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Bioengineering

Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस में तेदेपा-43 वेरिएंट के खिलाफ आकृति विज्ञान विशिष्ट अभिकर्मकों के अलगाव के लिए उपन्यास परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के आधार Biopanning

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52584
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2,3, 1
1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

Abstract

प्रोटीन वेरिएंट तेदेपा-43 Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस में (ए एल एस) में, अल्फा-synuclein सहित कई बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं क्योंकि पार्किंसंस रोग और अल्जाइमर रोग में बीटा amyloid और ताऊ, यह आकृति विज्ञान विशिष्ट अभिकर्मकों चुनिंदा लक्षित कर सकते हैं कि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है इन रोग विशिष्ट प्रोटीन रोग विकृति विज्ञान में और संभावित नैदानिक ​​और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इन वेरिएंट की भूमिका का अध्ययन करने के वेरिएंट। हम चुनिंदा रोग विशिष्ट प्रोटीन वेरिएंट समझते हैं कि अभिकर्मकों के अलगाव सक्षम है कि उपन्यास परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) आधारित biopanning तकनीक को विकसित किया है। प्रक्रिया, नकारात्मक और सकारात्मक panning के चरणों में शामिल दो प्रमुख चरण होते हैं। नकारात्मक panning के चरण के दौरान, बंद लक्ष्य एंटीजन को प्रतिक्रियाशील रहे हैं कि फगेस ध्यान से चयनित बंद लक्ष्य एंटीजन की एक श्रृंखला का उपयोग व्यकलित panning के कई दौर के माध्यम से समाप्त हो जाते हैं। नकारात्मक में एक प्रमुख विशेषताpanning चरण की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए और सभी अवांछित फेज कणों को हटा रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए AFM इमेजिंग का उपयोग होता है। सकारात्मक panning के चरण के लिए ब्याज का लक्ष्य प्रतिजन एक अभ्रक सतह पर तय हो गई है और बाध्य फगेस eluted और चुनिंदा लक्ष्य प्रतिजन कि बाँध फगेस की पहचान के लिए जांच कर रहे हैं। लक्ष्य प्रोटीन संस्करण उपयुक्त नकारात्मक panning के नियंत्रण इस्तेमाल किया गया है प्रदान करने के शुद्ध होने की जरूरत नहीं है। यहां तक ​​कि सकारात्मक panning के कदम में उपयोग किया जा सकता जटिल जैविक सामग्री में बहुत कम मात्रा में ही मौजूद हैं कि प्रोटीन वेरिएंट लक्ष्य। इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के माध्यम से, हम चुनिंदा मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों में पाया जाता है कि तेदेपा-43 के प्रोटीन वेरिएंट के लिए एंटीबॉडी का अधिग्रहण किया। हम इस प्रोटोकॉल चुनिंदा विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं और रोगों की एक विस्तृत विविधता में मौजूद प्रोटीन वेरिएंट कि बाँध पैदा करने अभिकर्मकों के लिए लागू किया जाना चाहिए कि उम्मीद है।

Introduction

प्रोटीन वेरिएंट की उपस्थिति ऐसे अल्जाइमर, पार्किंसन, ए एल एस और Frontotemporal मनोभ्रंश (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 के रूप में neurodegenerative रोगों सहित कई बीमारियों की प्रगति में एक कारक के रूप में फंसाया गया है , 10,11। प्रोटीन बीटा amyloid और अल्फा-synuclein की Oligomeric रूपों अल्जाइमर और पार्किंसंस, क्रमशः 2,3,4,5 के लिए जिम्मेदार विषाक्त प्रजाति माना जाता है। टीएआर डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन 43 (तेदेपा-43) का समुच्चय ए एल एस और FTD 12,13,14 से जोड़ा गया है। इसलिए चुनिंदा अलग प्रोटीन वेरिएंट के रूप में नैदानिक ​​मार्करों और संभावित चिकित्सा विज्ञान की सेवा के लिए शक्तिशाली उपकरण हो सकता है लक्षित कर सकते हैं कि एंटीबॉडी के रूप में इस तरह के अभिकर्मकों। इस अध्ययन में, हम हालांकि इस पत्र में उल्लिखित तकनीक prot की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ अभिकर्मकों के अलगाव के लिए लागू किया जाना चाहिए, चुनिंदा ए एल एस में फंसा तेदेपा-43 प्रोटीन की वेरिएंट कि बाँध अभिकर्मकों के विकास पर ध्यान केंद्रितEin वेरिएंट।

तेदेपा-43 के cytoplasmic एकत्रीकरण ए एल एस 15,16,17,18,19 में एक रोग सुविधा के रूप में पहचान की गई है। यह साइटोसॉल और नाभिक 15,17 के बीच ले जाने के लिए जाता है, हालांकि आमतौर पर तेदेपा-43, एक सामान्य व्यक्ति से सभी कोशिकाओं के नाभिक में पाया जाता है। तेदेपा-43 की हालांकि, ए एल एस में एकत्रित रूपों रोग प्रगति 16,20 दौरान कोशिका द्रव्य को नाभिक से तेदेपा-43 के आंदोलन का सुझाव नाभिक में पाया कम सांद्रता के साथ चुनिंदा न्यूरॉन्स की कोशिका द्रव्य और glia में पता चला रहे हैं। तेदेपा-43 के एकत्रीकरण ए एल एस मामलों के बहुमत में पाया जाता है, यह में परिवर्तन से जुड़े हुए हैं 1% कुल ए एल एस मामलों (या 15% पारिवारिक ए एल एस मामलों के -20%) की -2% के बाद से सभी मामलों के लिए खाते में नहीं है superoxide dismutase 1 (SOD1) जीन 15,17। क्योंकि ए एल एस मामलों की विशाल बहुमत में तेदेपा-43 की महत्वपूर्ण भूमिका की है, यहाँ हम चुनिंदा हैं कि तेदेपा-43 वेरिएंट के लिए बाध्य कर सकते हैं कि एंटीबॉडी आधारित अभिकर्मकों के विकास पर ध्यान केंद्रितहमारे उपन्यास AFM के आधार biopanning तकनीक के उपयोग मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों में मौजूद।

