Abstract
Fordi proteinvarianter spille kritiske roller i mange sykdommer inkludert TDP-43 i amyotrofisk lateral sklerose (ALS), alpha-synuclein in Parkinsons sykdom og beta-amyloid og tau ved Alzheimers sykdom, er det av avgjørende betydning å utvikle morfologi spesifikke reagenser som selektivt kan målrette varianter disse sykdomsspesifikt protein for å studere rollen til disse variantene i sykdomspatologien og for potensielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Vi har utviklet nye atomkraftmikroskopi (AFM) basert biopanning teknikker som gjør det mulig isolering av reagenser som selektivt gjenkjenner sykdomsspesifikke proteinvarianter. Det er to hovedfaser som er involvert i prosessen, de negative og positive panorering faser. I løpet av den negative fasen panorering, er fager som er reaktive til off-målantigener eliminert gjennom flere runder med panorering subtraktiv benytte en serie nøye utvalgte off-target-antigenene. En viktig funksjon i negativpanning fase utnytte AFM avbildning for å overvåke prosessen og få bekreftet at alle uønskede fag-partikler fjernes. For den positive fasen panorering, blir target-antigenet av interesse festet på et mica overflate og bundet Fagene blir eluert og undersøkt for å identifisere fager som selektivt binder mål-antigen. Målproteinet variant behøver ikke å bli renset tilveiebringe de nødvendige negative kontroller med panning har blitt brukt. Selv målrette proteinvarianter som kun er tilstede i meget lave konsentrasjoner i komplekse biologiske materiale kan benyttes i den positive panorering trinn. Gjennom anvendelse av denne teknologien, kjøpte vi antistoffer mot protein varianter av TDP-43 som er selektivt funnet i menneskelig ALS hjernevev. Vi regner med at denne protokollen bør være aktuelt å generere reagenser som selektivt binder proteinvarianter som er tilstede i en rekke forskjellige biologiske prosesser og sykdommer.
Introduction
Nærværet av proteinvarianter har vært implisert som en faktor i utviklingen av mange sykdommer som omfatter nevrodegenerative sykdommer, slik som Alzheimer, Parkinson, ALS, og frontotemporal demens (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Oligomere former av proteinene beta-amyloid og alpha-synuclein er antatt å være de toksiske artene som er ansvarlige for Alzheimers og Parkinsons henholdsvis 2,3,4,5. Aggregater av TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) har vært knyttet til ALS og FTD 12,13,14. Derfor reagenser slik som antistoffer som selektivt kan målrette de ulike proteinvarianter kan være kraftige verktøy for å tjene som diagnostiske markører og potensielle behandlingsformer. I denne studien har vi fokusert på å utvikle reagenser som selektivt binder varianter av TDP-43 protein innblandet i ALS, men teknikken er skissert i dette papiret bør være aktuelt for isolering av reagenser mot et bredt spekter av protein varianter.
Cytoplasmatisk aggregering av TDP-43 har blitt identifisert som et patologisk trekk i ALS 15,16,17,18,19. Vanligvis TDP-43 er funnet i kjernen av alle celler fra en normal person, selv om det har en tendens til å bevege seg mellom cytosol og kjerne 15,17. Men i ALS aggregerte former av TDP-43 blir detektert i cytoplasma av utvalgte neuroner og glia med lavere konsentrasjoner som finnes i kjernen som tyder på bevegelsen av TDP-43 fra kjernen til cytoplasma under sykdomsprogresjon 16,20. Mens aggregering av TDP-43 er funnet i de fleste ALS tilfellene, betyr det ikke høyde for alle tilfeller siden 1% -2% av totale ALS tilfeller (eller 15% -20% av familiære ALS tilfeller) er knyttet til mutasjoner i superoksyddismutase 1 (SOD1) genet 15,17. På grunn av den viktige rollen TDP-43 i de aller fleste ALS tilfeller her vi fokusere på å utvikle antistoffbasert reagenser som selektivt kan binde seg til TDP-43 varianter som ertil stede i menneskets ALS hjernevev utnytte våre roman AFM basert biopanning teknikker.
