Summary
La souris fil de l'artère fémorale modèle de lésion de resténose est techniquement difficile. Dans ce protocole, nous détaillons les principaux détails techniques essentiels à l'exécution avec succès des blessures de fil pour induire la néo-intima cohérente pour les études de la resténose.
Abstract
La maladie cardiovasculaire causée par l'athérosclérose est la principale cause de décès dans le monde développé. Rétrécissement de la lumière du vaisseau, en raison du développement de la plaque d'athérome ou la rupture de plaques établies, interrompt le flux sanguin normal menant à diverses morbidités telles que l'infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Dans les procédures endovasculaires cliniques telles que l'angioplastie sont couramment effectuées à rouvrir la lumière. Cependant, ces traitements inévitablement endommager la paroi du récipient ainsi que l'endothélium vasculaire, le déclenchement d'une réponse de cicatrisation excessive et le développement d'une plaque néo-intimale qui se étend dans la lumière provoquant la resténose des vaisseaux (re-rétrécissement). Resténose reste une cause majeure de l'échec des traitements endovasculaires pour l'athérosclérose. Ainsi, les modèles animaux précliniques de resténose sont d'une importance vitale pour l'étude des mécanismes physiopathologiques ainsi que la traduction des approches aux interventions vasculaires. Parmi plusieurs experime murinmodèles NTAL, blessures de fil de l'artère fémorale est largement acceptée comme le plus approprié pour les études de la resténose post-angioplastie parce qu'il ressemble étroitement à la procédure d'angioplastie qui blesse deux endothélium et paroi de la cuve. Cependant, de nombreux chercheurs ont de la difficulté en utilisant ce modèle en raison de son haut degré de difficulté technique. Ce est principalement à cause d'un fil métallique doit être insérée dans l'artère fémorale, ce qui est environ trois fois plus mince que le fil, pour générer une blessure suffisamment importante pour induire la néo-intima. Ici, nous décrivons les détails chirurgicaux essentiels pour surmonter efficacement les difficultés techniques majeures de ce modèle. En suivant les procédures présentées, effectuer la blessure de fil de l'artère fémorale de la souris devient plus facile. Une fois familiarisé, toute la procédure peut être terminée en 20 min.
Protocol
Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les procédures sont conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press, 8e édition, 2011), et les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université du Wisconsin. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie à l'isoflurane (par inhalation, débit 2 ml / min), et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Les animaux ont été euthanasiés dans une chambre progressivement rempli de CO 2.
1. L'induction de l'anesthésie générale et incision de la peau
- Utilisez mâle C57BL / 6 avec un âge de 12 à 16 semaines et le poids de 23-28 g. Anesthésier l'animal par l'isoflurane à travers un appareil d'anesthésie en circuit fermé. Confirmez anesthésie appropriée en pinçant son orteil. Appliquer un peu de larmes pommade artificielle sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
- Placez la souris dans une position couchée avec le membre postérieur gauche légèrement enlevé et l'articulation du genou slightly fléchie. Raser les cheveux autour de la partie supérieure de la cuisse gauche et désinfecter la peau avec de chlorhexidine, appliqué trois fois à l'aide de coton stérile applicateurs à pointe. Utilisez un stérilisateur à billes chaude pour garder les instruments stérilisés pendant la chirurgie.
- Placez un drap de gaze stérile sur la jambe gauche. Faire une incision de la peau longitudinale 1,5 cm droite sur la cuisse gauche médial de l'articulation du genou à l'aine (figure 1A).
2. L'exposition de l'artère fémorale et Branches
REMARQUE: la figure 1B montre l'anatomie du système vasculaire brute dans le haut de la cuisse. L'artère fémorale superficielle (AFS) peut être observée à travers un microscope à dissection lorsque l'incision de la peau est correctement établie le long de la ligne médiane de la cuisse médiale.
- Ouvrez l'aponévrose mince recouvrant la SFA avec des pincettes fines et ensuite en boucle avec la SFA 9-0 suture en nylon.
NOTE: Dans ce processus, le nerf fémoral est facilement mis enide, mais la veine fémorale adjacente nécessite une attention particulière parce que son mur est si mince qu'il perfore facilement et saigne. La technique est essentiel de se concentrer sur l'artère elle-même; tant que la dissection est réalisée tout près de l'artère, la veine tout dommage accidentel est évitable. - Une fois la SFA est bouclée, maintenez la suture avec une pince de moustiques et tirez-le légèrement vers le bas. Cette manœuvre permet en outre la dissection plus facile, mais pour éviter d'endommager l'artère ne tirez pas trop fort.