शुरू में हम एंटीबॉडी बाध्यकारी डोमेन की एक विविध प्रदर्शनों की सूची की जरूरत है। हम तीन अलग-अलग फेज प्रदर्शन एकल श्रृंखला चर डोमेन एंटीबॉडी टुकड़ा (scFvs) पुस्तकालयों, (टॉमलिंसन मैं और जम्मू और शीट्स पुस्तकालयों 21) संयुक्त। panning प्रक्रिया नकारात्मक और सकारात्मक panning के चरणों में बांटा गया है। पुस्तकालयों से फगेस पहले कई बंद लक्ष्य एंटीजन बाहर रखा गया है करने के लिए प्रतिक्रियाशील फगेस के दौरान जो नकारात्मक पॅनिंग प्रक्रिया के अधीन हैं। प्रत्येक बंद लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के प्रत्येक दौर के पूरा होने के बाद, इस प्रक्रिया को बंद लक्ष्य एंटीजन बाध्यकारी सभी फेज हटा दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए AFM इमेजिंग द्वारा नजर रखी है। केवल सभी प्रतिक्रियाशील फगेस हटा रहे हैं कि AFM इमेजिंग द्वारा पुष्टि करने के बाद हम अगले लक्ष्य के लिए आगे बढ़ना है। ए एल एस में फंसा तेदेपा-43 वेरिएंट के खिलाफ अभिकर्मकों को अलग-थलग करने के लिए हम निम्न नकारात्मक panning एंटीजन का उपयोग किया: 1) बीएसए दुर्बलता या गैर विशेष रूप से प्रोटीन के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 2) एकत्रित अल्फा synuclein एकत्रित प्रोटीन की सामान्य संरचनात्मक तत्वों के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 3) मानव मस्तिष्क ऊतक homogenates किसी भी प्रोटीन या स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों का पोस्टमार्टम नमूनों में मौजूद अन्य घटकों के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 4) स्वस्थ मानव मस्तिष्क से जुड़ी सभी तेदेपा-43 रूपों के लिए बाध्य है कि फेज दूर करने के लिए स्वस्थ मानव मस्तिष्क से तेदेपा-43 immunoprecipitated; और 5) तेदेपा-43 गैर-ए एल एस विकृति के साथ जुड़े तेदेपा-43 वेरिएंट कि बाँध फेज को दूर करने के FTD मस्तिष्क homogenates से अलग immunoprecipitated। सब बंद लक्ष्य एंटीजन को प्रतिक्रियाशील सभी फेज को हटाने के बाद, हम तो मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों से immunoprecipitated इस मामले तेदेपा-43 में, ब्याज की प्रतिजन कि बाँध एंटीबॉडी टुकड़े अलग कर रहे हैं, जिसके दौरान सकारात्मक panning के चरण के लिए रवाना हुए। इन अलग एंटीबॉडी तेदेपा-43 के एकत्रित या संशोधित रूपों के लिए प्रतिक्रियाशील हो सकता है।

"> परम्परागत फेज biopanning सकारात्मक panning के चरण 22,23 पर मुख्य रूप से केंद्रित है। आमतौर पर ब्याज का लक्ष्य स्थिर है, फेज पुस्तकालय जोड़ा और बाध्य फगेस। इस प्रवर्धन और ऊष्मायन प्रक्रिया फगेस तो परिलक्षित कर रहे हैं। Eluted और फिर से लक्ष्य करने के लिए जोड़ा इस प्रक्रिया के रूपांतरों लक्ष्य एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ एंटीबॉडी अभिकर्मकों अलग करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, जबकि आम तौर पर सकारात्मक बंधन फेज का प्रतिशत बढ़ाने के लिए कई बार दोहराया है।, वे आम तौर पर शुद्ध लक्ष्य प्रतिजन 24,25,26 की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, हमारी प्रक्रिया केवल लक्ष्य प्रतिजन की मात्रा का पता लगाने की आवश्यकता है, जबकि। 27, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल शुद्धि और panning के लिए आवश्यकता के बिना बहुत कम मात्रा में मौजूद हैं कि चुनिंदा बाँध लक्ष्य एंटीजन, के खिलाफ सीधे किया जा सकता है कि अभिकर्मकों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जटिल ऊतकों के नमूनों में प्रतिजन मौजूद। संपूर्ण नकारात्मक panning के प्रोटोकॉल का उपयोग सत्यापित के रूप मेंAFM के द्वारा शुद्ध या समृद्ध नहीं जब सकारात्मक प्रतिजन के खिलाफ अलग-थलग क्लोन चुनिंदा भी लक्ष्य बाध्य होना चाहिए कि यह सुनिश्चित करता है।

