Abstract
Потому что варианты белков играют важную роль во многих заболеваний, включая TDP-43 в боковой амиотрофический склероз (БАС), альфа-синуклеина в болезнь Паркинсона и бета-амилоида и тау при болезни Альцгеймера, крайне важно развивать морфологии специфических реагентов, которые могут выборочно воздействовать на это болезнь-специфический белок вариантов для изучения роли этих вариантов в патологии болезни и для потенциальных диагностических и терапевтических применений. Мы разработали новые атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы Биопэннинг основе, которые позволяют изолировать реагентов, которые избирательно распознают конкретных заболеваний варианты белка. Есть два основных этапов, участвующие в процессе, отрицательных и положительных фаз панорамирования. Во время отрицательной фазы панорамирования, фаги, которые реагируют на офф-целевых антигенов выводится через несколько раундов субтрактивного панорамирования с использованием ряда тщательно отобранных мимо цели антигенов. Ключевой особенностью в отрицательнойпанорамирование фаза использования АСМ для наблюдения за процессом и убедиться, что все нежелательные частицы фага удаляются. Для положительной фазы панорамирования, антиген-мишень представляет интерес фиксируется на поверхности слюды и связанные фаги элюируют и скринингу для выявления фагов, которые селективно связываются с антигеном-мишенью. Вариант целевой белок не должны быть очищены обеспечивая соответствующие отрицательные контроли панорамирования были использованы. Даже целевой варианты белка, которые присутствуют только в очень низких концентрациях в комплексном биологического материала могут быть использованы в положительном этапе дражирования. Путем применения этой технологии, мы приобрели антитела к вариантам белковых TDP-43, которые избирательно, найденных в человеческой ALS ткани головного мозга. Мы полагаем, что этот протокол должен быть применим к генерации реагентов, которые селективно связываются варианты белка, присутствующего в широком разнообразии различных биологических процессов и заболеваний.
Introduction
Наличие вариантов белков были причастны как фактор прогрессирования многих заболеваний, включая нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, ALS и лобно деменции (УТД) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Олигомерных форм белков бета-амилоида и альфа-синуклеина, как считается, токсичных видов, ответственные за болезнь Альцгеймера и Паркинсона, соответственно 2,3,4,5. Агрегаты гудрона ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) были связаны с БАС и УТД 12,13,14. Поэтому реагентов, таких как антитела, которые могут выборочно воздействовать на различные варианты белка могут стать мощными инструментами, чтобы служить в качестве диагностических маркеров и потенциальных терапии. В этом исследовании мы сосредоточились на разработке реагентов, которые избирательно связываются варианты TDP-43 белка, причастных к ALS, однако методика рассмотрены в этой статье, должны применяться к изоляции реагентов против широкого спектра протВарианты Эйн.
Цитоплазма агрегация TDP-43 был определен как патологический функции в БАС 15,16,17,18,19. Обычно TDP-43 находится в ядре всех клеток нормального человека, хотя это, как правило, для перемещения между цитозоле и ядре 15,17. Тем не менее, в АЛС агрегированных форм TDP-43 обнаружены в цитоплазме некоторых нейронов и глии с более низких концентрациях, найденных в ядре предполагая движение TDP-43 из ядра в цитоплазму при прогрессирования заболевания 16,20. В то время как агрегация TDP-43 находится в большинстве случаев БАС, она не учитывает всех случаях, так как 1% -2% от общего числа случаев БАС (или 15% -20% семейных случаев БАС), связаны с мутациями в супероксиддисмутаза 1 (SOD1) гена 15,17. Из-за важной роли TDP-43 в подавляющем большинстве случаев БАС, здесь мы сосредоточены на разработке реагентов антител на основе, которая может выборочно связываются с TDP-43 вариантов, которыеприсутствует в человеческой ALS мозговой ткани, используя наши методы, основанные Биопэннинг роман АСМ.