I første omgang trenger vi et variert repertoar av antistoff bindende domener. Vi kombinerte tre forskjellige fagfremvisning enkelt kjede variabel domene antistoffragment (scFv) biblioteker, (Tomlinson I og J og Sheets biblioteker 21). Panning-prosessen er delt i negative og positive panorering faser. Fager fra bibliotekene blir først utsatt for den negative panorering prosessen under hvilken fager reaktiv til flere off-target-antigenene er utelukket. Etter fullførelsen av hver runde med panorering negativ mot hverandre off-target-antigenet, er prosessen overvåkes av AFM avbildning for å sikre at alle fag binding off-target-antigenene har blitt fjernet. Etter å ha kontrollert av AFM tenkelig at alle reaktive fag blir fjernet vi gå videre til det neste målet. Å isolere reagenser mot TDP-43 varianter innblandet i ALS vi benyttet følgende negative panorering antigener: 1) BSA for å fjerne fag som binder svakt eller ikke-spesifikt til proteiner; 2) aggregerte alpha-synuclein å fjerne fag som binder til generiske strukturelementer av aggregerte proteiner; 3) human hjerne vevshomogenater å fjerne fag som binder seg til eventuelle proteiner eller andre komponenter som er tilstede i post-mortem prøver av friske humane hjernevevet; 4) immunopresipitert TDP-43 fra sunne menneskelige hjerne å fjerne fag som binder til alle TDP-43 former forbundet med sunne menneskelige hjerne; og 5) immunopresipitert TDP-43 isolert fra FTD hjerne-homogenater å fjerne fag som binder TDP-43 varianter i forbindelse med ikke-ALS patologi. Etter fjerning av alt fagen reaktive til alle off-target-antigenene, vi fortsatte deretter til den positive panorering fase der antistoff-fragmenter som binder antigenet av interesse blir isolert, i dette tilfellet TDP-43 immunopresipitert fra humane ALS hjernevev. Disse isolerte antistoffer kan være reaktivt til aggregerte eller modifiserte former av TDP-43.
"> Konvensjonell fag biopanning hovedsak fokuserer på det positive panorering fase 22,23. Vanligvis målet om interessen er immobilisert, lagt fagbibliotek og innbundne fager elueres. Fagene blir så forsterket og lagt til målet igjen. Denne forsterkningen og inkubasjon prosess blir vanligvis gjentatt flere ganger for å øke prosentandelen av positive fag-binding. Selv om variasjoner av denne fremgangsmåte er blitt brukt i stor utstrekning for å isolere antistoffreagenser mot et bredt spekter av mål-antigener, krever de vanligvis store mengder av renset målantigen 24,25,26, 27, mens foreliggende fremgangsmåte krever bare spormengder av målantigenet. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å isolere reagenser som selektivt binder mål-antigener som er til stede i meget lave konsentrasjoner, uten behov for rensing, og panorering kan utføres direkte mot antigen stede i komplekse vevsprøver. Bruken av uttømmende negative panorering protokoller som bekreftetav AFM sikrer at kloner isolert mot den positive antigen bør selektivt binde målet, selv når det ikke er renset eller anriket.Kasturirangan og kolleger (2003) har gjennomført en lignende negativ og positiv biopanning prosess for å isolere antistoffer reaktive til oligomert beta-amyloid bruker nanogram konsentrasjon av målet fem. Her har vi utvide denne prosess til å muliggjøre generering av reagenser som selektivt binder sykdomsspesifikt protein varianter direkte fra humane vevsprøver. I fremtidige studier skal vi undersøke nærmere ikke bare den diagnostiske verdien av reagenser isolert her, men også vurdere deres terapeutiske relevans for behandling av ALS.
Samlet vår nye AFM basert biopanning teknologi bør være anvendelig til isolering av en hvilken som helst sykdomsspesifikk proteinvariant i hvilken som helst biologisk materiale uten behov for proteinrensing eller modifisering, selv om ønsket antigen-konsentrasjonns er ekstremt lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fag Produksjon
- Utføre alle fag produksjons- og biopanning prosesser i en biosikkerhet kabinett. Produsere fager partikler fra de forskjellige bibliotekene (Tomlinson I og J biblioteker og blad bibliotek 21) for biopanning prosessen ved hjelp av produsentens instruksjoner (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
MERK: Vi bruker flere biblioteker i vår panorering prosess for å øke mangfoldet av antistoffene tilgjengelige. - I korthet bakterier kultur lagrene av de tre bibliotekene i 200 ml 2 x YT-inneholdende 1% glukose og 100 ug / ml ampicillin på et risteapparat ved 37 ° C inntil OD600 er 0,4.
- Tilsett 8 x 10 11 av KM13 hjelperfagen til 200 ml av Tomlinson I og J biblioteker og 8 x 10 11 av hjelperfagen VCSM13 til 200 ml av den blad biblioteket. Inkuber biblioteksprøver med hjelper-fag i 30 minutter ved 37 ° C uten risting.