कस्तूरीरंगन और उनके सहयोगियों (2003) लक्ष्य 5 की nanogram एकाग्रता का उपयोग कर oligomeric बीटा amyloid के लिए प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी अलग करने के लिए इसी तरह की एक नकारात्मक और सकारात्मक biopanning प्रक्रिया से बाहर किया जाता है। यहाँ हम चुनिंदा रोग विशिष्ट प्रोटीन मानव ऊतकों के नमूनों से सीधे वेरिएंट कि बाँध अभिकर्मकों की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए इस प्रक्रिया पर विस्तार। भविष्य के अध्ययनों में हम आगे न केवल यहां पृथक अभिकर्मकों के नैदानिक ​​मूल्य की जांच, लेकिन यह भी ए एल एस के इलाज के लिए उनके चिकित्सीय प्रासंगिकता का आकलन करना चाहते हैं।

कुल मिलाकर, हमारे उपन्यास AFM के आधार biopanning प्रौद्योगिकी, प्रोटीन शुद्धि या संशोधन के लिए आवश्यकता के बिना किसी भी जैविक सामग्री में किसी भी रोग विशिष्ट प्रोटीन संस्करण के अलगाव के लिए लागू किया जाना चाहिए, तब भी जब लक्ष्य प्रतिजन concentratioएनएस बेहद कम हैं।

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Protocol

1. फेज उत्पादन

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी फेज उत्पादन और biopanning प्रक्रियाओं को पूरा करें। निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर biopanning प्रक्रिया के लिए (21 पुस्तकालय टॉमलिंसन मैं और जम्मू पुस्तकालयों और शीट्स) विभिन्न पुस्तकालयों से फगेस के कणों का उत्पादन (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf)।
    नोट: हम उपलब्ध एंटीबॉडी की विविधता को बढ़ाने के लिए हमारे पॅनिंग प्रक्रिया में कई पुस्तकालयों का उपयोग करें।
  2. संक्षेप में, आयुध डिपो 600 तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर 2xYT युक्त 1% ग्लूकोज की 200 मिलीलीटर और एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में तीन पुस्तकालयों की संस्कृति बैक्टीरिया के शेयरों में 0.4 है।
  3. टॉमलिंसन मैं और जम्मू पुस्तकालयों में से 200 मिलीलीटर और शीट्स पुस्तकालय की VCSM13 सहायक फेज के 8 X 10 11 से 200 मिलीलीटर KM13 सहायक फेज के 8 X 10 11 जोड़ें। मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सहायक फेज के साथ पुस्तकालय नमूने सेते हैं।
  4. अपकेंद्रित्र10 मिनट के लिए 3000 XG पर संस्कृतियों और 0.1% ग्लूकोज के साथ 2xYT के 200 मिलीलीटर, एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल और केनामाइसिन के 50 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  5. झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों हे / एन सेते हैं और फिर अगले दिन XG 3300 पर 30 मिनट के लिए स्पिन।
  6. पुस्तकालयों में से प्रत्येक से सतह पर तैरनेवाला के 200 मिलीलीटर के लिए 2.5 एम NaCl में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) 8000 के 50 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं। खूंटी वर्षा के बाद, 3300 x जी पर 30 मिनट के लिए फिर से समाधान स्पिन।
  7. Microcentrifuge ट्यूब के लिए सेल गोली (गोली के आकार पर निर्भर करता है) और हस्तांतरण के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. 11,600 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए centrifuging पहले सामयिक मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बर्फ पर फेज कणों को सेते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला और दुकान ले लीजिए।
  9. ठंड से पहले, एक और microcentrifuge ट्यूब तीन पुस्तकालयों से फेज कणों की एक छोटी मात्रा हस्तांतरण और प्रत्येक पुस्तकालय अनुमापांकव्यक्तिगत रूप से एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए TG1 कोशिकाओं का उपयोग। नीचे एक पुस्तकालय के लिए अनुमापांक प्रक्रिया का वर्णन है।
    1. 0.4 के 600 आयुध डिपो के लिए TG1 कोशिकाओं को विकसित। 6 microcentrifuge ट्यूब के लिए पीबीएस के 990 μl जोड़ें।
    2. पहली ट्यूब फेज कणों के 10 μl जोड़ें। मिश्रण के बाद, ट्यूब एक से 10 μl हटाने के लिए और शेष चार ट्यूबों के लिए 2. दोहराएँ ट्यूब करने के लिए इस कदम जोड़ें।
    3. 6 ट्यूबों के लिए TG1 कोशिकाओं के 200 μl जोड़ें और इन ट्यूबों के लिए छह फेज dilutions की प्रत्येक के 10 μl जोड़ें। फेज कणों कोई 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 30 मिनट के लिए संक्रमित करने की अनुमति दें।
    4. प्लेट एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (LBA) के साथ प्लेटें अगर Luria-Bertani पर्यत कोशिकाओं के 100 μl। 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं और फिर से दिखाई कालोनियों की संख्या का उपयोग कर pfu / मिलीलीटर निर्धारित करते हैं।

2. नकारात्मक Biopanning प्रक्रिया

नोट: biopanning प्रक्रिया के दौरान फगेस के भी कई फ्रीज पिघलना से बचें। ईदeally, यह एक दिन में संभव के रूप में नकारात्मक panning के चरणों में से कई के रूप में बाहर ले जाने के लिए सबसे अच्छा है। प्रत्येक के खिलाफ नकारात्मक या सकारात्मक पैनिंग के दौर के पूरा होने के बाद यह किसी भी कदम पर प्रदूषण के मामले में फेज में से कुछ को बचाने के लिए महत्वपूर्ण है लक्ष्य।