- Continuer dissection de l'artère proximale pour exposer et boucle l'artère fémorale commune (CFA) avec 9-0 suture en nylon.
NOTE: Habituellement, bouclage de la CFA à un point en aval de l'artère épigastrique (figure 1B) est assez pour l'insertion de fil. Maintenez la boucle de suture CFA avec une pince de moustiques de la même façon. - Tirez la boucle de suture CFA vers le haut et la boucle de suture SFA vers le bas pour découvrir la bifurcation de SFA et l'artère fémorale profonde (DFAE). Le DFAE, la branche principale de la CFA,va vers le muscle de la cuisse (figure 1B).
NOTE: Le fil sera inséré de la DFA tard. - Boucle de la DFA avec prudence parce que la veine adjacente est emmêlé sous l'artère. En cas de saignement de la veine, un 30 à 60 sec compression simple avec de la gaze est généralement suffisante pour produire l'hémostase.
- Une fois que le DFAE est bouclée avec 9-0 suture en nylon, assurez-vous tous les trois boucles de suture sont à leurs positions correctes (figure 2A).
- Procéder à la dissection de la DFA distale pour ligaturer l'artère en un point aussi loin que possible de la bifurcation. Couper suture supplémentaire, mais laisser une certaine longueur de sorte que les deux extrémités peuvent être tenus avec des pinces de moustiques, qui stabilisent le DFAE que l'insertion de fil plus facile.
3. Création fil blessures
- Insérez fil via DFA
- Égoutter les sutures CFA, SFA et DFA d'établir un hémostatique temporaire.
- Faire un petit trou dans le DFA avec microciseaux. Insérez les conseils des courbes micropince pour dilater le trou assez grand pour un fil d'un diamètre de 0,015 pouces (figure 2B montre la différence de taille entre l'artère et le fil).
- Avant de faire un trou dans le DFA, desserrer la boucle de suture CFA et doucement serrer / presser le DFAE plusieurs fois avec micropince ternes pointe. Cette manœuvre élargit le diamètre artériel remarquable pour faciliter l'insertion de fil. Humidifiant à fond le fil avec du PBS est également important pour une insertion en douceur.
- Lorsque vous faites un trou dans le DFAE, ne pas recadrer la paroi artérielle, mais faire un petit pincement en forme de V et pincer le rabat avec micropince bout pointu pour la manipulation.
- Insérez le fil dans le trou suffisamment dilaté sur la DFA. Avancer doucement le fil vers l'artère iliaque tout en desserrant la boucle de suture autour de la CFA. 5-8 mm est suffisant pour couvrir toute la longueur CFA dans la plupart des cas (figure 2C
- Laisser le fil à l'intérieur pour une Min
- Après avoir inséré le fil à la longueur optimale, laisser pendant 1 min de surexploiter la paroi artérielle. Humidifiez le fil et les artères avec du PBS pour éviter le dessèchement. Un autre suture 9-0 en nylon peut être placé autour de la DFA proximale au point d'insertion de fil pendant ce temps d'attente. Cette suture sera utilisé plus tard pour fermer le trou sur le DFAE après le retrait du fil.
- Récupérer fil et reprendre le flux sanguin
- Maintenez le fil avec une pince navire de cathétérisme, et tirez doucement le dos; le fil doit être récupéré en douceur. Pour surmonter toute résistance, généralement causée par l'adhésion du fil à la paroi artérielle, tirant le fil avec une légère rotation est utile. Encore une fois, une manœuvre de force pourrait entraîner la perte de l'animal.
- Unprès avoir récupérer le fil, ligaturer les DFA au point de bifurcation avec une suture 9-0 en nylon. Ne pas ligaturer trop près de la bifurcation, ce qui mettrait en péril l'écoulement du sang à la SFA.
- Desserrez les boucles de suture SFA et CFA de reprendre le flux sanguin normal. Notez que le CFA est bien élargi par insertion de fil (figure 2D).
4. peau fermeture et Soins postopératoires
- Contrôle saigne. Suintement mineur peut être arrêté par compression simple; certains saignements majeurs artérielles nécessiteront points avec une suture de nylon 11-0. Ces artères suturées finiront par entraîner une occlusion artérielle.
