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Medicine

Ein Mausmodell von arterieller Restenose: Technische Aspekte der Femoral Draht Injury

doi: 10.3791/52561 Published: March 10, 2015

Summary

Die Maus Femoralarterie Drahtverletzungsmodell der Restenose ist technisch anspruchsvoll. In diesem Protokoll zeigen wir die wichtigsten technischen Details unerlässlich für die erfolgreiche Durchführung von Draht Verletzung konsequente Neointima für Studien der Restenose zu induzieren.

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen durch Arteriosklerose ist die häufigste Todesursache in der entwickelten Welt. Einengung des Gefäßlumens, aufgrund atherosklerotischen Plaque Entwicklung oder dem Aufbrechen der etablierten Plaques, unterbricht den normalen Blutfluss führt zu verschiedenen Begleiterkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall. In der Klinik endovaskulären Verfahren wie Angioplastie werden üblicherweise durchgeführt, um den Hohlraum wieder zu öffnen. Jedoch haben diese Behandlungen unvermeidbar beschädigt die Gefßwand sowie die Gefäßendothel Auslösen eines übermäßigen Heilungsreaktion und die Entwicklung einer neointimalen Plaque, die in das Lumen verursacht Gefäß Restenose (Wiederverengung) erstreckt. Restenose bleibt eine Hauptursache für Versagen endovaskulären Behandlungen für Atherosklerose. Somit sind vorklinischen Tiermodellen von Restenose für die Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen sowie Translationsansätze Gefäßinterventionen von entscheidender Bedeutung. Unter mehreren murinen Experimental Modellen wird Femoralarterie Drahtverletzung gilt als die am besten geeignete für die Untersuchung der Restenose nach Angioplastie akzeptiert, weil es ähnelt der Angioplastie-Verfahren, die sowohl Endothel und Gefäßwand verletzt. , Haben viele Forscher jedoch Schwierigkeiten Verwendung dieses Modell aufgrund seiner hohen technischen Schwierigkeitsgrad. Dies ist vor allem, weil ein Metalldraht muss in die Oberschenkelarterie, die etwa dreimal geringer als die Draht eingeführt werden, um eine ausreichende Verletzungen erzeugen prominente Neointima induzieren. Hier beschreiben wir die wesentlichen chirurgischen Details, die wichtigsten technischen Schwierigkeiten dieses Modells effektiv zu überwinden. Indem Sie die vorgestellten Verfahren, die Durchführung der Maus Femoralarterie Drahtverletzung wird einfacher. Sobald vertraut, kann das gesamte Verfahren innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen werden.

Protocol

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HINWEIS: Ethics Statement: Alle Verfahren entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press, 8. Auflage, 2011), und Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of Wisconsin zugelassen. Alle Operationen wurden unter Isofluran-Narkose (durch Einatmen, Durchflussrate von 2 ml / min) durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. Die Tiere wurden in einer Kammer allmählich mit CO 2 gefüllt euthanasiert.

1. Narkoseeinleitung und Hautschnitt

  1. Verwenden männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem Alter von 12-16 Wochen und das Gewicht 23-28 g. Anesthetize das Tier durch Isofluran über einen geschlossenen Kreisnarkosegerät. Überprüfen Sie die Betäubung durch Kneifen seine Zehen. Tragen Sie etwas künstliche Tränen Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern.
  2. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage mit dem linken Hinterbein leicht verschleppt und Kniegelenk slightly gebeugt. Rasieren Sie die Haare um den linken Oberschenkel Region und desinfizieren Sie die Haut mit Chlorhexidin, angewendet dreimal mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren. Verwenden Sie eine heiße Perle Sterilisator, die Instrumente während der Operation sterilisiert zu halten.
  3. Legen Sie eine sterilisierte Gaze Tuch über das linke Bein. Einen 1,5 cm gerader Längs Hautinzision links medialen Oberschenkel vom Kniegelenk auf der Leiste (1A).

2. Exposition der Femoralarterie und Zweige

HINWEIS: 1B zeigt die Bruttogefäßanatomie in den Oberschenkel. Die oberflächliche Oberschenkelarterie (SFA) können durch ein Präpariermikroskop beobachtet, wenn die Inzision richtig entlang der Mittellinie des medialen Oberschenkel vorgenommen werden.