  1. गोजातीय सीरम albumin के खिलाफ नकारात्मक panning के 12 दौर (बीएसए)
    1. 12 immunotubes पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    2. (एक तरफ नकारात्मक पॅनिंग प्रक्रिया के भविष्य के सत्यापन के लिए इस फेज मिश्रण की एक छोटी मात्रा सेट) तीन पुस्तकालयों में से प्रत्येक से एक 10 x 12 फेज कणों का मिश्रण।
    3. पहली ट्यूब से बीएसए समाधान त्यागें और किसी भी अपार बीएसए को हटाने के लिए पीबीएस के साथ ट्यूब 2-3 बार धो लें।
    4. यह पहली ट्यूब करने के लिए संयुक्त फेज पुस्तकालयों जोड़ें रोटेटर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और अपार फगेस इकट्ठा।
    5. दूसरा immunotube के साथ कदम 2.1.3 दोहराएँ और यह मुझे करने के लिए कदम 2.1.4 से एकत्र फेज जोड़नेmmunotube। दोहराएँ चरण 2.1.4।
    6. बीएसए समाधान और प्रत्येक ऊष्मायन के बाद एकत्र अनबाउंड फेज की शेष 10 ट्यूबों के साथ चरणों को दोहराएँ 2.1.3-2.1.4।
    7. सभी बीएसए फेज बाँधने के हटाने AFM के उपयोग को सत्यापित करने के लिए। कदम के बाद cleaved अभ्रक के लिए बाध्य बीएसए की 2.1.7 अलग से 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कदम 2.1.2 से फेज के 10 μl और शेष फेज के 10 μl जोड़ें। AFM के प्रक्रिया का एक संक्षिप्त संस्करण धारा 8 में उल्लिखित है।
    8. यह पॅनिंग प्रक्रिया की सफलता को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक लक्ष्य के विरुद्ध नकारात्मक पैनिंग के कई दौर के खत्म होने के बाद फेज की एक छोटी मात्रा को बचाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. अल्फा-synuclein के विभिन्न रूपों के खिलाफ नकारात्मक panning के 10 राउंड
    नोट: इस परियोजना में, हम इस तरह के (आदि मोनोमर, डिमर, trimer), अल्फा-synuclein के रूप में प्रोटीन और इसलिए हम इन फगेस के किसी भी समाप्त होगा के अन्य एकत्रित रूपों (लक्ष्य के रूप में समाप्त करने के लिए है बाँध सकता है कि फेज निकालना चाहते हैं संभव के रूप में कई पार प्रतिक्रियाशील फगेस)। दोनों मोनोमेरिक और oligomeric रूपों नकारात्मक panning के लिए मौजूद हैं, इतना है कि शुद्ध अल्फा synuclein कम से कम 7 दिनों के लिए कुल करने की अनुमति दें।
    1. पीबीएस में एकत्रित अल्फा synuclein के 500 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ 4 immunotubes और एकत्रित अल्फा synuclein के 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ 4 immunotubes तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    2. , एकत्रित अल्फा synuclein के 500 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ ट्यूबों में से एक से समाधान त्यागें पीबीएस के साथ धोने और बीएसए के साथ panning नकारात्मक के 12 दौर के बाद एकत्र फेज पुस्तकालय जोड़ें।
    3. रोटेटर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं और अपार फगेस इकट्ठा।
    4. दोहराएँ तो 500 माइक्रोग्राम प्रति / एकत्रित अल्फा synuclein की मिलीलीटर और कदम 2.2.4 के बाद हर बार एकत्र अनबाउंड फेज का उपयोग कर एकत्रित अल्फा synuclein के 100 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ ट्यूबों के साथ शेष ट्यूबों के लिए 2.2.3 और 2.2.4 कदम।
    5. एकत्रित अल्फा के 500 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद पहली बार फेज का उपयोग कर दोहराएँ चरण 2.1.8-synuclein और अल्फा-synuclein के 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के आठवें दौर के बाद फेज।
    6. के खिलाफ सभी नकारात्मक बाँधने को खत्म करने के लिए अल्फा-synuclein एकत्रित अल्फा synuclein के 500 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ दो अतिरिक्त immunotubes तैयार करने और दोहराने 2.2.2-2.2.4 कदम।
  3. स्वस्थ मानव मस्तिष्क ऊतक homogenate के खिलाफ नकारात्मक panning के 10 राउंड
    1. 1x स्टेन बफर (50 मिमी Tris (पीएच 7.6), 150 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 0.2% एनपी 40, 0.2% बीएसए, 20 मिमी PMSF और प्रोटीज कॉकटेल अवरोध करनेवाला) मानव मस्तिष्क के ऊतकों 28 जोड़ें। 3000 rpm पर, 1 मिनट के लिए 24,000 rpm पर अपकेंद्रित्र नमूने homogenize और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    2. पीबीएस में मानव मस्तिष्क के ऊतकों के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / 2 मिलीलीटर और मानव मस्तिष्क के ऊतकों में से 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ 8 immunotubes के साथ 2 immunotubes तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    3. मानव बी के 10 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से युक्त उन लोगों के साथ फिर मानव मस्तिष्क के ऊतकों के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त ट्यूबों के साथ पहली 2.2.3-2.2.5 चरणों को दोहराएँ औरअल्फा-synuclein के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद एकत्र अनबाउंड फेज का उपयोग कर बारिश ऊतक।
    4. 50 माइक्रोग्राम प्रति / मानव मस्तिष्क के ऊतकों की मिलीलीटर और मानव मस्तिष्क के ऊतकों के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के दसवें दौर के बाद फेज के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद पहली बार फेज का उपयोग कर दोहराएँ चरण 2.1.8।
  4. स्वस्थ immunoprecipitated तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक panning के 8 दौर
    1. कारण, immunoprecipitated प्रोटीन की कम मात्रा के लिए खंड 9 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों से स्वस्थ तेदेपा-43 प्रोटीन Immunoprecipitate अभ्रक का उपयोग कर नकारात्मक पैनिंग के इन राउंड से बाहर ले।
    2. आठ अभ्रक सतहों फोड़ना।
    3. पहले अभ्रक के लिए ~ immunoprecipitated प्रोटीन के 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के 100 μl जोड़ने और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. बीच 20 के साथ 0.1% पीबीएस (PBST) के साथ मीका 5 बार धोएं।
    5. स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद फेज की ~ 100 μl जोड़ें और 5-10 मिनट में लिए सेतेआर टी।
    6. कदम 2.4.5 के रास्ते के मध्य में ऊष्मायन में, दूसरा अभ्रक का उपयोग कर कदम 2.4.3 बाहर ले जाने के लिए।
    7. कदम 2.4.5 से फेज लीजिए और 0.1% PBST के साथ मीका 5 बार धो लें।
    8. कदम 2.4.6 से अभ्रक धो और 2.4.7 से फेज जोड़ें।
    9. फेज नकारात्मक immunoprecipitated प्रोटीन के साथ सभी आठ मीका के खिलाफ panned है दोहराएँ जब तक 2.4.9 के लिए 2.4.4 कदम। पहली और नकारात्मक पैनिंग के आठ दौर के बाद फेज का उपयोग कर दोहराएँ चरण 2.1.7।
  5. FTD immunoprecipitated तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक panning के 2 राउंड
    1. FTD के साथ व्यक्तियों के दिमाग से Immunoprecipitate तेदेपा-43 प्रोटीन।
    2. 2 अभ्रक सतहों फोड़ना।
    3. FTD के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / तेदेपा-43 मीका एक के 50 μl जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. मीका 0.1% PBST के साथ 5 बार धोएं।
    5. स्वस्थ तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद एकत्र फेज के 50 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. अनबाउंड फगेस लीजिए।
    7. Repeएटीएस दूसरा मीका और 2.5.6 में एकत्र अनबाउंड फेज के साथ 2.5.6 के लिए 2.5.3 कदम।