Первоначально мы должны разнообразный репертуар антител связывающих доменов. Мы объединили три разные фагов из одной цепи вариабельного домена фрагмента антитела (scFvs) библиотеками (Томлинсон I и J и листов библиотеки 21). Способ панорамирования делится на отрицательных и положительных фаз панорамирования. Фагов из библиотеки сначала подвергаются отрицательному процесса панорамирования, в течение которого фагов реагирует на несколько офф-антигенов-мишеней исключаются. После завершения каждого раунда отрицательного панорамирования против каждого офф-антиген-мишень, процесс контролируется АСМ обеспечить, чтобы все фага связывания с-антигенов-мишеней были удалены. Только после проверки с помощью АСМ изображений, что все реактивные фаги удаляют мы переходим к следующей цели. Для выделения реагенты против TDP-43 вариантов, вовлеченных в БАС мы использовали следующие негативные панорамирования антигены: 1) БСА, чтобы удалить фага, которые связывают слабо или неспецифически с белками; 2) агрегированной альфа-синуклеина, чтобы удалить фаги, которые связываются с общих структурных элементов агрегированных белков; 3) гомогенаты головного мозга человека, чтобы удалить фаги, которые связываются с какими-либо белками или других компонентов, присутствующих в образцах посмертных здорового человеческого мозга ткани; 4) иммунопреципитировали TDP-43 от здорового человека мозг, чтобы удалить фаги, которые связывают всех TDP-43 форм, связанных со здоровым человеческим мозгом; и 5) иммунопреципитировали TDP-43 изолирован от УТД гомогенатах мозга, чтобы удалить фаги, которые связывают TDP-43 варианты, связанные с непредоставлением ALS патологии. После удаления всех фага реактивной всем вне антигенов-мишеней, то затем перешел к положительной фазы панорамирования, в течение которого фрагменты антител, которые связываются с антигеном интерес изолированы, в данном случае TDP-43 иммунопреципитации из человеческой мозговой ткани ALS. Эти изолированные антитела могут быть реактивной агрегированным или модифицированных форм TDP-43.
"> Обычные фага биопэннинга ориентирован в основном на положительной фазе панорамирования 22,23. Обычно целевой интерес иммобилизован, добавляют фаговой библиотеки и связанные фаги элюируют. Фаги затем усиливаются и вновь добавляют к цели. Этот процесс амплификации и инкубации обычно повторяется несколько раз, чтобы увеличить процент положительного связывания фага. В то время как варианты этого процесса широко используются, чтобы изолировать реагентов антител против широкого спектра антигенов-мишеней, они как правило, требует больших количеств очищенного антигена-мишени 24,25,26, 27, в то время как наш способ требует только следовые количества антигена-мишени. протокол, описанный здесь, может быть использован для изоляции реагентов, которые селективно связываются целевые антигены, которые присутствуют в очень низких концентрациях, без необходимости очистки и панорамирование могут быть выполнены непосредственно против антиген присутствует в сложных образцов тканей. Использование исчерпывающих негативных протоколов панорамирования, как проверитьАСМ гарантирует, что клоны, выделенные по отношению к положительному антигену должны селективно связываются цель даже тогда, когда не очищенным или обогащенным.Kasturirangan и коллеги (2003) провели аналогичный негативный и позитивный процесс биопэннинга, чтобы изолировать антитела, реагирующие на олигомерным бета-амилоида, используя концентрацию нанограммовые мишени 5. Здесь мы расширяем этот процесс для того, чтобы поколение реагентов, которые избирательно связывают заболевания специфический белок вариантов непосредственно из образцов тканей человека. В будущих исследованиях мы намерены и дальше исследовать не только диагностическое значение реагентов изолированных здесь, но также оценить их терапевтическую значимость для лечения БАС.
В целом, наши новые технологии АСМ биопэннинга основе должен быть применим к выделению любой конкретной болезни вариант белка в любом биологическом материале без необходимости очистки белков или модификации, даже когда антиген-мишень concentratioнс являются крайне низкими.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. фага Производство
- Выполните все производственные фага и Биопэннинг процессы в шкафу биобезопасности. Продукция фагов частиц из разных библиотек (Томлинсон библиотекам, я и J и Нотная библиотека 21) для процесса биопэннинга, следуя инструкциям производителя (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем множество библиотек в нашем процессе панорамирования для увеличения разнообразия антител доступны. - Вкратце, культура бактерий запасы трех библиотек в 200 мл 2xYT, содержащей 1% глюкозы и 100 мкг / мл ампициллина на шейкере при 37 & deg; С до OD 600 0,4.
- Добавить 8 х 10 11 из KM13 помощника фага к 200 мл библиотек Томлинсон I и J и 8 х 10 11 VCSM13 помощника фага до 200 мл библиотеки листов. Инкубируйте образцы библиотеки с вспомогательный фаг в течение 30 мин при 37 ° С без встряхивания.
- ЦентрифугаКультуры в 3000 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют осадок клеток в 200 мл 2xYT 0,1% глюкозы, 100 мкг / мл ампициллина и 50 мкг / мл канамицина.
- Инкубируйте культур O / N при 30 ° С при встряхивании, а затем вращаться в течение 30 мин при 3300 мкг на следующий день.
