MBP), PC (κ en λ lichte keten) en B-cellen (B220) getoond. Muizen werden geïmmuniseerd met 100 ug van 4-hydroxy-3-nitrofenylacetyl hapteen gekoppeld kip γ globuline (NP-CGG) in aluin ip, 4 weken nareconstitutie, gestimuleerd met 50 ug van NP-CGG in PBS iv 21 dagen later en geanalyseerd op dag 30 na de boost. De geautomatiseerde beeldanalyse resulteerde in een zeer precieze herkenning van de stromale structuren, waaronder ook zeer kleine fragmenten van reticulaire processen. Aangezien het cel aantal stromale cellen niet kan worden bepaald met de hier gepresenteerde systeem (zie tevens) geen groottedrempel werd voor de stromale kanaal om alle fragmenten in het te detecteren (Figuur 2). PC en eosinofielen zijn groter dan B-cellen en tonen ook een heterogene vorm. Alle drie de soorten cellen zijn goed herkend op het eerste gezicht. Cellulaire clusters, vooral B-cellen, werden goed gescheiden. De analyse tool is geoptimaliseerd voor de bovengenoemde typen cellen (eosinofielen, PC, B-cellen). Voor andere celtypen kunnen aanpassingen nodig zijn. De CSV-bestanden die zijn gegenereerd door de cel contact instrument bevat de volgende relevante meetwaarden voor hematopoietische cellen:celgetal voor elke cel populatie; totale oppervlakte voor elke cel populatie in px; contact telling van rode cellen (in dit geval eosinofielen), groene cellen (hier PC) of blauwe cellen (hier B-cellen) met rood, groen, blauw of grijs cellen (stromale cellen). De CSV-bestanden die zijn gegenereerd door de cel omgeving instrument bevat de volgende metingen voor hematopoietische cellen: celgetal voor elke cel populatie; totale oppervlakte voor elke cel populatie in px; nabijheid telling van rode, groene en blauwe cellen met rood, groen, blauw en grijs cellen (stromale cellen).
Om de kwaliteit van de beeldanalyse te valideren, werden de resultaten van de automatische analyse vergeleken met die van een handmatige telling van 6 getrainde beoordelaars (figuur 3). Alle beoordelaars kregen identieke beelden voor analyse. Stromale structuren en hematopoietische cellen werden zorgvuldig geschetst met een beeld analyse-instrument en deze regio's van belang werden opgeslagen en geanalyseerd. Voor stromale structuren, de totale oppervlakte per beeldwas vergeleken tussen geautomatiseerde en handmatige analyse. Stroma structuren bleek moeilijk voor de getrainde beoordelaars precies herkennen, zoals blijkt uit het grote verschil waargenomen voor de grootte van de totale oppervlakte van stroma handmatig geteld (figuur 3A). Hier, de geautomatiseerde analyse bepaald een waarde dicht bij de gemiddelde oppervlakte gedetecteerd door getrainde beoordelaars. Voor alle cellen, de geautomatiseerde analyse-instrument bepaald een iets lagere hoeveelheid cellen dan handmatig geteld. Voor PC en eosinofielen, het aantal nog in het traject van interbeoordelaarsovereenstemming variantie waargenomen voor de handmatige tellingen. Het aantal B-cellen gedetecteerd door geautomatiseerde analyse was echter iets onder dit bereik (figuur 3A). De gemiddelde celgrootte (gebied px) zoals bepaald door de geautomatiseerde analyse was 512 px voor PC, 436 px voor eosinofielen en 317 px voor B-cellen terwijl getrainde beoordelaars bepaald een maat van 515 px voor pc's, 464 px voor eosinofielen, en 291 px voor B-cellen. Zo is de gemiddelde Cell maat voor B-cellen, PC en eosinofielen bepaald door de geautomatiseerde analyse was vergelijkbaar met de gemiddelde cel grootte bepaald door handmatige beoordelaars (figuur 3B). Deze geautomatiseerde beeldanalyse tool kan nu gebruikt worden om rechtstreekse contacten van kandidaat beenmerg niche celtypen te kwantificeren. Bovendien kan de frequentie van cellen van een bepaald celtype omringende stromale cellen of andere hematopoëtische celtypen worden bepaald. Een analyse van beenmerg pc en de veercontacten cellen, eosinofielen, B-cellen stromale en andere PC wordt getoond, alsmede de frequentie van PC naburige deze celtypen binnen 10 en 20 urn (figuur 4A). Bovendien kan het contact frequenties van verschillende hematopoëtische celtypen met stroma kan (figuur 4B).