- Fermez la peau enroulée avec agrafeuses cutanées (habituellement 3-4 agrafes). Gardez la surface de la plaie stérilisé par application de la solution de chlorhexidine chirurgicale.
- Appliquer les traitements post-opératoires. Contrôler la douleur de la souris avec des injections sous-cutanées de la buprénorphine. Garder la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'il ait retrouvé sufFicient conscience de maintenir décubitus sternal. Maison dans une cage propre, sans compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
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Representative Results
Quatre semaines après la chirurgie, récoltent l'artère fémorale fil blessés et font un spécimen de blocs de paraffine pour analyser la formation de néo-intima. Induire une anesthésie générale comme décrit ci-dessus. Ouvrir la poitrine immédiatement et insérer une aiguille de papillon de calibre 20 au ventricule gauche. Connectez la ligne à une bouteille de perfusion. Effectuer perfusion fixation par perfusion goutte à goutte de PBS suivi par 4% de paraformaldéhyde (généralement de 10 à 20 ml chacune). La bouteille de perfusion est placé environ 140 cm plus haut que le niveau du cœur afin que l'animal est perfusé à pressure.Wait physiologique pendant 20 min puis sortez la CFA de fil blessés et le fixer dans 4% de paraformaldehyde nuit à 4 ° C. Faire un bloc de paraffine de l'échantillon en utilisant des techniques histologiques standard et préparer des coupes transversales d'une épaisseur de 5 um pour la coloration histologique.
Hématoxyline-éosine permettra une visualisation claire de la formation de néo-intima l'intérieur du fil blessé fartère emoral (figure 3A, fil blessés artère fémorale; 3B, artère fémorale indemne) .Utilisez un logiciel propre à mesurer la surface de la lumière (LA), la zone de limitante élastique interne (IEL), et la zone extérieure de lame élastique (EEL) de section transversale (figure 3C). Calculer l'aire de intima en soustrayant zone de lumière de la zone IEL; calculer la surface des médias en soustrayant la zone IEL de la zone de l'anguille. Intima rapport surface / surface des médias est utilisé pour comparer les formations de néo-intima entre différents groupes expérimentaux.
Figure 1: des représentations schématiques de l'incision de la peau et le système vasculaire Anatomy. (A) Une incision de la peau appropriée est d'environ 1,5 cm de longueur, le long de la ligne médiane de la cuisse médiale. (B) Trouvez l'artère fémorale superficielle abord, l'artère fémorale commune suivante, et enfin, leartère fémorale profonde. Disséquer soigneusement chaque artère sans endommager la veine adjacente.
Figure 2: Procédure blessures Wire. (A) L'artère commune fémorale (flèche), l'artère fémorale superficielle (flèche en pointillés), et l'artère fémorale (tête de flèche) de profondeur sont exposés et en boucle avec des sutures. (B) Notez la différence de taille entre les artères et 0,015 pouce fil. (C) Le fil est inséré par l'artère fémorale profonde. Placez le fil à l'intérieur pour une min pour avoir la paroi artérielle débordés. (D) Le flux sanguin est reprise. L'artère fémorale commune est bien élargi après la blessure de fil (flèche). Bar indique une mm.
Figure3: hématoxyline-éosine des artères fémorales fils blessé et indemnes. (A) Une coupe transversale d'une artère fémorale fil blessé révèle une plaque de néo-intima d'épaisseur, très cellulaire. (B) Une coupe transversale d'une artère fémorale indemne démontre intactes les structures de la paroi artérielle, sans aucune formation de néo-intima. (C) Le vert ligne délimite la zone de lumière, la ligne jaune délimite limitante élastique interne et la ligne bleue délimite limitante élastique externe. Bar indique 100 um.
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Discussion
La procédure de blessures de fil est applicable à toutes les souches de souris aussi longtemps que leurs structures anatomiques sont similaires. 4 Dans cet article, nous avons utilisé mâle C57BL / 6 avec un âge de 12 à 16 semaines. Comme nous l'avons appris de nos études préliminaires, les artères fémorales de souris âgés de moins de 10 semaines sont souvent si petite que l'insertion de fil est assez difficile. D'autre part, l'insertion du fil dans des souris âgées de 16 semaines est techniquement plus facile, mais a tendance à se traduire par de plus hyperplasie néo-intimale variable. Des souris femelles ont tendance à engager moins de formation de néo-intima que les mâles. Bien que la procédure de blessure du fil peut être effectué sur chaque côté des artères fémorales, on préfère le côté gauche en raison de l'accessibilité anatomique pour les opérateurs droitiers.