Immunoprecipitated तेदेपा-43 ए एल एस के साथ व्यक्तियों से खिलाफ 3. सकारात्मक Panning

  1. ए एल एस के साथ व्यक्तियों के दिमाग से Immunoprecipitate तेदेपा-43 प्रोटीन। 3 अभ्रक सतहों फोड़ना। ए एल एस के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / तेदेपा-43 मीका एक के 50 μl जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। मीका 0.1% PBST के साथ 5 बार धोएं।
  2. स्वस्थ तेदेपा-43 मीका के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद एकत्र फेज के 50 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. अनबाउंड फगेस लीजिए। इसके अलावा तीन क्षालन तरीकों का उपयोग बाध्य फगेस इकट्ठा। यह अलग इन panning चरणों में सभी एकत्र फगेस रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. सबसे पहले, प्रत्येक मीका को trypsin के 50 μl (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए और 10 मिनट से अधिक नहीं लिए सेते हैं। समाधान लीजिए और बचाने के लिए। अगला, प्रत्येक अभ्रक के लिए 100 मिमी triethylamine (चाय) का 50 μl जोड़ने के लिए और 10 मिनट से अधिक नहीं लिए सेते हैं। सहसमाधान llect, 1 एम Tris-एचसीएल बफर पीएच 7.4 और बचाने की बराबर मात्रा में जोड़ें।
    2. तीसरा, सीधे मीका को 0.4 से 600 आयुध डिपो में TG1 के 50 μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। इसके अलावा 0.4 के आयुध डिपो 600 पर TG1 की 3.3.1 करने के लिए 100 μl में दो क्षालन तरीके से एकत्र फगेस जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. दोहराएँ एक दूसरे मीका के साथ 3.1 कदम।
  5. 3.3.2 में एकत्र अनबाउंड फेज ले लो। ए एल एस तेदेपा-43 के साथ पहले मीका का उपयोग करने और ए एल एस तेदेपा-43 के साथ दूसरे मीका में जोड़ें। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. मीका के इन दूसरा सेट के लिए 3.3 में सभी चरणों को दोहराएँ।
  7. LBA प्लेटों पर दो ए एल एस तेदेपा-43 अभ्रक और थाली से trypsin के साथ eluted फगेस से संक्रमित TG1 कोशिकाओं का मिश्रण। चाय के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएं और TG1 तीन प्लेटों की कुल के लिए दो ए एल एस तेदेपा-43 मीका से फगेस eluted।
    नोट: क्योंकि ए एल एस और FTD दोनों में तेदेपा-43 की भागीदारी की, क्लोन में से कुछ में अलग-थलगए एल एस तेदेपा-43 के खिलाफ सकारात्मक पैनिंग के दो दौर के इस लक्ष्य के लिए विशिष्ट हो सकता है, लेकिन कुछ भी FTD बाँध सकती है। बेहतर ए एल एस विशिष्ट क्लोन को अलग-थलग करने के लिए, FTD तेदेपा-43 (नकारात्मक पैनिंग के इन दो दौर FTD तेदेपा-43 के लिए प्रतिक्रियाशील है कि किसी भी लक्ष्य को हटा दिया जाना चाहिए के बाद से) के खिलाफ नकारात्मक panning के दो दौर के बाद एकत्र अनबाउंड फेज लेने के लिए और इन फगेस उपयोग मीका पर ए एल एस तेदेपा-43 प्रतिजन के खिलाफ सकारात्मक पॅनिंग (3.3 और 3.4 में ऊपर वर्णित के रूप में ए एल एस तेदेपा-43 मीका तैयार) के एक और दौर।
  8. इस तीसरे ए एल एस मीका के साथ 3.3 के सभी चरणों को दोहराएँ और 37 डिग्री सेल्सियस से कम तीन LBA प्लेटें हे / एन पर संक्रमित TG1 कोशिकाओं थाली। अगले दिन संभावित ए एल एस क्लोन के साथ 6 LBA प्लेटों पर कालोनियों की संख्या गिनती। सकारात्मक पैनिंग के दो दौर के बाद तीन LBA प्लेटों की तुलना में सकारात्मक पैनिंग के तीसरे दौर के बाद संभावित ए एल एस क्लोन के साथ तीन LBA प्लेटों पर कम कालोनियों होना चाहिए।