Voordat een simulatie van willekeurige beenmerg positionering van deze cellen met het simulatieprogramma, de parameters die de cel grootteverdeling beschrijven als een GausSian distributie moeten worden bepaald. Voor een Gaussische verdeling, die kan worden gevisualiseerd als een symmetrische en "klokvormige" curve, hoeft slechts twee parameters worden bepaald: de locatie van het centrum van de kromme (de modus, dat wil zeggen wanneer de piek van de kromme ligt ) en de breedte van de symmetrische curve (dit wordt beschreven door de hierboven beschreven parameters σ). Deze procedure wordt hier getoond PC, eosinofielen, en B-cellen (Figuur 5B). Gemeten celgrootte verdelingen tonen dat voor B-cellen, de breedte van de verdelingskromme beschreven σ kleiner dan voor PC's en eosinofielen. Voor de simulatie werd de relatieve waarden van σ gemeten voor de drie celpopulaties gehandhaafd (bijvoorbeeld B-cellen werden altijd gesimuleerd door een tweemaal zo nauwe grootteverdeling dan PC en eosinofielen), terwijl de σ waarden gedefinieerd in px waren ingesteld op de visuele weergave van de opgenomen cellen overeenkomen (Figuur6B). Dit leidde ons naar een σ van 2 px voor B-cellen en een σ van 4 px voor zowel pc's en eosinofielen toepassing. De celgrootte cutoff werd bepaald uit de gemeten celgrootte verdelingen. Voor PC en eosinofielen, een cutoff bij 300 px objectgrootte, waardoor 20 px diameter voor een cirkelvormig object (ongeveer 7 um) en B-cellen een cutoff bij 220 px, leidt tot een 17 px diameter (ongeveer 6 um) werd gebruikt voor de simulatie.
Om gebieden in de gesimuleerde willekeurige beeld waarbij cellen worden toegestaan door de simulator te plaatsen definiëren, werd een masker gegenereerd nucleaire signalen in de DAPI kanaal van beenmerg histologische beeld (figuur 6A). Een waarde van 10 werd bepaald om de optimale intensiteit drempel voor het genereren van de binaire beelden (bovenste paneel, rechter afbeelding) zijn. De drempel bepaald door Otsu's algoritme niet leidt tot volledige erkenning van alle kernen in de afbeelding (bovenste paneel, afbeelding midden), op dezelfde wijze als vaste intensiteitdrempelwaarden van 50 of 150 (onderste paneel, links en beeldcentrum) .De relevantie contacten pc, eosinofielen, of B cellen met stromale cellen (Figuur 4B) werd getest met het simulatieprogramma (figuur 7). Deze analyse onthulde significant hoger contact percentages in de opgenomen beelden opzichte van de simulatie voor PC's en B-cellen (Figuur 7A), in overeenstemming met het concept van stromale nissen ondersteuning van deze populaties. Dit werd bevestigd in 5 afzonderlijke fluorescerende chimere muizen (figuur 7B, D). Daarentegen werd geen verschil vastgesteld bij eosinofielen (Figuur 7A, C).
Figuur 1. Overzicht fluorescentiebeeld van een langsdoorsnede van een muis femur cryosectioned met Kawamoto de tape methode. De tape werkwijze maakt cuttinG secties met een intact endosteal gebied, zowel in de diafysaire als in de epifyse gebieden uit ontkalkte bot. Een 7 urn dik been gedeelte van een naïeve C57BL / 6 muis werd gekleurd voor het extracellulaire matrix eiwit laminine (rood), voor Sca-1 tot arteriolen (groen) en kernen (blauw, DAPI) visualiseren. 47 tegels van 1.446 x 1.088 micrometer, resolutie van 1360 x 1024 px werden opgenomen en gestikt om het overzicht beeld te creëren. Dit beeld werd verkregen op een wide-field fluorescentie microscoop, met een 10x objectief (0,45 NA). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Automatische detectie van stromale en hematopoietische beenmergcellen. Een dijbeen deel van een rode fluorescerende chimeric muis op dag 30 na de boost werd gekleurd voor RFP (grijs) tot stroma, MBP (rood, eosinofielen), κ en λ lichte keten (groen, PC's) en B220 (blauw, B-cellen) te visualiseren. Links: Oorspronkelijke beeld verkregen op een confocale microscoop met een 20X objectief (0.8 NA) en een gezichtsveld van 708,15 x 708,15 urn. Rechts: Gesegmenteerde afbeelding. De contouren van de erkende objecten worden gemarkeerd. De witte rechthoeken geven de op de onderste foto gebied. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Validatie van de geautomatiseerde beeldanalyse door getrainde beoordelaars. (A) Totale oppervlakte van stromale structuren en het totale aantal cellen van hematopoietische cellen geteld door getrainde beoordelaars in één (stromale structuren), 10 (PC's), twee (eosinofielen) en één afbeelding (B-cellen) in vergelijking met het aantal cellen verkregen door geautomatiseerde beeldanalyse. Stippen vertegenwoordigen individuele beoordelaars (n = 5-6). Staven geven gemiddelde waarden of automatisch bepaalde waarden. (B) Object grootteverdeling van handmatig geteld objecten vergeleken met het gemiddelde objectgrootte bepaald met geautomatiseerde analyse. Om rekening te houden met de verschillende frequenties van de verschillende celtypen, PC werden geteld in 10 eosinofielen in twee en B-cellen in een beeld. Stippen vertegenwoordigen afzonderlijke objecten. Lijnen geven de gemiddelde. (C) Handmatige schetsen van stromale structuren door getrainde beoordelaars. Links: originele afbeelding. Midden: voorbeelden handmatig geanalyseerde beelden. Rechts:. Stromale structuren gedetecteerd door geautomatiseerde analyse Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
"Figuur 4" src = "/ files / ftp_upload / 52544 / 52544fig4highres.jpg" width = "700" />
Figuur 4. Geautomatiseerde co-lokalisatie analyse pc, eosinofielen, B-cellen en stromale cellen in de femorale beenmerg. (A) Linker: Frequentie van PC's in direct contact met stromale structuren, eosinofielen, B-cellen of andere PC fluorescerende chimere muizen op dag 30 na de boost. Midden en rechts: Frequentie van de pc's in 10 micrometer buurt of 20 pm nabijheid van stromale structuren, eosinofielen, B-cellen of andere pc's. Delen van deze figuur (direct contact, 10 urn omgeving) gemodificeerd van Zehentmeier et al. 9 (B) Frequentie van PC, eosinofielen en B-cellen in direct contact met stromale structuren. 52-515 PCs, 918-3179 eosinofielen, 4146-13.063 B-cellen in 10-21 beelden werden geteld vanaf 5 tl-chimere muizen op dag 30 na de boost, samengevoegd uit twee onafhankelijke experimenten. Stippen vertegenwoordigen individuele muizen. Lijnen geven mediaan.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Bepaling van de celgrootteverdeling van beenmerg PC, eosinofielen en B-cellen. (A) Screenshot van de grafische gebruikersinterface (GUI) van de simulator. (B) De celgrootteverdeling (gebied px) pc (κ en λ lichte keten, groen), eosinofielen (MBP, rood) en B-cellen (B220, blauw) wordt weergegeven in histogrammen zoals gemeten na het herkennen van objecten door Volocity software (bovenste paneel). In femorale beenmerg beelden (onderste paneel), gedetecteerd pc's zijn rood gemarkeerd (overlay geel), eosinofielen in het blauw (overlay violet) en B-cellen in het geel (overlay grijs). Beeldsegmentatie werd uitgevoerd door het instellen van een minimale grootte drempel van 180 px voor pc's,300 px voor eosinofielen en 220 px voor B-cellen. 250 objecten werden gemeten voor PC, 650 objecten voor eosinofielen en 3.000 objecten voor B-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Generatie van het masker gesimuleerde willekeurige cel positionering. (A) Het oorspronkelijke DAPI kanaal (geel) en overlays DAPI binaire beelden gegenereerd door het toepassen van verschillende drempels getoond. Het masker gegenereerd uit het binaire beeld (drempel ingesteld op 10) is hieronder (onderste paneel, rechts afbeelding) weergegeven. Zwarte gebieden vertegenwoordigen no-go zones, witte gebieden vertegenwoordigen gebieden waar de cellen mogen worden geplaatst. (B) Het opgenomen beeld (links) en de bijbehorende afbeelding gesimuleerde (rechts) vertonen een hoge visuelegelijkenis. Eosinofielen (MBP), pc's (κ en λlight keten), B-cellen (B220) en stromale cellen (RFP) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Direct contact van hematopoietische celtypes met stromale structuren in opgenomen versus gesimuleerde afbeeldingen. (A) Frequentie van PC, eosinofielen en B-cellen in direct contact met stroma in gesimuleerde opzichte opnamen fluorescerende chimere muizen op dag 30 na de boost. Lijnen verbinden overeenkomstige gesimuleerd en opgenomen beelden (dots). Foto's van een representatieve muis worden weergegeven in elk perceel. (B) Frequenties pc, eosinofielen en B-cellen in direct contact met stroma in gesimuleerde opzichte opnamen van 5 individuele muizen uit twee onafhankelijke experimenten. Wilcoxon test, tweezijdig (PC's: *** p = 0,0001; * p = 