Parmi tous les modèles murins de la resténose post-angioplastie, une blessure de fil artérielle imite souvent étroitement angioplastie par la dénudation endothéliale et paroi de la cuve overstreching. Il 2,5,6sont deux artères principales cibles pour blessures de fil: artères fémorales et les artères carotides. D'un point de vue technique, l'insertion de fil est plus facile pour les artères carotides, car ils sont plus larges que les artères fémorales. Cependant, la formation de néo-intima a tendance à être moins robuste dans les artères carotides que celle dans les artères fémorales, probablement en raison de la dénudation moins efficace. Certains auteurs utilisent un dispositif main pour créer une dénudation endothéliale plus agressif dans les artères carotides. 7 D'autre part, l'avantage du modèle fémorale de blessures de fil de l'artère, ce est qu'il peut être effectué avec de façon homogène manufacturés, fils disponibles dans le commerce provoquer l'hyperplasie néo-intimale dans de manière reproductible.
Pour une blessure de fil succès dans les artères fémorales de souris, la clé est de fonctionner sous un microscope à dissection avec un grossissement suffisant et d'utiliser des instruments fines - micropince et microciseaux en particulier. Micropince avec bouts pointus sont utiles pour dissectiont les tissus environnants l'artère tandis que celles avec bouts arrondis sont utiles pour placer une boucle de suture autour de l'artère et de dilater le trou d'entrée de fil faite par une artériotomie forte avec microciseaux.
Une dissection de l'artère est une autre clé. Autour de l'adventice artériel il existe un plan mince où la dissection peut être effectuée facilement et en douceur. Trouver le premier plan, puis procéder à la dissection. Aussi, essayez de disséquer la veine adjacente uniquement sur le site de suture boucles pour éviter des dommages aux veines, qui est la principale cause de saignement dans cette procédure. Bien que dans la méthode originale de l'artère et la veine sont bouclées ensemble, nous constatons que quatre artère boucle ne donne un meilleur contrôle à la fois pour l'hémostase et l'insertion de fil.
insertion de fil est la partie la plus difficile de cette procédure. Un fil 0,015 pouces est environ trois fois plus épais que le DFAE, l'artère d'accès. Les techniques clés icisont: dilater le DFAE lui-même avant artériotomie; faire un trou d'entrée petite qui est progressivement dilaté avec des conseils de microtweezer; et d'éviter l'insertion de fil de force - ces techniques sont détaillées dans la section de protocole. Alors que dans la méthode originale lidocaïne est appliquée pour dilater l'artère avant l'insertion de fil 4, nous ne jugeons pas nécessaire.
La formation néo-intima après une blessure de fil de l'artère fémorale progresse avec le temps, des pics à 3-4 semaines après une blessure, et reste stable à 8 semaines. 4,8 Les auteurs attendent habituellement pendant 4 semaines sur la base de nos données préliminaires que le montant de la néo-intima à 3 semaines est généralement inférieure à la quantité à 4 semaines après la lésion de fil (données non présentées).
Fait intéressant, les réponses à une lésion artérielle diffèrent entre les différentes souches de souris. Selon plusieurs rapports d'enquête différences entre les souches de souris après fémorale ou de blessure de l'artère carotide, souris FVB / N présentent la plus forte amount de la formation de néo-intima, suivie par 129 / SvJ, C3H / HeJ, BALB / C, et C57BL / 6, respectivement. 4,9,10 Ces caractéristiques devraient être considérés lors de la composition d'un plan expérimental. Le modèle de lésion fémorale peut également être utilisé pour l'étude des changements inflammatoires après une lésion vasculaire. Infiltration de cellules inflammatoires a été signalé à augmenter de façon significative, trois jours après blessure 11.
En conclusion, le modèle de lésion de fil en utilisant artères fémorales de souris est particulièrement adapté pour étudier la resténose post-angioplastie, et le processus peut être effectuée en toute sécurité et facilement en utilisant la méthode présentée ici. L'ensemble de la procédure peut être terminé dans les 20 minutes une fois que les techniques soient pleinement familiarisés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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