- Добавить 50 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ) 8000 в 2,5 М NaCl в 200 мл супернатанта из каждой из библиотек и инкубировать на льду в течение 1 часа. После ПЭГ осадков, спина решения снова в течение 30 мин при 3300 х г.
- Добавить 1-2 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) к осадку клеток (в зависимости от размера гранул) и передачи в микроцентрифужных пробирках.
- Инкубируйте фаговых частиц на льду в течение 1 ч при 37 ° С с периодическим перемешиванием перед центрифугированием в течение 10 мин при 11600 х г. Собирают супернатант и хранить при -80 ° С.
- Перед замораживанием, передачи небольшого объема фаговых частиц из трех библиотек на другой трубки микроцентрифужных и титровать каждую библиотекуиндивидуально с помощью TG1 клетки для определения концентрации. Ниже приводится описание процесса титра в течение одного библиотеки.
- Растут TG1 клетки OD 600 0,4. Добавить 990 мкл PBS до 6 микроцентрифужных пробирках.
- К первой трубы добавить 10 мкл фаговых частиц. После смешивания, удалить 10 мкл из пробирки и добавить к трубке 2. Повторите этот шаг для остальных 4 трубок.
- Добавить 200 мкл клеток TG1 6 трубок и добавить 10 мкл каждого из шести разведений фага в этих трубах. Разрешить фаговых частиц заражает в течение 30 мин при нет встряхивании при 37 ° С.
- Пластина 100 мкл клеток ко Лурии-Бертани чашках с агаром с 100 мкг / мл ампициллина (LBA). Инкубируйте O / N при 37 ° С, а затем определить БОЕ / мл с использованием количество видимых колоний.
2. негативный процесс Биопэннинг
Примечание: Не слишком много замораживания-размораживания фагов на протяжении всего процесса биопэннинга. Ideally, лучше проводить так много негативных шагов панорамирования, как это возможно в день. После завершения циклов отрицательного или положительного панорамирование с каждой целевой важно, чтобы сохранить некоторые из фага в случае загрязнения на любом этапе.
- 12 раундов негативных панорамирование против бычьего сывороточного альбумина (БСА)
- Добавить 4 мл 1 мг / мл раствора БСА в PBS с 12 immunotubes и инкубировать O / N при 4 ° С.
- Зерноуборочный 1 х 10 12 фаговых частиц от каждого из трех библиотек (выделено небольшое количество этой смеси фага для будущего проверки отрицательного процесса панорамирования).
- Отменить решение BSA от первой трубы и мыть трубку 2-3 раза PBS для удаления несвязанного BSA.
- Добавить объединенные фаговых библиотек с этой первой трубы, инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре на ротатор и собирать несвязанные фаги.
- Повторите шаг 2.1.3 со второй immunotube и добавить фага, собранную с шага 2.1.4 На это яmmunotube. Повторите шаг 2.1.4.
- Повторите шаги 2.1.3-2.1.4 с остальными 10 трубок решения BSA и несвязанного фага, собранной после каждого инкубации.
- Чтобы проверить удаление всех BSA фага связующих использовать АСМ. Добавить 10 мкл фага с шага 2.1.2 и 10 мкл оставшейся фага после этапа 2.1.7 отдельно 10 мкг / мл BSA, связанные с слюды. Краткое версия процессе АСМ описано в разделе 8.
- Важно, чтобы сохранить небольшое количество фага после окончания многочисленные раундов отрицательного панорамирование от каждой цели, чтобы проверить успех процесса панорамирования.
- 10 раундов негативных панорамирование с различными формами альфа-синуклеина
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом проекте, мы хотим, чтобы удалить фаги, которые могут связывать другие агрегированных форм белков, таких как альфа-синуклеина (мономера, димера, тримера и т.д.) и поэтому мы будем ликвидировать любой из этих фагов (цель является устранить многие кросс-реактивные фаги, насколько возможно), Разрешить очищенный альфа-синуклеина агрегировать в течение по крайней мере 7 дней, так что оба мономерные и олигомерные формы присутствуют для отрицательного панорамирования.- Подготовка 4 immunotubes с 500 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина в PBS и 4 immunotubes с 100 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина и инкубировать O / N при 4 ° С.
- Отменить решение от одной из трубок с 500 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина, промывают PBS и добавляют фаговой библиотеки, собранные после 12 циклов отрицательной панорамирование с BSA.
- Инкубируйте пробирку в течение 30 мин при комнатной температуре на ротатор и собирать несвязанные фаги.