0,0371; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001; eosinofielen: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; * p = 0,0161, p = 0,4143; *** p = 0,0007, B-cellen: **** p <0,0001 ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0.0012 ; **** p <0,0001). Stippen vertegenwoordigen afzonderlijke beelden. Balken geven gemiddelde. P-waarden 0,05 worden beschouwd als belangrijke verschillen. Sterretjes in cijfers geven de volgende P-waarden: ns: p> 0,05; *: P 0.05; **: P 0.01; ***: P 0.001; ****: P 0.0001. Delen van dit cijfer (direct contact van pc's met stromale structuren) zijn gewijzigd ten opzichte van Zehentmeier et al. 9 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
700 "/>
. Figuur 8. complete workflow van de kwantificering aanpak voor hematopoietische cellen - stromale cel interacties in muizen beenmerg De aanpak is verdeeld in drie grote delen: 1. muizen beenmerg secties worden voorbereid en ruwe data wordt verzameld door laser scanning confocale microscopie, 2 . de automatische analyse van de opnamen en de simulatie van willekeurige positionering van beenmergcellen wordt uitgevoerd, 3. verkregen geregistreerd en gesimuleerde afbeeldingen het contact en waaraan tellingen worden vergeleken. De ingang (beeldbestanden) en output (tekstbestand) van de geautomatiseerde analyse is aangegeven in blauw, wordt de input (beeldbestanden) en output (tekstbestanden en eventueel beeldbestanden) van de simulatietool groen aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de vooruitgang in de moderne optische beeldvorming methoden, is de analyse van histologische gegevens nog vaak gehinderd door het ontbreken van een goede kwantificering instrumenten en methoden, of door bevooroordeelde analyses die zich richten op een klein gebied van belang. De synergetische aanpak hier gepresenteerde combineert beeldanalyse die het hele beenmerg regio, geautomatiseerde segmentatie en het herkennen van objecten van verschillende hematopoietische en stromale celtypen, co-lokalisatie analyse, en tenslotte een validatie-instrument van niet-willekeurig voorkomende contacten geleverd door een nieuwe op maat ontworpen simulatiesoftware.
Histologie van gehele botten zoals het beenmerg is moeilijk uit te voeren als gevolg van de verschillende dichtheden weefsel aanwezig in één sectie - enerzijds de zeer harde, gemineraliseerde bot, anderzijds de zeer kwetsbare merg, die gemakkelijk wordt verstoord snijvlak samen met het been. Als alternatief, de tape werkwijze voor het snijden bot secties prèsteerde hier 14,15 heeft het voordeel dat het weefsel stabiliseert, waardoor waardoor de endostale gebieden intact (Figuur 1). Behalve rijk aan osteoblasten werden deze gebieden zouden een rol stamcel onderhoud 20 spelen.
De cruciale rol van stromale cellen in ontwikkelingsprocessen en cellulaire onderhoud in het beenmerg wordt steeds duidelijker. De analyse van deze zeldzame, kwetsbare cellen is moeilijk gebleken om twee redenen: ten eerste, deze moeilijk te isoleren van het beenmerg; ten tweede wordt de mate van heterogeniteit tussen de stromale bevolking niet bekend, dus net een belangrijke populatie mist door bepaalde merkers die zijn beschreven voor bindweefselcellen. Werkwijze fluorescerende beenmerg chimaera genereren nuttig fluorescerend merkteken en het beenmerg stromale cellen bevolking later geanalyseerd. Er moet echter worden opgemerkt dat in deze mice alle mesenchymale cellen van het beenmerg worden gevisualiseerd, zoals endotheelcellen en osteoblasten. Hiermee dient rekening te worden gehouden indien de data van dergelijke chimere muizen geanalyseerd. Hoewel er ook een risico van hematopoïetische cellen van de ontvanger oorsprong overleven bestraling, deze cellen gewoonlijk slechts in een zeer klein gebied per veld vergeleken met de donor CD45 + cellen dus niet de histologische analyse 9 beïnvloeden. Het is duidelijk dat deze werkwijze worden gecombineerd in een volgende stap met een meer specifieke detectie van stromale (sub) populaties. Momenteel is de analyse van deze cellen meestal gedaan door histologie als gevolg van de hierboven genoemde redenen, het opleggen van een limiet aan het aantal parameters die kunnen worden geanalyseerd op hetzelfde moment. De ontwikkeling van multi-parameter analyses microscopie zal helpen om deze beperkingen te overwinnen.