- Sentrifugerkulturer ved 3000 xg i 10 minutter og cellepelleten suspenderes i 200 ml 2 x YT med 0,1% glukose, 100 ug / ml ampicillin og 50 ug / ml kanamycin.
- Inkuber kulturer O / N ved 30 ° C med risting og så spinne i 30 minutter ved 3300 xg til følgende dag.
- Tilsett 50 ml polyetylenglykol (PEG) 8000 i 2,5 M NaCl til 200 ml av supernatanten fra hver av biblioteker og inkuberes på is i 1 time. Etter PEG nedbør, spinne løsninger igjen i 30 min ved 3300 x g.
- Legg 1-2 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til cellepelleten (avhengig av størrelsen av pelleten) og overføring til mikrosentrifugerør.
- Inkuber fagpartikler på is i 1 time ved 37 ° C med leilighetsvis blanding før sentrifugering i 10 minutter ved 11.600 x g. Samle supernatanten og oppbevares ved -80 ° C.
- Før frysing, overføre et lite volum av fag-partikler fra de tre bibliotekene til en annen mikrosentrifugerør og titer hvert bibliotekindividuelt ved TG1 celler for å bestemme konsentrasjonen. Nedenfor er en beskrivelse av titer prosess for en bibliotek.
- Grow TG1 celler til OD 600 på 0,4. Legg 990 mL PBS til 6 mikrosentrifugerør.
- Til det første rør legger til 10 ul av fagpartikler. Etter blanding fjerne 10 mL fra tube ett og legge til rør 2. Gjenta denne prosedyren for de resterende 4 rør.
- Tilsett 200 ul av TG1-celler til 6 rør og tilsett 10 pl av hver av de seks fag-fortynninger til disse rør. La fagpartikler å infisere i 30 minutter uten risting ved 37 ° C.
- Plate 100 ul av cellene like til Luria-Bertani-agar-plater med 100 ug / ml ampicillin (LBA). Inkuber O / N ved 37 ° C og deretter bestemme pfu / ml ved hjelp av antallet synlige kolonier.
2. Negativ Biopanning Process
MERK: Unngå for mange fryse tine av fagene gjennom hele biopanning prosessen. Ideally, er det best å gjennomføre så mange av de negative panorering skritt som mulig i en dag. Etter gjennomføring av de runder med negativ eller positiv panning mot hvert mål er det viktig å lagre noen av fagen i forbindelse med forurensning på ethvert trinn.
- 12 runder av Negative panorering mot Bovine Serum Albumin (BSA)
- Tilsett 4 ml 1 mg / ml BSA-oppløsning i PBS til 12 immunotubes og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Kombiner 1 x 10 12 fagpartikler fra hver av de tre bibliotekene (avsette en liten mengde av denne fag-blandingen for fremtidig kontroll av den negative panorering prosessen).
- Kast BSA-oppløsning fra det første rør og vaske røret 2-3 ganger med PBS for å fjerne eventuelt ubundet BSA.
- Legg de kombin fagbiblioteker til dette første rør, inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur på rotator og samle de ubundne fager.
- Gjenta trinn 2.1.3 med den andre immunotube og legge fagen samlet fra trinn 2.1.4 til dette jegmmunotube. Gjenta trinn 2.1.4.
- Gjenta trinn 2.1.3-2.1.4 med de resterende 10 rør av BSA løsning og ubundet fag samles etter hvert inkubasjon.
- Å bekrefte fjerning av alle BSA fag permer bruke AFM. Tilsett 10 pl av fagen fra trinn 2.1.2 og 10 pl av den resterende fag etter trinn 2.1.7 separat til 10 ug / ml BSA bundet til spaltet glimmer. En kortversjon av AFM prosessen er beskrevet i punkt 8.
- Det er viktig å lagre en liten mengde av fag etter endt mange runder med negative panorering mot hvert mål å bekrefte suksess for panorering prosessen.
- 10 Helg Negativ panorering mot ulike former for Alpha-synuclein
MERK: I dette prosjektet ønsker vi å fjerne fag som kan binde andre aggregerte former av proteiner som alpha-synuclein (monomer, dimer, trimer, etc.), og så vil vi eliminere noen av disse fagene (målet er å eliminere så mange kryssreaktive fager som mulig). Tillate renset alfa-synuclein å aggregere i minst 7 dager, slik at både monomere og oligomere former er til stede for negativ panorering.- Forberede fire immunotubes med 500 mikrogram / ml aggregert alpha-synuclein i PBS og 4 immunotubes med 100 mikrogram / ml aggregert alfa-synuclein og ruge O / N ved 4 ° C.