- Повторите этапы 2.2.3 и 2.2.4 для остальных труб с 500 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина, а затем трубки с 100 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина с использованием несвязанного фага собранной после каждого шага 2.2.4.
- Повторите шаг 2.1.8 с помощью фага после первого отрицательного панорамирование от 500 мкг / мл агрегированного альфа-synuclein и фаг после восьмого раунда отрицательного панорамирования с 100 мкг / мл альфа-синуклеина.
- Для устранения всех негативных связующие против альфа-синуклеина подготовить два дополнительных immunotubes с 500 мкг / мл агрегированного альфа-синуклеина и повторите шаги 2.2.2-2.2.4.
- 10 раундов негативных панорамирование против Здоровый головного мозга человека гомогенате
- Добавить 1x STEN буфер (50 мМ Трис (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0,2% NP-40, 0,2% БСА, 20 мМ ФМСФ и ингибитор протеазы коктейль) в человеческой мозговой ткани 28. Перемешать при 24000 оборотах в минуту в течение 1 мин, образцы центрифуг на 3000 оборотах в минуту и собирать надосадочную жидкость.
- Подготовка 2 immunotubes с 2 мл 50 мкг / мл человеческого мозговой ткани в PBS и 8 immunotubes с 10 мкг / мл человеческого мозговой ткани и инкубируют O / N при 4 ° С.
- Повторите шаги 2.2.3-2.2.5 с первой пробирки, содержащие 50 мкг / мл человеческого мозговой ткани, а затем те, которые содержат 10 мкг / мл человеческого бдождь тканей с помощью несвязанного фага, собранных после отрицательного панорамирования против альфа-синуклеина.
- Повторите шаг 2.1.8 с помощью фага после первого отрицательного панорамирование от 50 мкг / мл человеческого мозговой ткани и фага после десятого раунда отрицательного панорамирования против человеческого мозговой ткани.
- 8 раундов негативных панорамирование против Здоровый Иммунопреципитированные TDP-43
- Иммунопреципитат здоровый TDP-43 белка из здоровой человеческой мозговой ткани, используя протокол, описанный в разделе 9. Из-за снижения количества Иммунопреципитированные белка, проводить эти раунды отрицательного панорамирования, с помощью слюды.
- Клив восемь поверхностями слюды.
- К первому слюды добавить ~ 100 мкл 5 мкг / мл в иммунопреципитации белка и инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
- Вымойте слюды 5 раз с 0,1% PBS с Tween 20 (PBST).
- Добавить ~ 100 мкл фага после отрицательного панорамирование с здоровую ткань мозга и инкубировать в течение 5-10 мин приRT.
- В полпути инкубации шаг 2.4.5, выполните шаг 2.4.3 с помощью второго слюду.
- Сбор фага, начиная с шага 2.4.5 и мыть слюды 5 раз с 0,1% PBST.
- Вымойте слюду, начиная с шага 2.4.6 и добавьте фага из 2.4.7.
- Повторите шаги 2.4.4 2.4.9 до фага не отрицательно приготовлена против всех восьми слюды с иммунопреципитации белка. Повторите шаг 2.1.7 с помощью фага после первого и восемь круглых отрицательного панорамирования.
- 2 Выстрелов негативных панорамирование против УТД Иммунопреципитированные TDP-43
- Иммунопреципитат TDP-43 белок из головного мозга пациентов с УТД.
- Клив 2 поверхностями слюды.
- Добавить 50 мкл 10 мкг / мл FTD TDP-43, чтобы один слюды. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Вымойте слюды 5 раз с 0,1% PBST.
- Добавить 50 мкл фага, собранной после отрицательного панорамирования против здорового TDP-43. Инкубируют в течение 5 мин.
- Сбор несвязанных фагов.
- REPEATS шаги 2.5.3 на 2.5.6 со второй слюды и несвязанного фага, собранных в 2.5.6.
3. Положительный Панорама против Иммунопреципитированные TDP-43 от физических лиц с БАС
- Иммунопреципитат TDP-43 белок из головного мозга пациентов с БАС. Клив 3 поверхностями слюды. Добавить 50 мкл 10 мкг / мл ALS TDP-43, чтобы один слюды. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте слюды 5 раз с 0,1% PBST.
- Добавить 50 мкл фага, собранной после отрицательного панорамирования против здорового TDP-43 в слюды. Инкубируют в течение 5 мин.
- Сбор несвязанных фагов. Собирайте связанные фаги, используя три метода элюирования. Важно, чтобы все собранные фагов в этих панорамных шагов отдельных.