Tijdens beeldanalyse, werd de segmentatie uitgevoerd met de oorspronkelijke Otsu algoritme. WezenDeze clustering gebaseerde drempelwaarden methode bepaalt automatisch de intensiteit drempel voor de optimale scheiding van de voorgrond (signaal) en achtergrond (ruis) pixels in twee groepen met de laagste statistische divergentie in een gegeven kanaal, wat resulteert in een binair beeld 17. Hier werd werkwijze Otsu is op de natuurlijke logaritme versie van het oorspronkelijke beeld, dat is:
Image input voor Otsu = ln (image Input)
Dit werkt beter voor fluorescentiebeelden sinds methode Otsu's dim cellen kunnen identificeren als achtergrond. De logaritmische functie toevoegen zorgt voor een betere scheiding van de cellen en achtergrond in twee verschillende klassen van Otsu algoritme. Echter, de intensiteit drempelmethode alleen is niet genoeg om enkele voorwerpen nauwkeurig te detecteren. Het werkt efficiënt bij het detecteren goed gescheiden objecten in beelden, maar is niet voldoende om afzonderlijke enkele cellen zich in clusters. Aangezien sommige van de celtypen diewerden van belang voor ons, zoals eosinofielen of B-cellen, worden vaak geclusterd in het weefsel, werden de kernen in het DAPI kanaal gesegmenteerd behulp van een algoritme op basis van de K-means clustering van het histogram met k = 10 21. De cel segmentatie algoritme zal de helderste om de zwakste pixels (geclusterd in 10 bakken) plotten en voortdurend op zoek naar de vorming van cel-gelijkende voorwerpen. Deze objecten worden dan gedefinieerd als cellen. Wanneer alle pixels zijn gebruikt, worden de verkregen kernen verwijd om een masker dat dan wordt toegepast op de andere kanalen cluster scheiding genereren.
Opgemerkt zij dat deze analyse werkt goed voor hematopoïetische cellen die compact zijn, maar dat het beperkt met betrekking tot stromale cellen, is het niet mogelijk om de grenzen van deze grote, uitgespreide cellen te bepalen vanwege de koppeling van hun dendritische extensies die een reticulaire netwerk. Aldus cel telt stromacellenkan worden geleverd. Labeling enkelvoudige cellen via lot-mapping reporters onder controle van stroma promotors dit probleem op te lossen, worden volgens de verschenen voor neuronen (de "Brainbow" systeem 22) en de etikettering van folliculaire dendritische cellen in de lymfeknopen 23.
Naast toepassing van een ruisonderdrukking stap om alle kanalen exclusief voorwerpen hieronder 30 px, werd op grootte toegepast bij de werkwijze volgens objectherkenning voor hematopoïetische cellen maar niet stromale. Kleine fragmenten van cellen die werden gesneden door het snijden kunnen worden uitgesloten; echter kan het verlies worden verwaarloosd dit geval ten gunste van een ondubbelzinnige herkenning van de cellen. Uitbreiding van de analyse en simulatie van twee naar drie dimensies deze beperking overwinnen. De ontwikkeling van methoden om cellulaire distributie in geheel mounts, bijvoorbeeld door multi foton microscopie of lichte plaat microscopie / SPIM bestuderen, zal zeker helpen in this respect. Om de complexe cellulaire samenstelling van meerdere componenten niches bestuderen, zal het ook nodig zijn om het aantal parameters dat wordt geanalyseerd in situ verlengen. Veelbelovende benaderingen voor multiparameter analyse van histologische gegevens in combinatie met cytometrische kwantificering zijn onlangs verschenen 24, 25.
Het contact werd uitgevoerd door het kwantificeren van de overlap van twee objecten. Direct contact werd gedefinieerd als een overlapping van ten minste één pixel. Belangrijk is dat deze analyse beperkt door de resolutie van de microscopiebeelden en dus afhankelijk van de golflengte en excitatiemode, en op de numerieke apertuur van de objectieflens in de microscoop, en de pinhole grootte. In de hier getoonde analyse, een 0,8 NA, 20X objectief met fluorchroom combinaties enthousiast met 488, 561, 594 en 633 nm met behulp van een foton excitatie werd toegepast. Vandaar, laterale resolutie waarden tussen0,372 en 0,483 micrometer werden bereikt. Dit maakt het mogelijk uitspraken te doen over het naast elkaar bestaan van verschillende cel subsets; hieronder vallen echter geen informatie over mogelijke moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de cellulaire interacties geven. Bovendien kunnen andere werkwijzen zoals 2-foton intravitale microscopie nodig zijn karakterisatie van deze intercellulaire contacten 9 verbeteren. Förster-resonante energieoverdracht (FRET) gebaseerde systemen kunnen helpen om te bevestigen dat deze interacties daadwerkelijk functioneel 26.