4. संवर्धन और फेज उत्पादए एल एस के खिलाफ संभावित सकारात्मक क्लोन के आयन विशिष्ट तेदेपा-43

  1. 37 डिग्री सीओ / एन में एक प्रकार के बरतन पर 1% ग्लूकोज के साथ 2xYT के 100 μl और एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से युक्त 96 अच्छी तरह से प्लेट में 6 प्लेटों से प्रत्येक कॉलोनी के लिए आगे बढ़ें।
  2. अगले दिन स्थानांतरण 1% ग्लूकोज के साथ 2xYT के 1 मिलीलीटर और एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / युक्त microcentrifuge ट्यूब के लिए ए एल एस तेदेपा-43 प्रोटीन के साथ सकारात्मक पैनिंग के तीसरे दौर के बाद तीन LBA प्लेटों से क्लोन युक्त कुओं से 10 μl ।
  3. 15% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में सभी संस्कृतियों को ग्लिसरॉल जोड़ें और -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों फ्रीज। 1 मिलीलीटर संस्कृतियों 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए 2-3 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
  4. KM13 सहायक फेज की 10 9 जोड़ें और सहायक फेज झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए संक्रमित करने के लिए अनुमति देते हैं। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए कोशिकाओं 3000 XG पर, 100 माइक्रोग्राम प्रति / एम्पीसिलीन की मिलीलीटर और Kanam के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.1% ग्लूकोज के साथ 2xYT के 1 मिलीलीटर जोड़नेycin।
  5. संस्कृति झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन। अपकेंद्रित्र ट्यूब 30 मिनट के लिए 3300 XG पर, नया microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और प्रत्येक ट्यूब / खूंटी NaCl μl 250 जोड़ें।
  6. 1 घंटे के लिए बर्फ पर ट्यूबों सेते हैं। 30 मिनट के लिए 3300 XG पर फिर ट्यूबों अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्रत्येक ट्यूब पीबीएस के 100 μl जोड़ें।
  7. 1 घंटे के लिए बर्फ पर ट्यूबों सेते हैं। 11,600 XG पर 10 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन और नए ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। -80 डिग्री सेल्सियस पर फगेस स्टोर।

संभावित ए एल एस क्लोन 5. अनुक्रमण

  1. दोहराएँ कदम 4.2 और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ने की संस्कृतियों के लिए अनुमति देते हैं। अगले दिन निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्लोन के डीएनए प्लाज्मिड preps बाहर ले जाने के लिए। आगे उपयुक्त का उपयोग कर क्लोन अनुक्रम और प्राइमरों रिवर्स।

ए एल एस विशिष्ट तेदेपा-43 का उपयोग करते हुए अप्रत्यक्ष एलिसा के खिलाफ संभावित सकारात्मक क्लोन स्क्रीनिंग 6.

  1. प्रत्येक संभावित ए एल एस क्लोन के लिए एक उच्च बाध्यकारी एलिसा थाली के कुओं के लिए ए एल एस, FTD और स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों का 2.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के 100 μl जोड़ें। धीमी झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  2. प्लेटों 0.1% PBST के साथ तीन बार धोएं। अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस में 2% दूध पाउडर के 200 μl जोड़ें और धीमी झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  3. धोने कदम दोहराएँ और फिर वेल्स को पीबीएस में कम से कम 1/100 पतला प्रत्येक फेज के 100 μl जोड़ें। और ऊष्मायन के बाद, कदम धोने के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1/1000-विरोधी M13 एचआरपी के 100 μl जोड़ें। प्लेटें धो लें और एलिसा Femto chemiluminescence सब्सट्रेट किट का उपयोग कल्पना।

7. scFv उत्पादन और अप्रत्यक्ष एलिसा का प्रयोग स्क्रीनिंग

  1. 0.4 के 600 आयुध डिपो के लिए एचबी 2151 कोशिकाओं को विकसित। एचबी 2151 कोशिकाओं के 20 μl के लिए अलग अलग फगेस के 5 μl जोड़ें। 30 मिनट फगेस मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस को संक्रमित करने की अनुमति दें। ग्रिड में LBA प्लेटें फूट डालो ताकिकि लगभग 20 क्लोन प्रत्येक पर चढ़ाया जा सकता है।
  2. थाली करने के लिए प्रत्येक फेज संक्रमित जीवाणुओं की 5-10 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। अगले दिन एक 0.1% ग्लूकोज के साथ 2xYT की मिलीलीटर और 100 को एम्पीसिलीन की माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / व्यक्तिगत कालोनियों को जोड़ने और 600 आयुध डिपो 0.6 है जब तक 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला।
  3. प्रत्येक ट्यूब 1 एम isopropylthiogalactoside (IPTG) की एक μl जोड़ें और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। 10 मिनट के लिए 11,600 XG पर ट्यूब स्पिन और एलिसा परीक्षण के लिए सतह पर तैरनेवाला फसल।
  4. एलिसा परीक्षण के लिए undiluted scFv जोड़ने के सिवाय बजाय फेज का 6.5, धारा 6 में एक ही प्रक्रियाओं का पालन करें और 6.6 के लिए 1/1000 9e10 एचआरपी के 100 μl जोड़ें।