- Во-первых, добавить 50 мкл трипсина (1 мг / мл в PBS) в каждую слюды и инкубировать в течение не более 10 мин. Соберите решение и сохранить. Затем добавьте 50 мкл 100 мМ триэтиламина (TEA) к каждому слюды и инкубировать в течение не более 10 мин. Компанияllect раствора, добавить равный объем 1 М Трис-HCl буфере, рН 7,4, и сохранить.
- В-третьих, добавление 50 мкл в TG1 ОД 600 из 0,4 непосредственно на слюду и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С. Кроме того, добавить фагов, собранные из двух способов элюирования в 3.3.1 до 100 мкл TG1 на OD 600 0,4 и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
- Повторите шаги 3,1 со вторым слюды.
- Возьмите несвязанного фага, собранной в 3.3.2. используя первый слюду с БАС TDP-43 и добавить его на второй слюды с БАС TDP-43. Инкубируют в течение 5 мин.
- Повторите все шаги в 3,3 для этих второго наборов слюды.
- Объедините ячейки TG1 инфицированных фагами, элюированных трипсином из двух ALS TDP-43 слюды и плиты на LBA пластин. Повторите тот же процесс для чая и TG1 элюировали фагов из двух ALS TDP-43 слюды в общей сложности тремя пластинами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за участия TDP-43 в обоих БАС и УТД, некоторые из клонов, выделенных вдва раунда положительного панорамирования против ALS TDP-43 могут быть специфическими для этой цели, но некоторые из них могут также связывать УТД. Чтобы лучше изолировать ALS-специфических клонов, взять несвязанного фага, собранную после 2 туров отрицательной панорамирования против УТД TDP-43 (так как эти два раунда отрицательной панорамирования следовало извлечь любую цель, которая реагирует на УТД TDP-43) и использовать эти фаги в еще один виток положительной панорамирования против ALS TDP-43 антигена на слюде (подготовить ALS TDP-43 слюду, как описано выше, в 3,3 и 3,4). - Повторите все шаги, описанные в 3,3 с этим третьим ALS слюды и пластины зараженные клетки TG1 на три LBA пластин O / N при 37 ° С. На следующий день подсчитать количество колоний на пластинах 6 LBA с потенциальными клонов АЛС. Там должно быть меньше колонии на три LBA пластин с потенциальными клонов БАС после третьего раунда положительного панорамирования сравнению с тремя LBA пластин после двух раундов положительной панорамирования.
4. Культивирование и фага товаровионная потенциальных положительных клонов против ALS Удельный TDP-43
- Выращивают каждой колонии от 6 пластин в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл 2xYT с 1% глюкозы и 100 мкг / мл ампициллина на шейкере при 37 ° CO / N.
- На следующий день перевод 10 мкл из лунок, содержащих клонов из LBA пластин 3 после третьего тура положительного панорамирования с ALS TDP-43 белка к микропробирок, содержащих 1 мл 2xYT с 1% глюкозы и 100 мкг / мл ампициллина ,
- Добавить глицерин, чтобы всех культур в 96-луночных планшетах в конечной концентрации 15% и заморозить пластины при -80 ° С. Разрешить культуры 1 мл расти в течение 2-3 ч встряхивания при 37 ° С.
- Добавить 10 9 KM13 вспомогательный фаг и позволяют вспомогательный фаг заразить в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании. Центрифуга клетки течение 10 мин при 3000 х г, отбросить супернатант и добавить 1 мл 2xYT 0,1% глюкозы, 100 мкг / мл ампициллина и 50 мкг / мл Канамеycin.
- Культуры клеток O / N на 30 ° C при встряхивании. Центрифуга трубки на 3300 мкг в течение 30 мин, супернатант передачи новых микроцентрифужных пробирках и добавить 250 мкл ПЭГ / NaCl в каждую пробирку.
- Инкубировать пробирки во льду в течение 1 часа. Центрифуга трубки снова в 3300 х г в течение 30 мин, отбросить супернатант и добавить 100 мкл PBS в каждую пробирку.
- Инкубировать пробирки во льду в течение 1 часа. Спин трубки в течение 10 мин при 11600 х г и передачи супернатант в новые пробирки. Храните фагов при -80 ° С.
5. Последовательность потенциальных БАС клонов
- Повторите шаг 4,2 и позволяют культур расти O / N при 37 ° C при встряхивании. На следующий день провести ДНК плазмиды подготавливает клонов в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательность клонов с использованием соответствующих прямого и обратного праймеров.