- Kast løsningen fra ett av rørene med 500 mikrogram / ml aggregert alpha-synuclein, vask med PBS og tilsett fagbibliotek samlet etter 12 runder med negative panorering med BSA.
- Inkuber røret i 30 minutter ved RT på rotator og samle de ubundne fager.
- Gjenta trinn 2.2.3 og 2.2.4 for de resterende rør med 500 mikrogram / ml aggregert alpha-synuclein og deretter rør med 100 mikrogram / ml aggregert alpha-synuclein hjelp av ubundet fag samles hver gang etter trinn 2.2.4.
- Gjenta trinn 2.1.8 hjelp av fagen etter den første negative panorering mot 500 ug / ml av alfa-aggregert-synuclein og fagen etter den åttende runde med panorering mot negativ 100 ug / ml av alfa-synuclein.
- Å eliminere alle negative bindemidler mot alfa-synuclein forberede to ekstra immunotubes med 500 mikrogram / ml aggregert alfa-synuclein og gjentar trinn 2.2.2-2.2.4.
- 10 Helg Negativ panorering mot Sunn Human Brain vevhomogenat
- Legg 1x STEN-buffer (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF, og protease-inhibitor cocktail) til humant hjernevev 28. Homogenisere ved 24.000 rpm i 1 minutt, sentrifugere prøven ved 3000 rpm og samle supernatanten.
- Forbered 2 immunotubes med 2 ml 50 ug / ml humant hjernevev i PBS og 8 immunotubes med 10 ug / ml humant hjernevev og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Gjenta trinnene 2.2.3-2.2.5 først med rør som inneholdt 50 ug / ml humant hjernevev og deretter med de inneholdende 10 ug / ml av human bregn vev ved hjelp av den ubundne fag samlet etter den negative panorering mot alfa-synuclein.
- Gjenta trinn 2.1.8 hjelp av fagen etter den første negative panorering mot 50 pg / ml humant hjernevev og fagen etter den tiende runde med panorering negativ mot humant hjernevev.
- 8 runder av Negative panorering mot Sunn immunopresipitert TDP-43
- Immunoutfelle sunn TDP-43 protein fra sunn menneskelig hjernevev ved hjelp av protokollen som er beskrevet i kapittel 9. På grunn av lavere mengde immunpresipitert protein, utføre disse runder med negative panorering bruker glimmer.
- Cleave åtte glimmer overflater.
- Til den første glimmer legge ~ 100 ul av 5 ug / ml av det immunutfelte proteiner og inkuberes i 5-10 minutter ved romtemperatur.
- Vask glimmer 5 ganger med 0,1% PBS med Tween 20 (PBST).
- Legg ~ 100 pl av fagen etter den negative panorering mot friskt hjernevev og inkuberes i 5-10 minutter vedRT.
- På midtveis inkubasjon av trinn 2.4.5, gjennomføre trinn 2.4.3 å bruke den andre glimmer.
- Samle fagen fra trinn 2.4.5 og vaske glimmer 5 ganger med 0,1% PBST.
- Vask glimmer fra trinn 2.4.6 og legge til fag fra 2.4.7.
- Gjenta trinn 2.4.4 til 2.4.9 før fagen er negativt panorert mot alle åtte glimmer med immunopresipitert protein. Gjenta trinn 2.1.7 hjelp av fagen etter den første og åtte runde med panorering negativ.
- 2 Skudd av Negative panorering Against FTD immunopresipitert TDP-43
- Immunpresipitatet TDP-43 protein fra hjernen til personer med FTD.
- Cleave to glimmer overflater.
- Tilsett 50 ul av 10 ug / ml FTD TDP-43 til en glimmer. Inkuber i 5 min ved RT.
- Vask glimmer fem ganger med 0,1% PBST.
- Tilsett 50 pl av fagen oppsamlet etter negativ panorering mot sunt TDP-43. Inkuber i 5 min.
- Samle ubundne fager.
- Repeats trinn 2.5.3 til 2.5.6 med den andre glimmer og ubundet fag samlet i 2.5.6.
3. Positive panorering mot immunopresipitert TDP-43 fra personer med ALS
- Immunpresipitatet TDP-43 protein fra hjernen til personer med ALS. Cleave 3 glimmer overflater. Tilsett 50 ul av 10 ug / ml av ALS TDP-43 til en glimmer. Inkuber i 5 min ved RT. Vask glimmer fem ganger med 0,1% PBST.