8. AFM के प्रोसेस

  1. Cleaved अभ्रक के लिए लक्ष्य प्रतिजन के 10-20 μl जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए सेते हैं। पानी के साथ मीका 5 बार धोएं। मीका को फगेस के 10-20 μl जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. 5 बार फिर वाई मीका धोएंवें पानी और शुष्क हवा के लिए मीका अनुमति देते हैं। AFM के एक का उपयोग कर बाध्यकारी फेज कल्पना। आर टी 29 में हवा में एक NanoScope IIIa नियंत्रक के साथ AFM के दोहन मोड का उपयोग AFM इमेजिंग प्रक्रिया निष्पादित करें। सिलिकॉन AFM जांच 300 kHz के एक गुंजयमान आवृत्ति और 40 एन / मी के वसंत निरंतर है। 3.05 हर्ट्ज की एक दर स्कैन और 512 नमूने / रेखा के स्कैन संकल्प का प्रयोग करें।
  3. सभी कण आकार के प्रत्येक छवि के भीतर तुलना कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए पृष्ठभूमि के बुनियादी सपाट द्वारा छवियों प्रक्रिया। फेज चौड़ाई (नहीं लंबाई) छवि के लिए छवि से होने के कारण अन्य कण आकार और स्कैनिंग क्षेत्र के लिए अलग-अलग हो सकता है, लेकिन यह क्या है या नहीं फेज की सटीकता प्रतिजन को बांधता समझौता कभी नहीं होगा।
  4. नकारात्मक पॅनिंग फगेस के प्रत्येक सेट के लिए AFM के सत्यापन के दौरान मीका पर दिखाई दे रहे हैं, तो कोई फगेस नकारात्मक पैनिंग के अगले सेट करने के लिए आगे बढ़ने से पहले पता चला रहे हैं जब तक, इसके अलावा राउंड प्रदर्शन करते हैं।

लक्ष्य प्रतिजन 9. immunoprecipitation

  1. ISOLAT करने के लिएई लक्ष्य प्रतिजन (तेदेपा-43), (मोटर कॉर्टेक्स से) homogenize मस्तिष्क के ऊतकों, विरोधी तेदेपा 43 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी और 1x स्टेन की 1/100 कमजोर पड़ने के 100 μl एक Eppendorf 700 μl कुल मात्रा के लिए बफर के 250 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ने ट्यूब 28।
  2. एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। 1x स्टेन के साथ धोने ए / जी agarose मोती 2-3 बार बफर और ऊतक मिश्रण करने के लिए 25 मिलीलीटर जोड़ें। एक रोटेटर पर 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर एक मिनट के लिए 2,000-4,000 rpm पर अपकेंद्रित्र।
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1x स्टेन बफर और पीबीएस के साथ 5 बार के साथ एक बार गोली धोने। गोली 1x स्टेन बफर के 40-60 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए उबाल लें। नमूने के बाद शांत, सेंट्रीफ्यूज हैं और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। Immunoprecipitation प्रक्रिया 30 की सफलता को सत्यापित करने के लिए एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता का प्रयोग करें।

10 डॉट धब्बा विश्लेषण

  1. परीक्षण किया जाएगा कि प्रत्येक क्लोन के लिए छोटे आयतों में nitrocellulose कागज काटें। ए एल एस, एफ डॉट 2 μlटीडी और nitrocellulose कागज पर्यत स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों और यह पूरी तरह से सूखे।
  2. पीबीएस में 5% दूध पाउडर के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें और यह आरटी पर 1 घंटे के लिए मिलाते हैं। प्रत्येक फेज के 1/100 कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन मिलाते हैं। 0.5% PBST के साथ 10 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली तीन बार धोएं।
  3. विरोधी M13 एचआरपी के 1/1000 कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें और यह आरटी पर 1 घंटे के लिए मिलाते हैं। दोहराएँ धोने की प्रक्रिया और पश्चिमी chemiluminescence समाधान का उपयोग कल्पना।