  1. Öffnen Sie die dünne Faszie über dem SFA mit feinen Pinzette und dann die Schleife die SFA mit 9-0 Nylonnaht.
    HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird der N. femoralis ist einfach wie setzenide, aber die angrenzenden femoralis erfordert besondere Aufmerksamkeit, weil ihre Wand ist so dünn, dass es leicht perforiert und blutet. Der Schlüssel Technik ist es, auf die Arterie selbst zu konzentrieren; solange der Präparation wird in der Nähe der Arterie durchgeführt wird, ist jede versehentliche Venenschäden vermeidbar.
  2. Sobald die SFA geschlungen, halten Sie die Naht mit Moskito Pinzette und ziehen Sie sie leicht nach unten. Dieses Manöver macht weitere Präparation leichter, aber um eine Beschädigung der Arterie nicht zu kräftig ziehen.
  3. Weiter sezieren die Arterie proximal zu entlarven und Schleife die A. femoralis communis (CFA) mit 9-0 Nylonnaht.
    HINWEIS: Normalerweise Schleifen des CFA an einem Punkt distal der A. epigastrica (1B) ist ausreichend für Drahteinführung. Halten Sie die CFA Fadenschleife mit Moskito Pinzette auf die gleiche Weise.
  4. Ziehen Sie den CFA Fadenschleife nach oben und der SFA Fadenschleife nach unten, um die Gabelung der SFA und tiefe Oberschenkelarterie (EDA) zu entdecken. Das EDA, der Hauptzweig der CFA,fließt in den Oberschenkelmuskel (1B).
    HINWEIS: Der Draht wird später von der DFA eingefügt werden.
  5. Schleife das EDA mit besonderer Vorsicht, da die angrenzenden Vene unter der Arterie verheddert. Im Falle von Blutungen aus der Vene ist ein 30- bis 60 sec einfache Kompression mit Gaze Regel ausreichend, um die Hämostase zu erzeugen.
  6. Sobald der DFA mit 9-0 Nylonnaht geschleift, sicherzustellen, dass alle drei Nahtschleifen sind an die richtige Position (Abbildung 2A).
  7. Fahren Sie mit der Dissektion der DFA distal, um die Arterie an einer Stelle so weit wie möglich von der Gabelung zu ligieren. Geschnitten zusätzliche Naht lassen aber eine bestimmte Länge, so dass die beiden Enden mit Moskito Pinzette, die die Herstellung von DFA Drahteinsetzlöcher leichter Stabilisierung statt.

3. Erstellen von Draht Injury

  1. Legen Draht über DFA
    1. Belastung der CFA, SFA und DFA Nähten, um eine temporäre hemostat etablieren.
    2. Machen Sie ein kleines Loch in der DFEin mit Mikroschere. Stecken Sie die Spitzen der gebogenen Mikropinzetten, um das Loch groß genug für einen Draht mit einem 0,015 Zoll Durchmesser erweitern (2B zeigt den Größenunterschied zwischen der Arterie und dem Draht).
      1. Bevor Sie ein Loch in der DFA, lösen Sie die CFA Fadenschleife und sanft klemmen / Drücken Sie die DFA mehrmals mit stumpfen bestückte Mikropinzetten. Dieses Manöver erweitert die arteriellen Durchmesser bemerkenswert, um die Drahteinführung zu erleichtern. Befeuchten Sie den Draht sorgfältig mit PBS ist auch wichtig für eine reibungslose Einsetzen.
      2. Wenn ein Loch in der DFA, nicht beschneiden die Arterienwand, aber einen kleinen V-förmigen Spalt und nehmen Sie die Klappe mit spitzen Mikropinzetten für Manipulation.
    3. Führen Sie den Draht durch die angemessen-dilatative Loch auf der DFA. Den Draht vorsichtig voran in Richtung der Darmbeinarterie, während das Lösen der Fadenschleife um das CFA. 5-8 mm reicht aus, um alle CFA Länge in den meisten Fällen zu decken (2C
  2. Lassen Draht innen für 1 Min
    1. Nach dem Einlegen der Kabel an die optimale Länge, lassen Sie es für 1 Minute, um die Arterienwand überfordern. Befeuchten Sie den Draht und Arterien mit PBS, um ein Austrocknen zu verhindern. Eine weitere 9-0 Nylonnaht können rund um die DFA proximal der Drahteinführungspunkt während dieser Wartezeit platziert werden. Dieser Faden wird später verwendet werden, um das Loch auf der DFA nach Entfernen des Drahtes zu schließen.
  3. Abrufen Draht und Fortsetzen der Durchblutung
    1. Halten Sie den Draht mit Schiff Kanülierung Pinzetten, und ziehen Sie sie vorsichtig zurück; der Draht sollte problemlos abgerufen werden. Keinen Widerstand, in der Regel durch die Einhaltung des Drahtes an der Arterienwand, zu überwinden, das Zurückziehen des Drahtes mit leichter Rotation hilfreich. Auch hier könnte eine kraftvolle Manöver in der Tierverlust führen.
    2. Aach das Abrufen der Draht, ligieren die DFA am Verzweigungspunkt mit 9-0 Nylonnaht. Ligieren Sie nicht zu nahe an der Gabelung, die den Blutabfluss an die SFA in Frage stellen würde.
    3. Lösen Sie die SFA und CFA Nahtschleifen, um den normalen Blutfluss wieder aufzunehmen. Beachten Sie, dass die CFA wird durch Drahteinführung (2D) gut ausgebaut.