- Tilsett 50 pl av fagen oppsamlet etter negativ panorering mot sunt TDP-43 til glimmer. Inkuber i 5 min.
- Samle ubundne fager. Også samle bundet fag ved hjelp av tre elusjonstester metoder. Det er viktig å holde alle innsamlede fager i disse panorering trinn separate.
- Først, tilsett 50 ul trypsin (1 mg / ml i PBS) til hver glimmer og inkuberes i ikke mer enn 10 min. Samle løsningen og lagre. Tilsett deretter 50 pl av 100 mM trietylamin (TEA) til hver glimmer og inkuberes i ikke mer enn 10 min. Collect løsningen, tilsett like stort volum av 1 M Tris-HCl-buffer pH 7,4 og lagre.
- For det tredje, tilsett 50 pl av TG1 ved OD 600 på 0,4 direkte til glimmer og inkuber i 30 min ved 37 ° C. Også legge de fager som er samlet fra de to elueringstrinnene metoder 3.3.1 til 100 ul av TG1 ved OD 600 på 0,4, og inkuber i 30 min ved 37 ° C.
- Gjenta trinn 3.1 med en annen glimmer.
- Ta den ubundne fag samlet i 3.3.2. å bruke den første glimmer med ALS TDP-43 og legge den til den andre glimmer med ALS TDP-43. Inkuber i 5 min.
- Gjenta alle trinnene i 3.3 for disse andre sett med glimmer.
- Kombinere TG1 celler infisert med fagene eluert med trypsin fra to ALS TDP-43 glimmer og plate på LBA plater. Gjenta den samme prosessen for TEA og TG1 elueres fag fra de to ALS TDP-43 glimmer for totalt tre plater.
MERK: På grunn av TDP-43 engasjement i både ALS og FTD, noen av kloner isolert ito runder med positiv panorering mot ALS TDP-43 kan være spesifikke for dette målet, men noen kan også binde FTD. Å bedre isolere ALS spesifikke kloner, ta den ubundne fag samlet etter to runder med negative panorering mot FTD TDP-43 (siden disse to runder med negative panorering burde ha fjernet noen mål som er reaktiv til FTD TDP-43) og bruke disse fagene i enda en runde med panning positiv mot ALS TDP-43 antigenet på glimmer (forberede ALS TDP-43 glimmer som beskrevet ovenfor i 3.3 og 3.4). - Gjenta alle trinnene i 3.3 med denne tredje ALS glimmer og plate de infiserte TG1 celler på tre LBA plater O / N ved 37 ° C. Den neste dag telle antall kolonier på platene 6 LBA med de potensielle ALS-kloner. Det bør være færre kolonier på de tre LBA plater med de potensielle ALS kloner etter tredje runde av positiv panorering i forhold til de tre LBA plater etter de to rundene av positiv panorering.
4. Dyrking og Phage Produktion av mulige positive kloner mot ALS Spesifikk TDP-43
- Vokse hver koloni fra 6 plater i 96-brønners plater inneholdende 100 ul av 2 x YT med 1% glukose og 100 ug / ml ampicillin på et risteapparat ved 37 ° CO / N.
- Den neste dag overføring av 10 ul fra brønnene inneholdende kloner fra de tre LBA platene etter den tredje runde med positiv panning med ALS TDP-43 protein til mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml av 2 x YT med 1% glukose og 100 ug / ml ampicillin .
- Legg glycerol til alle kulturer i 96-brønners plater til en sluttkonsentrasjon på 15% og fryse platene ved -80 ° C. La 1 ml kulturer til å vokse i 2-3 timer risting ved 37 ° C.
- Tilsett 10 9 av KM13 hjelperfagen og tillater hjelper-fagen til å infisere i 1 time ved 37 ° C med risting. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 3000 x g, supernatanten kastes og tilsett 1 ml 2 x YT med 0,1% glukose, 100 ug / ml ampicillin og 50 ug / ml av kanamycin.
- Kultur cellene O / N ved 30 ° C med risting. Sentrifuger rørene ved 3300 xg i 30 min, Overfør supernatanten til nye mikrosentrifugerør og tilsett 250 pl PEG / NaCl til hvert rør.
- Inkuber rørene på is i 1 time. Sentrifuger rørene igjen ved 3300 xg i 30 minutter, kaste supernatanten og tilsett 100 ul av PBS til hvert rør.
- Inkuber rørene på is i 1 time. Spinne rørene i 10 minutter ved 11 600 xg, og supernatanten overføres til nye rør. Oppbevar fager ved -80 ° C.