Om de cellulaire micro weefsel niches analyseren, is het niet alleen cruciaal om de directe cel contacten analyseren, maar ook de celtypen te kwantificeren in de nabijheid van een bepaald celtype van belang ("omgeving analyse"). Eerder gepubliceerde studies gemeten afstanden tussen cellen en weefsels structuren zoals schepen basis van de positie van de kern 27. Omdat we geïnteresseerd waren in determining de afstand van verschillende celtypen, gedeeltelijk met variërende verhoudingen van nucleaire cytoplasmatische volume wij de voorkeur de afstand tussen de oppervlakken te meten. Daartoe berekenden we de nabijheid radius door bepaling van de Euclidische afstand van een cell's begrenzing na het converteren van de waarden pm tot px. De Euclidische afstand is de lineaire afstand tussen twee pixels en kan worden beschreven door de formule 28: 
Cellen met pixels van hun grenzen binnen een Euclidische afstand van bijvoorbeeld 10 micrometer uit de pixels van de grenzen een doelcel's werden geteld als naburige deze cel.
In zijn huidige vorm, de analyse bepaalt alleen of een cel in contact of benaderd door een andere cel van dezelfde of verschillende soort, waardoor slechts een binaire JA / NEE karakterisatie. Het werkelijke aantal cellens dat de cel van belang te contacteren of zijn binnen een bepaalde straal van het is niet berekend. De volgende stap is de huidige analyse op een wijze die de groepen van contact of naburige cellen kan worden gedetecteerd en vergeleken tussen verschillende doelwitcellen van hetzelfde type verlengen. Dit leidt tot belangrijke informatie over de samenstelling van beenmerg nissen, zoals de overleving niche beenmerg plasmacellen, waarvoor een variërende bijdrage van hematopoietische accessoire cellen is besproken 29-33.
De algoritmes object herkenning werden samen geoptimaliseerd met de specialisten van Wimasis met behulp van hun handel verkrijgbare oplossing op maat service en zijn beschikbaar op aanvraag. Een andere optie is om hetzij in de handel verkrijgbare software voor beeldanalyse zoals Definiens, Volocity of Imaris of freeware zoals CellProfiler gebruiken.
De geautomatiseerde cel segmentatie en beeldanalyse tools die weopnieuw gevalideerd door vergelijking van de resultaten met manueel geanalyseerde gegevens van 6 getrainde beoordelaars beeld met betrekking tot twee parameters, namelijk de objectgrootte en het aantal cellen in verschillende celpopulaties. Zoals getoond in figuur 3B, de gemiddelde grootte object voor hematopoïetische cellen (pc, eosinofielen, en B-cellen) was vergelijkbaar tussen beide methoden, met een hogere variantie groottebepaling handleiding voor plasma cellen en eosinofielen, waarschijnlijk omdat zij een onregelmatige vorm vergeleken B cellen. De automatische detectie van het aantal cellen leverde iets lagere waarden dan de handmatig opgespoord degenen. Opmerkelijk waren steeds binnen het bereik van de handleiding waarden voor eosinofielen en PC, terwijl zij onder deze waarden bij B-cellen, waarschijnlijk door een hogere heterogeniteit van expressie van B220, dat werd gebruikt als marker voor B-cellen. B220 is bekend dat up-gereguleerd in B-celdifferentiatie in het beenmerg, en B-cellen met lage en hoge Intensity kleuring voor B220 worden waargenomen. B-cellen met lage B220 signalen beneden het toegepaste drempel, die kunnen leidden tot uitsluiting van de vroegste fasen B-cellen. Een lagere drempel voor de automatische opsporing kan dit probleem op te lossen. Voor stromale cellen, die moeilijker te detecteren zijn door hun minder compact, meer dendritische en uitgestrekte morfologie, de handmatige detectie resulteerde in hoge verschillen tussen individuele beoordelaars. Interessant is dat de gemiddelde totale oppervlakte van stroma was gelijk aan de totale oppervlakte automatisch bepaald, wat aangeeft dat de analyse goed geschikt om te compenseren voor individuele voorspanning door de beoordelaars. Samengenomen tonen deze gegevens dat de resultaten een geautomatiseerde vertegenwoordigen de gemiddelden van handmatige analyses en zijn goed geschikt voor interrater variabiliteit te verminderen in de analyse.