6. отбора потенциальных положительных клонов против ALS удельным TDP-43 с использованием косвенных ELISA
- Добавить 100 мкл 2,5 мкг / мл АЛС, FTD и здоровой ткани головного мозга человека в лунки с высокой связывания ELISA пластины для каждого потенциального ALS клона. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 1 ч при медленном встряхивании.
- Промыть пластины 3 раза с 0,1% PBST. Добавить 200 мкл 2% сухого молока в PBS в лунку и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 1 ч при медленном встряхивании.
- Повторите шаг мыть, а затем добавить 100 мкл каждого фага, разбавленного по крайней мере 1/100 в PBS в лунки. После инкубации и промыть шаги, добавить 100 мкл 1/1000 анти-М13 HRP в каждую лунку. Вымойте тарелки и визуализировать с помощью ELISA набор фемтосоты ХЛ субстрата.
7. ScFv Производство и скрининга с использованием косвенного ELISA
- Растут HB 2151 клеток на OD 600 0,4. Добавить 5 мкл различных фагов 20 мкл HB 2151 клеток. Разрешить фаги 30 мин до заражения при 37 ° С без встряхивания. Разделите LBA тарелки в сетях, такчто примерно 20 клонов можно высевали на каждого.
- Добавить 5-10 мкл каждого фага инфицированных бактерий к пластине и инкубировать O / N при 37 ° С. На следующий день добавить отдельные колонии к 1 мл 2xYT с 0,1% глюкозы и 100 мкг / мл ампициллина и встряхивают при 37 ° С в течение 3-4 ч до тех пор, пока OD 600 0,6.
- Добавить 1 мкл 1 М изопропилтиогалактозидом (IPTG) в каждую пробирку и инкубируют O / N при 30 ° C при встряхивании. Спин трубы на 11600 мкг в течение 10 мин и собирают супернатант для тестирования ELISA.
- Для ИФА те же процедуры в разделе 6, за исключением, а фага в 6,5 добавить ScFv в неразбавленном виде и 6,6 добавить 100 мкл 1/1000 9E10 HRP.
8. АСМ Процесс
- Добавить 10-20 мкл антигена-мишени, чтобы слюды и инкубировать в течение 5-10 мин. Вымойте слюды 5 раз водой. Добавить 10-20 мкл фагов к поверхности слюды и инкубировать в течение 5-10 мин.
- Вымойте слюду 5 раз опять Wiй водой и дать слюды высохнуть на воздухе. Визуализация фага связывания с помощью АСМ 1. Выполнить процесс АСМ, используя режим кратковременного нажатия АСМ с контроллером Nanoscope IIIa в воздухе при комнатной температуре 29. В кремния АСМ зонды имеют резонансную частоту 300 кГц и жесткости пружины 40 Н / м. Используйте скорость сканирования 3,05 Гц и разрешение сканирования 512 образцов / линии.
- Обработки изображений от основного выравнивания фона, чтобы обеспечить, что все размеры частиц сравнимы в пределах каждого изображения. Ширина фага (не длина) может варьироваться от снимка к снимку из-за других размеров частиц и области сканирования, но это не пойдет на компромисс точность или нет фага связывается с антигеном.
- Если во время АСМ проверки для каждого набора негативных панорамирования фагов видны на слюду, выполнять сложение раундов, пока не фаги не обнаружены, прежде чем приступить к следующему набору отрицательного панорамирования.
9. Иммунопреципитация антиген-мишень
- Для ISOLATе антиген-мишень (TDP-43), добавьте 250 мкг Гомогенизируют мозговой ткани (от моторной коре), 100 мкл 1/100 разбавлении анти-TDP 43 поликлональных антител и 1x STEN буфер для 700 мкл общего объема, чтобы Эппендорфа Трубка 28.
- Инкубируйте O / N при 4 ° С на ротатора. Wash / G агарозы бусины с 1х STEN буфер 2-3 раза и добавить 25 мл на ткани смеси. Инкубируйте при 4 ° С в течение 1,5 ч на ротатор и затем центрифуге при 2000-4000 оборотов в минуту в течение 1 мин.
- Удалить супернатант и промывают осадок один раз буфером 1x STEN и 5 раз с PBS. Добавить 40-60 мкл 1x STEN буфера к осадку и кипятить в течение 5 мин. После проб прохладно, центрифуги и собирать надосадочную жидкость. Используйте SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга, чтобы проверить успешность процесса 30 иммунопреципитации.