4. Hautverschluss und postoperative Pflege

  1. Steuer blutet. Minor Nässen durch einfache Kompression gestoppt werden; einige große arterielle Blutungen wird Stiche mit einem 11-0 Nylonfaden erfordern. Diese vernäht Arterien schließlich in Arterienverschluss führen.
  2. Schließen Sie die Haut mit Hautklammergeräte (in der Regel 3-4 Heftklammern) gewickelt. Halten Sie die Wundfläche durch Anwendung Chlorhexidin chirurgische Lösung sterilisiert.
  3. Bewerben postoperative Behandlungen. Steuern Sie den Schmerz der Maus mit subkutanen Injektionen von Buprenorphin. Halten Sie die Maus auf die Erwärmung pad bis sie suf wiederreichend Bewusstsein Brustlage zu halten. Haus in einem sauberen Käfig ohne Begleitung anderer Tiere, bis sie vollständig erholt.

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Representative Results

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Vier Wochen nach der Operation, zu ernten die Draht verletzten Oberschenkelarterie und machen einen Paraffinblock Probe, um die Neointimabildung analysieren. Induzieren Narkose wie oben beschrieben. Sofort Öffnen Sie die Kiste und legen Sie eine 20-Gauge-Butterfly-Nadel in die linke Herzkammer. Schließen Sie die Leitung an einer Infusionsflasche. Führen Perfusionsfixierung über Tropfinfusion von PBS, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (in der Regel 10 bis 20 ml, jeweils). Die Infusionsflasche wird ca. 140 cm höher gesetzt als die Höhe des Herzens, so dass das Tier bei physiologischen pressure.Wait für 20 min durchströmt dann die Draht verletzt CFA und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Machen Sie eine Paraffinblock der Probe mit Standard-histologische Techniken und bereiten Querschnitte von 5 um Dicke zur histologischen Färbung.

Hämatoxylin-Eosin-Färbung wird übersichtliche Visualisierung der Neointimabildung im Inneren des Draht verletzt f ermöglichenemoral Arterie (3A, Draht verletzten Oberschenkelarterie, 3B, unverletzt Femoralarterie) .Verwenden eine richtige Software, um die Lumenfläche (LA), die innere elastische Lamina (IEL) Bereich, und die externe elastische Lamina (EEL) Bereich zu messen vom Querschnitt (3C). Berechnen Sie die Intima-Bereich durch Subtraktion Lumenfläche von IEL Bereich; Berechnung der Medienbereich durch Subtraktion IEL Bereich von EEL Bereich. Bereich / media Flächenverhältnis Intima werden die Neointima-Formationen zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen zu vergleichen.

Figur 1
Abbildung 1: Schematische Abbildungen der Hautschnitt und Gefäßsystem Anatomie. (A) eine entsprechende Hautschnitt ist etwa 1,5 cm in der Länge, entlang der Mittellinie des medialen Oberschenkel. (B) finden Sie die Arteria femoralis superficialis ersten, die A. femoralis communis nächsten, und schließlich dietiefe Oberschenkelarterie. Sezieren jede Arterie sorgfältig ohne Beschädigung der angrenzenden Vene.