Om willekeurige en niet-willekeurige positionering van cellen in de structurele beperkingen van het weefsel te onderscheiden, werd een simulatieprogramma ontwikkeld. During van de simulatie wordt een kunstmatige afbeelding met willekeurig geplaatste hematopoietische cellen aangemaakt voor elke opgenomen beenmerg afbeelding histologische. Eerst wordt het de stroma-kanaal gebruikt in het oorspronkelijke formaat. Een masker wordt gegenereerd uit beeld DAPI door een vaste-intensiteit gebaseerde drempel, waardoor de afbeelding omzetten in binair formaat; het binaire masker ondergaat meerdere stappen van pixels gebaseerde dilatatie en erosie. Het masker definieert gebieden in het veld afbeelding waar gesimuleerd cellen mogen worden geplaatst. De coördinaten van de centra van de gesimuleerde cellen worden verschaft door een uniforme random number generator, waarvan de grenzen waar bepaald wordt door de beeldgrootte. Informatie over het aantal cellen en de gemiddelde celgrootte voor elke populatie bepaald door geautomatiseerde beeldanalyse van de opgenomen beelden worden gebruikt om de gesimuleerde hematopoëtische celpopulaties te bepalen. De gesimuleerde celdiameter wordt verondersteld een eendimensionale Gauss-verdeling volgen waarvan de juistecel diameter wordt willekeurig gekozen: De diameter wordt dan aangepast zodat celgrootte cut-offs voor de minimaal toegestane grootte van het object worden geïntroduceerd. Mocht de gesimuleerde cel worden geplaatst dat één of meer pixels overlappen een verboden gebied of zou binnen een vooraf bepaalde afstand van een reeds geplaatste cel (4 urn van centrum tot centrum zoals bepaald opgenomen beelden), nieuwe willekeurige coördinaten worden gekozen, terwijl de diameter ongewijzigd wordt gelaten. Dit wordt herhaald totdat het aantal gesimuleerde cellen gelijk aan het aantal cellen in het opgenomen beeld.
Het instrument is gebaseerd op de veronderstelling dat hematopoietische cellen vrij in het beenmerg kan worden geplaatst, terwijl stromale structuren als een vaste matrix binnen het weefsel. Het instrument werd geoptimaliseerd om de situatie in het beenmerg waar parenchymale gebieden doorkruist door een complex systeem van sinusoïden. Een soortgelijke modelmatige benadering werd onlangs gepubliceerd door Frenette en collega's omde ligging van hematopoietische stamcellen te analyseren met betrekking tot stromale cellen en vasculaire structuren, die ongeveer 30% van de totale femorale beenmerg volume 25. Om te corrigeren voor dit effect is het simulatieprogramma hier gepresenteerde basis van een masker gebieden werden cellen mogen worden gebracht. Dit werd bereikt door het nucleaire vlek, waarbij de objecten die de kernen werden uitgebreid met een 5-staps verwijding gebruikt (zie figuur 6) na de binarisatie. Gebieden met een lage celdichtheid, dwz lage dichtheid van kernen zoals bot en sinusoïden, draagt niet bij aan het masker en daarom worden verboden gebieden. Met het oog op een kunstmatige vermindering van deze no-go zones door de dilatatie procedure te vermijden, werd een 5-stap erosie vervolgens toegepast, waardoor de heropening grotere uitsluiting gebieden, terwijl de hoge nucleaire dichtheid (vandaar 'toegestaan') gebieden onveranderd. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast voor andere lymfoïde organen. In deze tproblemen werden deze methode mogelijk niet (bijvoorbeeld in gebieden waar cellen met een hoge cytoplasma / kern verhouding aanwezig zijn), andere methoden zoals cytoplasmische labeling kan worden gebruikt om het masker te maken.
Hematopoietische cellen werden gesimuleerd cirkelvormige objecten waarvan de grootte werd bepaald met een Gaussian random number generator, het gemiddelde waarvan overeengekomen met de berekende gemiddelde diameter van elk celtype. De breedte van de verdeling is gebaseerd op gemeten celgrootte verdelingen in het opgenomen beeld als bepaald met beeldanalyse software. Teneinde rekening te houden dat kleincellige fragmenten werden uitgesloten van de geautomatiseerde beeldanalyse werden celgrootte cut-offs ingevoerd bepaald uit de gemeten celgrootte verdelingen voor elk celtype (zie figuur 5).
Uiteraard Dit werkt goed voor celtypen die relatief uniform in omvang en vorm, maar kan leiden tot problemen bij cellen die eenopnieuw zeer heterogeen met betrekking tot deze parameters. Opgemerkt zij dat deze analyse is geoptimaliseerd voor grote hematopoietische celtypes in het beenmerg (granulocyten, hematopoëtische voorlopercellen en lymfocyten) die gemeen hebben dat zij over een regelmatige, bijna ronde vorm. Echter, deze methode niet getest op dendritische cellen of macrofagen, celtypen met sterk onregelmatige cellichamen. Het analyseren van dergelijke cellen zullen nieuwe uitdagingen presenteren onze geautomatiseerde beeldanalyse evenals de simulatiebenadering, waaronder de behoefte aan verbeterde celcluster scheiding algoritmen 24 en gedetailleerde vorm-analyse en simulatie van niet alleen verschillende grootte maar ook anders gevormde cellen. Een alternatief zou een simulatie benadering die werkt met exact vormen als geconstateerd wordt. Er moet echter worden opgemerkt dat deze werkwijze leiden tot een vergroot deterministisch gedrag van het modelsysteem.