5. Sekvensering av potensielle ALS Clones
- Gjenta trinn 4.2 og la kulturer å vokse O / N ved 37 ° C med risting. Den neste dag utføre DNA-plasmid preps av klonene i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensere klonene med riktig forover og revers primere.
6. Screening Potensielle Positive Clones mot ALS Spesifikk TDP-43 Bruke Indirekte ELISA
- Tilsett 100 ul 2,5 ug / ml av als, FTD og sunt menneske hjernevev til brønnene til en høy binding ELISA-plate for hver potensielle ALS klonen. Inkuber platene ved 37 ° C i 1 time under langsom rysting.
- Vask platene tre ganger med 0,1% PBST. Legg 200 ul av 2% melkepulver i PBS til brønnen og inkuberes platene ved 37 ° C i 1 time under langsom rysting.
- Gjenta vasketrinn, og deretter tilsett 100 ul av hver fag ble fortynnet minst 1/100 i PBS til brønnene. Etter inkubasjon og vask trinn, tilsett 100 ul av 1 / 1,000 anti-M13-HRP- til hver brønn. Vask platene og visualisere ved hjelp av ELISA femto chemiluminescence underlaget kit.
7. scFv Produksjon og screening hjelp Indirekte ELISA
- Grow HB 2151 celler til OD 600 på 0,4. Tilsett 5 mL av de forskjellige fagene i 20 pl av HB 2,151 celler. Tillat fagene 30 min for å infisere ved 37 ° C uten risting. Dele LBA plater i nett såat ca 20 kloner kan belagt på hver.
- Legge 5-10 ul av hver fag-infiserte bakterier i platen og inkuber O / N på 37 * C. Den neste dag legge individuelle kolonier til 1 ml av 2 x YT med 0,1% glukose og 100 ug / ml ampicillin og rist ved 37 ° C i 3-4 timer inntil OD600 er 0,6.
- Tilsett 1 ul 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) til hvert rør og inkuberes O / N ved 30 ° C med risting. Spinne rør ved 11 600 xg i 10 min, og høste supernatanten for ELISA-testing.
- For ELISA-testing følger de samme prosedyrene i kapittel 6, bortsett fra i stedet for fag i 6.5 legge scFv ufortynnet og for 6.6 tilsett 100 mL av en / 1000 9E10 HRP.
8. AFM Process
- Legg 10 til 20 ul av mål-antigen til spaltet glimmer og inkuberes i 5 til 10 min. Vask glimmer 5 ganger med vann. Legg 10 til 20 ul av de fager til glimmer og inkuberes i 5 til 10 min.
- Vask glimmer fem ganger igjen with vann og la glimmeret å lufttørke. Visual fag bindende hjelp AFM ett. Utfør AFM bildeprosessen ved hjelp av AFM tappe modus med en Nanoscope IIIa controller i luft ved RT 29. De silisium AFM sonder har en resonansfrekvens på 300 kHz og en fjærkonstant på 40 N / m. Bruk en scan rate på 3,05 Hz, og en skanneoppløsning 512 samples / linje.
- Behandle bilder av grunnleggende utflating av bakgrunnen for å sikre at alle partikkelstørrelser er sammenlignbare innenfor hvert bilde. Fag-bredde (ikke lengden) kan variere fra bilde til bilde på grunn av andre partikkelstørrelser og skanneområdet, men det vil ikke gå på akkord med nøyaktigheten av hvorvidt eller ikke fagen binder seg til antigenet.
- Dersom det under AFM bekreftelse for hvert sett av negative panorering fag er synlige på glimmer, utføre tillegg runder inntil ingen fag blir oppdaget før du går videre til det neste settet med negativ panorering.
9. Immunpresipitasjon av Target Antigen
- Til ISOLATe målantigenet (TDP-43), tilsett 250 ug homogenisere hjernevevet (fra motor cortex), 100 ul av en hundredel fortynning av anti-TDP 43 polyklonalt antistoff og 1x STEN-buffer til 700 ul totalvolum til en Eppendorf tube 28.
- Inkuber O / N ved 4 ° C på en rotator. Vask A / G agaroseperler med 1x STEN buffer 2-3 ganger og tilsett 25 ml til vevet blanding. Inkuber ved 4 ° C for 1,5 timer på en rotator og sentrifuger ved 2000-4000 opm i 1 min.
- Fjern supernatanten og pelleten vaskes en gang med 1x STEN-buffer og 5 ganger med PBS. Legg 40 til 60 ul av 1 x STEN buffer til pelleten og koke i 5 minutter. Etter at prøvene er kule, sentrifuger og samle supernatanten. Bruke SDS-PAGE og Western blotting for å verifisere suksess for immunopresipitering prosessen 30..