Abbildung 2
Abbildung 2: Drahtverletzungsverfahren. (A) Die A. femoralis communis (Pfeil), die Arteria femoralis superficialis (gestrichelter Pfeil), und die tiefe Oberschenkelarterie (Pfeilspitze) freigelegt und durchgeschleift mit Nähten. (B) Beachten Sie den Größenunterschied zwischen den Arterien und der 0,015 Inch Draht. (C) wird der Draht über die tiefe Oberschenkelarterie eingeführt. Halten Sie den Draht in 1 min, um die Arterienwand überfordert zu haben. (D) Der Blutfluss wird wieder aufgenommen. Die A. femoralis communis nach Drahtverletzung (Pfeil) gut ausgebaut. Bar zeigt 1 mm.

Figur 3

Abbildung3: Hämatoxylin-Eosin-Färbung von draht verletzt und unverletzt Oberschenkelarterien. (A) ist ein Querschnitt eines draht verletzten Oberschenkelarterie zeigt eine dicke, hoch zellulären Neointima Plaque. (B) ist ein Querschnitt eines unverletzt Femoralarterie zeigt intakten arteriellen Wandkonstruktionen ohne Neointimabildung. (C) Das grüne Linie skizziert Lumenfläche, die gelbe Linie skizziert innere elastische Lamina, und die blaue Linie skizziert externe elastische Lamina. Bar gibt 100 um.

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Discussion

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Der Draht Verletzungsverfahren ist für alle Stämme von Mäusen, solange ihre anatomischen Strukturen sind ähnlich. 4 In diesem Dokument verwendet man männliche C57BL / 6-Mäuse mit einem Alter von 12-16 Wochen. Wie wir von unseren Vorstudien gelernt, sind die Oberschenkelarterien von Mäusen, die jünger als 10 Wochen oft so klein, dass Drahteinführung ist eine ziemliche Herausforderung. Andererseits ist Drahteinsetzlöcher in Mäusen, die älter als 16 Wochen technisch einfacher, aber neigt dazu, in variabler neointimale Hyperplasie führen. Weibliche Mäuse sind in der Regel weniger neointimalen Bildung als Männer erleiden. Obwohl der Draht Verletzungsverfahren sind auf jeder Seite der femoralen Arterien durchgeführt werden, wir bevorzugen die linke Seite aufgrund der anatomischen Zugänglichkeit für Rechtshänder.

Unter all den Mausmodellen der Restenose nach Angioplastie, arterielle Draht Verletzungen meist imitiert Angioplastie durch endotheliale Denudation und Gefäßwand overstreching. 2,5,6 Esgibt zwei Hauptzieladern für Draht Verletzungen: Beinschlagadern und Halsschlagadern. Von einem technischen Standpunkt aus gesehen, ist Drahteinführung leichter Halsschlagadern, weil sie breiter als Oberschenkelarterien sind. Neigt Neointimabildung jedoch in Karotiden als in Oberschenkelarterien, wahrscheinlich weniger robust sein, da weniger wirksame Abtragung. Einige Autoren verwenden eine handgefertigte Vorrichtung eine aggressivere endothelialen Denudation in Halsschlagadern zu erstellen. 7 Auf der anderen Seite ist der Vorteil der Femoralarterie Drahtverletzungsmodell daß sie mit homogen hergestellt, im Handel erhältlich Drähten durchgeführt, um neointimale Hyperplasie in induzieren eine reproduzierbare Weise.

Um eine erfolgreiche Drahtverletzung in der Maus Femoralarterien zu machen, ist der Schlüssel, um unter einem Binokular mit ausreichender Vergrößerung zu betreiben und feine Instrumente - Mikropinzetten und Mikroschere im Besonderen. MicroTweezers mit scharfen Spitzen sind nützlich, um dissect sich die Gewebe um die Arterie, während die, die mit stumpfen Spitzen sind nützlich, um eine Fadenschleife um die Arterie zu stellen und den Draht Eingangsloch durch einen starken Arteriotomie mit Mikroschere aus weiten.