10. дот Анализ
- Вырезать нитроцеллюлозы бумаги в маленьких прямоугольников для каждого клона, который будет опробован. Dot 2 мкл БАС, FTD и здоровые образцы ткани мозга человека даже до нитроцеллюлозы бумаги и дайте ему полностью высохнуть.
- Добавьте 1-2 мл 5% сухого молока в PBS и пусть он встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавить 1 мл 1/100 разбавлении каждого фага, и пусть это встряхнуть O / N при 4 ° С. Промыть мембраны 3 раза по 10 мин каждый с 0,5% PBST.
- Добавить 1 мл 1/1000 разбавления анти-М13 HRP и пусть это встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Повторите процедуру промывания и визуализированы с помощью Western решение хемилюминесценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1, схематически демонстрирует негативный процесс панорамирования, с помощью которого мы удалили фага связывания мимо цели антигены из нашей библиотеки, используя immunotubes. Сначала мы начали с БСА, поскольку это общая блокирующий агент и любой фага, которые реагируют неспецифически с этой целью было бы проблематичным в будущих иммунологических. Далее, мы удалили связующих агрегированного альфа-синуклеина, чтобы устранить фага, которые являются химически с родовыми структурами агрегированных белков (например, антитело, которое будет кросс-реактивный агрегированного альфа-синуклеина, TDP-43, Abeta, и т.д.). Результаты АСМ показали фага не обязывающего после 1 тура отрицательной панорамирования против агрегированного альфа-синуклеина (рис 2А) и никаких обязательных после 8 туров (рис 2b). Мы тогда негативно приготовлена против здорового человеческого мозга ткани, чтобы удалить фаги связывания много антигенов, присутствующих в здоровом человеческом гомогената мозга. Фиг.2С (рис 2d). Поскольку количество здоровой и УТД иммунопреципитации TDP-43 белка, доступного для панорамирования была низкой, используя слюду, а не immunotubes использовать меньший объем и, следовательно, снижение совокупной потребляемого белка (рис 3). После 8 раундов отрицательной панорамирования против здорового иммунопреципитации TDP-43, фага была разделена. Половина фага было израсходовано в два тура отрицательной панорамирования против УТД TDP-43. Цель в том, чтобы устранить любые УТД TDP-43 реактивных клонов (из-за участия TDP-43 в УТД), сохраняя при этом любые потенциальные ALS TDP-43-специфических клонов.
Для положительной части панорамирования (рисунок 4), мы также использовали слюду в качестве субстрата, чтобы свести к минимуму использование материала. Мы использовали несвязанного фага после УТД TDP-43 отрицательного панорамирования против ALS TDP-43, чтобы приобрести какой-либоALS-специфических клонов. Мы также положительно приготовлена против ALS TDP-43 дважды в случае, если мы не получим клонов после использования несвязанных фагов от негативного панорамирования против УТД TDP-43. После всего процесса панорамирования, наши три метода элюции дали 154 клонов из двух положительных панорамирования против ALS TDP-43 (клонов, которые могут вступать в реакцию с БАС и УТД) и 45 потенциальных конкретных клонов ALS (с помощью несвязанных фагов из УТД TDP- 43 отрицательный панорамирование).
Для дальнейшего уменьшения потенциальных 45-специфических клонов ALS, клоны секвенировали и только клоны без каких-либо стоп-кодонов были рассмотрены далее, в течение одного клона, который показал дважды исключением. Это оставило нас с 23 потенциальными конкретных клонов БАС. После подготовки как фаги и растворимый ScFv с этих клонов, они проходят проверку в косвенных ИФА для специфичностью к ALS ткани. Почти все фагов отдали предпочтение ALS ткани над здоровой ткани (рисунок 5). Аналогичные результаты ОБТained при сравнении фага связывания БАС в УТД ткани (рисунок 6). Для будущих исследований важно, что эти клоны экспрессируют высокие урожаи функциональных scFvs, поэтому мы подготовили небольшие партии различных scFvs и проводили подобные косвенные ИФА. Сравнение ScFv связывания с БАС ткани как у здоровых (рисунок 7) и УТД ткани (рисунок 8) снова показали селективное связывание с БАС ткани почти во всех клонах.
Мы использовали другой иммуноферментного анализа (точка клякс) для дополнительной проверки привязки к ALS ткани, а также выяснить, какие клоны являются реактивными в других иммунологических приложений. Клон 2A связывания с БАС ткани показано на рисунке (Рисунок 9). Все эти клоны показали обнадеживающие результаты в один или оба из фага и ScFv ИФА. Эти результаты подтверждают, что наша АСМ на основе процесса биопэннинга очень мощный метод, который можно использовать для создания реагентов, которые селективно связываются болезнь-специфический белок VARIмуравьи непосредственно из сложных источников.