10. Dot Blot Analysis
- Skjær nitrocellulose papir i små rektangler for hver klone som vil bli testet. Dot 2 mL av ALS, FTD og sunne menneskelige hjerne vevsprøver unto nitrocellulosen papir og la det tørke.
- Legg 1-2 ml 5% melk i PBS pulver og lar det hele rystes i en time ved RT. Tilsett 1 ml av 1/100 fortynning av hvert fag, og la det riste O / N på 4 ° C. Vask membranen 3 ganger i 10 minutter hver med 0,5% PBST.
- Tilsett 1 ml av 1/1000-fortynning av anti-M13 HRP og la det hele rystes i en time ved RT. Gjenta vaskeprosedyren og visualisert ved hjelp av Western chemiluminescence løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 viser skjematisk den negative panorering prosessen som vi fjernet fag bindende off-target antigener fra vårt bibliotek ved hjelp immunotubes. Vi opprinnelig startet med BSA, siden dette er et vanlig blokkeringsmiddel, og ethvert fagen som ville reagere ikke-spesifikt med dette målet ville være problematisk i fremtidige immunoanalyser. Deretter fjernet vi permer til aggregert alpha-synuclein å eliminere fag som er reaktiv med generiske strukturer av aggregerte proteiner (dvs. et antistoff som ville være kryssreaktive å aggregert alpha-synuclein, TDP-43, Abeta, etc.). AFM Resultatene viste fag bindende etter en runde med negativ panorering mot aggregert alpha-synuclein (Figur 2A) og ingen bindende etter 8 runder (figur 2B). Vi så negativt panorert mot sunn menneskelig hjernevev å fjerne fagen binde de mange antigener stede i sunn menneskelig hjernehomogenat. Figur 2C (figur 2D). Siden mengden av sunne og FTD immunopresipitert TDP-43-proteinet er tilgjengelig for panning var lav, ved hjelp av glimmer i stedet immunotubes utnyttes mindre volum og dermed reduserte totale protein forbrukt (figur 3). Etter 8 runder med negative panorering mot sunn immunopresipitert TDP-43, ble fagen delt. Halvparten av fag ble brukt i to runder med negative panorering mot FTD TDP-43. Målet var å eliminere eventuelle FTD TDP-43 reaktive kloner (på grunn av TDP-43 engasjement i FTD), og samtidig beholde eventuelle ALS TDP-43 konkrete kloner.
For positiv panning parti (figur 4), har vi også anvendes glimmer som et substrat for å minimalisere bruk av materialet. Vi brukte den ubundne fag etter FTD TDP-43 negativ panorering mot ALS TDP-43 å erverve noenALS spesifikke kloner. Vi har også positivt panorert mot ALS TDP-43 to ganger i tilfelle at vi ikke få kloner etter bruk av ubundet fag fra den negative panorering mot FTD TDP-43. Etter at hele panorering prosessen, våre tre elusjonstester metoder ga 154 kloner fra de to positive panorering mot ALS TDP-43 (kloner som kan være reaktivt til ALS og FTD) og 45 potensielle ALS spesifikke kloner (ved hjelp av ubundet fag fra FTD TDP- 43 negativ panorering).
For å redusere de 45 potensielle ALS spesifikke kloner ytterligere, blir klonene sekvensert, og bare de klonene, uten noen stopp-kodoner ble vurdert nærmere, bortsett fra en klon som viste seg dobbelt. Dette forlatt oss med 23 potensielle ALS spesifikke kloner. Etter å forberede både fag og løselig scFv med disse kloner, blir de testet i indirekte ELISA for spesifisitet til ALS vev. Nesten alle fager viste en preferanse for ALS vev i løpet av friskt vev (figur 5). Lignende resultater er OBTained når man sammenligner fag binding til ALS til FTD vev (figur 6). For fremtidige studier er det viktig at disse kloner uttrykke høy avkastning av funksjonelle scFv, så vi produserte små grupper av de ulike scFv og gjennomført lignende indirekte ELISA. Sammenligning av scFv-binding til ALS vev til både friske (figur 7) og FTD vev (figur 8) på nytt viste selektiv binding til ALS vev i nesten alle kloner.