Voor de gesimuleerde ervariments, 1000 herhalingen van de simulatie voor ieder opgenomen beeld gegenereerd. Met zoveel herhalingen zal de relatieve fout bijgedragen door de simulatie zelf verlagen tot ongeveer 3%. Namelijk, als de cel-cel co-localisatie worden berekend met simulaties die willekeurig zijn dan de simulatie zelf wordt gekenmerkt door een N -1/2 foutfunctie, waarbij N het aantal simulaties gemeten per beeld. Dit is de bijdrage van de simulatie proces zelf aan de geaccumuleerde fout van de gemeten co-lokalisatie waarden. Zo N = 1000 de ingebrachte fout is 3.16%. De hier getoonde simulaties liep voor 20 tot 60 minuten per afbeelding per 1.000 herhalingen als alleen het opslaan van de gesimuleerde afbeeldingen als .rect bestanden (een eenvoudige tekst-formaat) in plaats van als werkelijke beelden in JPEG of TIFF-formaat (ook een optie in de software ).
Samen genomen, deze aanpak zorgt voor een onbevooroordeelde, high-throughput analyse van histologische afbeeldings en maakt het genereren van statistisch relevante gegevens. Dit kan nuttig zijn bij het vergelijken van de cellulaire lokalisatie onder verschillende omstandigheden. Bovendien, de temporele component kan in de toekomst worden geïntegreerd in een modelleeraanpak beenmerg celbewegingen, zoals meer gegevens over de beweeglijkheid van verschillende celtypes in het beenmerg beschikbaar. Deze werkwijze kan dan worden gesimuleerd storingen van het systeem, zoals de activering van cellen uit het beenmerg in de circulatie, bijvoorbeeld neutrofielen in het geval van een acute ontsteking 34. Om de functie van het beenmerg als opslagplaats voor het immuunsysteem geheugencellen verder te ontrafelen, kan men zich ook voorstellen uit te breiden tot de concurrentie te overleven factoren te modelleren. Ook zou het mogelijke overspraak tussen verschillende nissen worden aangepakt, evenals de inductie van nissen. Samen, zal dit helpen om de fysiologische veranderingen te begrijpen (bv triggers voor regeneratieve gedrag in stamcellen) als well als pathologische verstoringen van het systeem als geheel, bijvoorbeeld bij auto-immuunziekten, neoplasie, of acute inflammatie. Als onderdeel van een iteratief concept experiment en modellering, nieuwe hypothesen kunnen worden gegenereerd op basis van simulaties, die op hun beurt weer experimenteel getest, teneinde zo verder begrijpen van de werking en interactie van verschillende celtypes in de complexiteit van weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Andreas Radbruch voor waardevolle discussies. We zijn dankbaar voor Gruczek, Patrick Thiemann en Manuela Ohde Sabine voor hulp bij de verzorging van dieren en Robert Günther voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken onze getrainde beoordelaars Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache en Katharina Hoorn voor de evaluatie van de histologie monsters en Randy Lindquist voor het proeflezen van het manuscript. Wij danken J. en N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA voor MBP-specifieke antilichamen.
Dit werk werd ondersteund door DFG HA5354 / 4-1, van Jimi-een DFG kernfaciliteit netwerk subsidie voor opklaren en door TRR130 / TP17, en DFG VOOR 2165 (HA5354 / 6-1) te AEHSZ werd gesteund door de International Max Planck School voor Infectieziekten en Immunologie (IMPRS-IDI), Berlijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neomycin |  Sigma |
N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) | Sigma |
P4333, H3375 | |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland |
D602-0100 | |
| 20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sucrose | Carl Roth |
4621.1 | |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma-Aldrich |
179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07 |
| Hexane | Sigma-Aldrich |
208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura |
4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura |
4583 | |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP |
||
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP |
||
| Microtome blade MX35 premier plus, low profile | Thermo Scientific |
3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01") |
| Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland |
600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies |
S-32355 | |
| Rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies |
A-21247 | |
| Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| Mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| Rat anti-k light chain - FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma |
D9542 SIGMA | |
| Fluorescent mounting medium | DAKO |
S3023 | |
| Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth |
H875.2 | |
| Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) | VWR |
48311-703 | |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich |
The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request. | |
| VC2012 runtime | Microsoft | free download | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download) | ||
| Fiji image analysis software | free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al.
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E.
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells - a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