Рисунок 1. негативный процесс Биопэннинг Используя Immunotubes. Схема демонстрирует негативный процесс биопэннинга. Фаги, которые реагируют на белки, такие как БСА, агрегированного альфа-синуклеина и здоровую ткань мозга удаляются с помощью immunotubes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Подтверждение Негативное панорамирование результатов. АСМ используется для мониторинга негативных шаги панорамирования против различных мишеней для обеспечения всех реактивные фаги будут удалены. Здесь мы показываем некоторые из результатов AFM, демонстрирующиеУровень связывания фага до и после отрицательного панорамирования. (А) Фаг связывания может быть определено с агрегированных частиц альфа-синуклеина после первого раунда отрицательного панорамирования, но (В) нет фага видны после 8 раундов отрицательного панорамирования. (C ) После первого раунда отрицательной панорамирования против здоровой ткани фага обязательного очевидно, но (D) не обязательными не обнаружено после 10 раундов отрицательной панорамирования. Все изображения являются 5 мкм. Большие белые структуры на АСМ-изображений, как правило, из-за солей, присутствующих в буферы или остаточной ПЭГ из стадии осаждения ПЭГ в процессе производства фага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Отрицательная Biopannчисле процесс с использованием слюды. Схема Демонстрация Дополнительным негативным биопэннинга использованием слюды. Из-за ограниченной выборке слюды поверхность используется в первую очередь устранить связующих здоровым, а затем УТД иммунопреципитировали TDP-43. Прежде чем приступить к двух раундов отрицательной панорамирования против УТД TDP-43, фага делится пополам (в случае неудачного выделения БАС TDP-43 эксклюзивных фагов во время положительной фазы прокрутки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию из этой фигуры.
Рисунок 4. ALS Положительный Биопэннинг процесса. Схема демонстрирует позитивный процесс биопэннинга ALS. Несвязанные фаги после отрицательного панорамирование с FTD TDP-43 используются в раунде положительного панорамирования против ALS TDP-43 для элюирования более АЛСTDP-43-специфических клонов. Кроме того, два раунда положительного панорамирования против ALS TDP-43 осуществляется с помощью поверхности слюды и несвязанных фагов после отрицательного панорамирования против здоровым иммунопреципитировали TDP-43 (на связанные фаги элюировали поскольку эти фаги не следует связывать здоровым TDP-43, однако некоторые может быть перекрестно-реактивный с обеих ALS и FTD). Три способа элюирования можно использовать (трипсин, чай и TG1 клетки), чтобы убедиться, что все связанные фаги будут удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. фага ELISA отбор потенциальных БАС клонов (БАС по сравнению с HT). Использование гомогенизированный человека ALS, УТД и здоровую ткань мозга (HT), образцы выполненных нами косвенное ELISA с использованием фага, полученный из различных клонов. Результаты представлены как отношение к образцов здоровой ткани. Результаты показали, что некоторые клоны различать TDP-43, установленным у пациентов с БАС и у здоровых. БАС, УТД и HT ткани смесь образцов мозга (моторной коры) у трех лиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. фага ELISA отбор потенциальных БАС клонов (ALS против УТД). Здесь мы показываем фагов ELISA результаты БАС в сравнении больных УТД. Большинство из клонов имеют предпочтение БАС более УТД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
_upload / 52584 / 52584fig7highres.jpg "/>
Рисунок 7. ScFv ELISA отбор потенциальных ALS клоны (БАС по сравнению с HT). Используя scFvs, полученных из каждого клона, мы можем наблюдать клоны, которые имеют предпочтение TDP-43 у пациентов с БАС более здоровым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию из этой фигуры.
Рисунок 8. ScFv ELISA отбор потенциальных БАС клонов (ALS против УТД). Успех нашего процесса панорамирования далее демонстрируется при сравнении ALS для УТД для различных scFvs в косвенных ИФА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры ,
Рисунок 9. дот анализ потенциальных БАС клонов. Использование дот-блот вместо ELISA другая техника, чтобы показать специфику клонов для БАС более УТД или HT. Клон 2А показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом от NIH: R21AG042066. Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Шульца за его вклад в создание видео захвата экрана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
- Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
- Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
- Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
- Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
- Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
- Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
- Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
- Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
- Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
- Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
- Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
- Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
- Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
- Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
- Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
- Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
- Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
- Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
- Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
- Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
- Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
- Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
- Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
- Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
- Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
- Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).