Vi brukte en annen immunoassay (dot blotter) for ytterligere å bekrefte binding til ALS vev og også til å fastslå hvilke kloner er reaktive i andre immunologiske applikasjoner. Klone 2A binding til ALS vev er vist (figur 9). Alle disse kloner viste lovende resultater i den ene eller begge av fagen, og scFv ELISA. Disse resultatene bekrefter at vår AFM basert biopanning prosessen er en meget kraftig teknikk som kan brukes til å generere reagenser som selektivt binder sykdomsspesifikt protein varimaur direkte fra komplekse kilder.
Figur 1. Negativ Biopanning Process Utnytte Immunotubes. Skjematisk demonstrere negative biopanning prosessen. Fager som reaktiv til proteiner som BSA, aggregert alfa-synuclein og friskt hjernevev er fjernet ved hjelp immunotubes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bekreftelse Negative panorering resultater. AFM avbildning brukes til å overvåke de negative panorering skritt mot ulike mål for å sikre at alle reaktive fag blir fjernet. Her viser vi noen av AFM resultatene demonstrerernivå av fag bindingen før og etter den negative panorering. (A) Fag binding kan oppdages til aggregert alfa-synuclein partikler etter den første runden av negativ panorering, men (B) ikke fag er synlig når åtte runder med negativ panorering. (C ) Etter at den første runden av negativ panorering mot sunt vev fag bindingen er tydelig, men (D) ikke binding er oppdaget etter 10 runder med negativ panorering. Alle bilder er 5 mikrometer. De store hvite strukturer på AFM bildene er vanligvis på grunn av salter stede i buffere eller rest PEG fra PEG nedbør trinnet under fag produksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Negativ Biopanning Process Utnytte Mica. Skjematisk demonstrere ytterligere negativ biopanning hjelp glimmer. På grunn av begrenset prøve glimmer overflaten er ansatt for å først fjerne bindemidler til sunn og deretter FTD immunopresipitert TDP-43. Før du går videre til de to runder med negative panorering mot FTD TDP-43, er fagen delt i to (i tilfelle mislykket isolering av ALS TDP-43 eksklusive fager under den positive panorering fasen). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 4. ALS Positiv Biopanning Process. Skjematisk demonstrere ALS positive biopanning prosess. De ubundne fager etter den negative panorering mot FTD TDP-43 brukes i en runde med panorering mot positiv ALS TDP-43 for å eluere flere ALSTDP-43 konkrete kloner. Dessuten er to runder med panorering mot positiv ALS TDP-43 utført ved anvendelse av glimmer overflate og de ubundne fager etter negativ panorering mot sunt immunopresipitert TDP-43 (de bundne fag blir eluert siden disse fager ikke bør binde sunn TDP-43, men noen kan være kryssreaktivt med både ALS og FTD). Tre elusjonstester metoder brukes (trypsin, TEA og TG1 celler) for å sikre at alle innbundne fag blir fjernet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Fag ELISA Screening av Potensielle ALS Clones (ALS versus HT). Ved hjelp av homogenisert menneske ALS, FTD og friskt hjernevev (HT) prøver vi utført indirekte ELISA hjelp fag produsert fra ulike kloner. Resultatene er representert i forholdet til friske vevsprøver. Resultatene viste at enkelte kloner skille mellom TDP-43 finnes i ALS pasienter og de som er i sunn. ALS, FTD og HT vev er en blanding av hjerneprøver (motor cortex) fra tre personer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Fag ELISA Screening av Potensielle ALS Clones (ALS versus FTD). Her viser vi de fag ELISA resultatene av ALS versus FTD pasienter. De fleste av klonene har en preferanse for ALS enn FTD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
_upload / 52584 / 52584fig7highres.jpg "/>
Figur 7. scFv ELISA Screening av Potensielle ALS Clones (ALS versus HT). Bruke scFv produsert fra hver klone vi kan observere kloner som har en preferanse for den TDP-43 fra ALS pasienter over sunt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 8. scFv ELISA kartlegging av hvilke ALS Clones (ALS versus FTD). Suksessen vår panorering prosessen er ytterligere demonstrert når man sammenligner ALS til FTD for de ulike scFv i indirekte ELISA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 9. Dot Blot Analyse av potensielle ALS Clones. Ved hjelp av dot blot i stedet for ELISA er en annen teknikk for å vise spesifisitet av kloner for ALS enn FTD eller HT. Clone 2A vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av et stipend fra NIH: R21AG042066. Vi vil gjerne takke Philip Schulz for hans bidrag i å skape skjermen fange video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
- Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
- Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
- Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
- Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
- Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
- Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
- Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
- Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
- Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
- Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
- Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
- Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
- Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
- Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
- Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
- Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
- Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
- Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
- Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
- Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
- Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
- Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
- Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
- Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
- Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
- Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).