Eine anatomische Präparation der Arterie ist ein weiterer Schlüssel. Rund um den arteriellen Adventitia besteht eine dünne Ebene, in der Präparation kann einfach und problemlos durchgeführt werden. Finden Sie die Ebene, dann mit der Dissektion fortzufahren. Versuchen Sie auch, zu sezieren die angrenzenden Vene nur auf die Website von Nahtschlaufen zu Venenschäden, die die Hauptursache von Blutungen bei dieser Vorgehensweise ist zu vermeiden. Auch wenn in der ursprünglichen Methode der Arterie und Vene zusammengeschleift, 4 finden wir, dass Looping Arterie gibt nur eine bessere Kontrolle für beide Blutstillung und Drahteinführung.

Drahteinführung ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Ein 0,015-Zoll-Draht ist etwa dreimal dicker als der DFA, der Zugang Arterie. Die wichtigsten Techniken hiersind: Erweiterung von DFA sich vor Arteriotomie; einen kleinen Eingangsloch, die nach und nach mit microtweezer Tipps erweitert wird; und die Vermeidung von kräftigen Drahteinführung - diese Verfahren sind in dem Protokoll Abschnitt beschrieben. Während im ursprünglichen Verfahren Lidocain aufgebracht, um die Arterie vor Drahteinsetzlöcher 4 aufzuweiten, finden wir es unnötig.

Neointimabildung nach Femoralarterie Draht Schädigung mit der Zeit fort Peaks bei 3-4 Wochen nach der Verletzung, und bleibt nach 8 Wochen stabil. 4,8 Die Autoren der Regel warten 4 Wochen auf der Grundlage unserer vorläufigen Daten, daß die Menge der Neointima nach 3 Wochen ist im allgemeinen kleiner als die Menge an 4 Wochen nach der Draht Schädigung (Daten nicht gezeigt).

Interessanterweise sind die Reaktionen auf Arterienverletzung unterscheiden zwischen verschiedenen Mausstämmen. Nach verschiedenen Berichten untersucht Unterschiede zwischen Mausstämme nach Schenkelhalsschlagader oder Verletzungen, anzuzeigen FVB / N Mäuse die höchste amount der Neointimabildung, gefolgt von 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / c und C57BL / 6. 4,9,10 Diese Eigenschaften sollten bei der Erstellung eines Versuchsplans werden. Die femorale Verletzungsmodell kann auch zur Untersuchung von entzündlichen Veränderungen nach Gefäßverletzung verwendet werden. Entzündliche Zellinfiltration wurde berichtet, drei Tage nach Verletzung deutlich erhöhen. 11

Abschließend wird der Draht Verletzungsmodell unter Verwendung von Maus Femoralarterien besonders geeignet, Restenose nach Angioplastie zu untersuchen, und das Verfahren kann einfach und sicher mit der hier vorgestellten Methode durchgeführt werden. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen sein, wenn die Techniken sind vollständig vertraut gemacht.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fixed Core Wire Guide Cook G02426 Diameter 0.015 inch, Straight
Dilation Forceps Roboz RS-4927 Curved, blunt tips
Dumont Tweesers #5 World Precision Instruments 14095 Straight, sharp tips
Dumont Vessel Cannulation Forceps World Precision Instruments 503373
McPherson-Vannas Scissors World Precision Instruments 501234
Mosquito Forceps World Precision Instruments 501291
Ethilon Nylon Suture 9-0 Ethicon 7717G 9-0, Black Nylon Monofilament
Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point AROSurgical VT4A00N07 11-0, Black Nylon Monofilament
3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler 3M DS-25

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References

  1. Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8, (11), 1249-1256 (2002).
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Ein Mausmodell von arterieller Restenose: Technische Aspekte der Femoral Draht Injury
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Takayama, T., Shi, X., Wang, B., Franco, S., Zhou, Y., DiRenzo, D., Kent, A., Hartig, P., Zent, J., Guo, L. W. A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury. J. Vis. Exp. (97), e52561, doi:10.3791/52561 (2015).More

Takayama, T., Shi, X., Wang, B., Franco, S., Zhou, Y., DiRenzo, D., Kent, A., Hartig, P., Zent, J., Guo, L. W. A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury. J. Vis. Exp. (97), e52561, doi:10.3791/52561 (2015).

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