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Representative Results

चित्रा 1 में, योजनाबद्ध हम immunotubes का उपयोग हमारे पुस्तकालय से बंद लक्ष्य एंटीजन बाध्यकारी फेज हटा दिया है जिसके द्वारा नकारात्मक पॅनिंग प्रक्रिया को दर्शाता है। यह एक आम अवरुद्ध एजेंट और भविष्य immunoassays में समस्याग्रस्त किया जाएगा इस लक्ष्य के साथ nonspecifically प्रतिक्रिया होगी कि किसी भी फेज है के बाद से हम शुरू में बीएसए के साथ शुरू कर दिया। अगला, हम एकत्रित प्रोटीन (यानी, एकत्रित अल्फा synuclein को पार प्रतिक्रियाशील हो जाएगा कि एक एंटीबॉडी, तेदेपा-43, abeta, आदि) के जेनेरिक संरचनाओं के साथ प्रतिक्रियाशील रहे हैं कि फेज खत्म करने के लिए एकत्रित अल्फा synuclein को बाँधने हटा दिया। AFM के परिणामों फेज एकत्रित अल्फा synuclein के खिलाफ नकारात्मक panning के एक दौर (2A चित्रा) के बाद से बाध्यकारी और कोई आठ राउंड (चित्रा 2 बी) के बाद बाध्यकारी दिखाया। हम तो नकारात्मक स्वस्थ मानव मस्तिष्क homogenate में मौजूद कई एंटीजन बाध्यकारी फेज दूर करने के लिए स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों के खिलाफ panned। चित्रा -2 (चित्रा 2 डी) के 10 दौर के बाद बाध्यकारी छोड़ दिया है। Panning के लिए उपलब्ध स्वस्थ और FTD immunoprecipitated तेदेपा-43 प्रोटीन की मात्रा के बाद से immunotubes कम मात्रा का उपयोग किया है और इसलिए कुल प्रोटीन का सेवन (चित्रा 3) उतारा बजाय अभ्रक का उपयोग करते हुए, कम था। स्वस्थ immunoprecipitated तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक panning के आठ राउंड के बाद, फेज विभाजित किया गया था। आधा फेज FTD तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के दो दौर में खर्च किया गया था। उद्देश्य किसी भी संभावित ए एल एस तेदेपा-43 विशिष्ट क्लोन बनाए रखते हुए, (कारण FTD में तेदेपा-43 की भागीदारी के लिए) किसी भी FTD तेदेपा-43 प्रतिक्रियाशील क्लोन को खत्म करने के लिए किया गया था।

सकारात्मक panning के भाग (चित्रा 4) के लिए, हम भी सामग्री का उपयोग कम से कम करने के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में अभ्रक कार्यरत हैं। हम तेदेपा-43 के लिए किसी भी प्राप्त करने के लिए ए एल एस के खिलाफ FTD तेदेपा-43 नकारात्मक panning के बाद अनबाउंड फेज का इस्तेमाल कियाए एल एस विशिष्ट क्लोन। हम भी सकारात्मक हम FTD तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक पॅनिंग से अनबाउंड फेज उपयोग करने के बाद क्लोन प्राप्त नहीं किया है कि घटना में तेदेपा-43 में दो बार ए एल एस के खिलाफ panned। पूरे पॅनिंग प्रक्रिया के बाद, हमारे तीन क्षालन तरीकों (FTD TDP- से अनबाउंड फेज का उपयोग और 45 संभावित ए एल एस विशिष्ट क्लोन (ए एल एस और FTD के लिए प्रतिक्रियाशील हो सकता है कि क्लोन) ए एल एस तेदेपा-43 के खिलाफ दो सकारात्मक पॅनिंग से 154 क्लोन झुकेंगे 43 नकारात्मक पॅनिंग)।

आगे 45 संभावित ए एल एस विशिष्ट क्लोन को कम करने के लिए, क्लोन अनुक्रम कर रहे हैं और किसी भी रोक codons बिना ही क्लोन दो बार दिखाया जो एक क्लोन के लिए छोड़कर आगे विचार किया गया। यह 23 संभावित ए एल एस विशिष्ट क्लोन के साथ हमें छोड़ दिया है। इन क्लोन के साथ दोनों फेज और घुलनशील scFv तैयार करने के बाद, वे ए एल एस के ऊतकों को विशिष्टता के लिए अप्रत्यक्ष ELISAs में जांच की जाती है। लगभग फगेस के सभी स्वस्थ ऊतकों (चित्रा 5) से अधिक ए एल एस ऊतक के लिए एक प्राथमिकता दिखाया। इसी तरह के परिणाम OBT हैंained FTD के ऊतकों को ए एल एस के लिए बाध्य फेज (चित्रा 6) की तुलना करते समय। भविष्य के अध्ययन के लिए यह इन क्लोन कार्यात्मक scFvs की उच्च पैदावार व्यक्त कि आवश्यक है, इसलिए हम अलग scFvs के छोटे समूहों का उत्पादन किया और इसी तरह के अप्रत्यक्ष ELISAs बाहर किया। ScFv स्वस्थ (चित्रा 7) और FTD ऊतक (चित्रा 8) दोनों को ए एल एस ऊतक के लिए बाध्य करने की तुलना फिर लगभग सभी क्लोन में ए एल एस ऊतक के लिए बाध्य चयनात्मक दिखाया।

हम आगे ए एल एस ऊतक के लिए बाध्य सत्यापित करने के लिए और भी अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुप्रयोगों में प्रतिक्रियाशील हैं जो क्लोन का पता लगाने के लिए एक और Immunoassay (डॉट दाग) का इस्तेमाल किया। ए एल एस ऊतक के लिए बाध्य क्लोन 2A चित्रा (9) दिखाया गया है। इन क्लोन के सभी फेज और scFv ELISAs की या तो या दोनों में आशाजनक परिणाम दिखाया। इन परिणामों के हमारे AFM के आधार biopanning प्रक्रिया चुनिंदा रोग विशिष्ट प्रोटीन vari कि बाँध अभिकर्मकों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है कि इस बात की पुष्टिसीधे जटिल स्रोतों से चींटियों।

चित्र 1
Immunotubes उपयोग चित्रा 1. नकारात्मक Biopanning प्रक्रिया। योजनाबद्ध नकारात्मक biopanning प्रक्रिया का प्रदर्शन है। ऐसे बीएसए, एकत्रित अल्फा synuclein और immunotubes का उपयोग कर हटा रहे हैं स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों के रूप में प्रोटीन के लिए प्रतिक्रियाशील रहे हैं कि फगेस। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. नकारात्मक Panning परिणाम की पुष्टि। AFM इमेजिंग सभी प्रतिक्रियाशील फगेस हटा रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न ठिकानों के खिलाफ नकारात्मक panning के चरणों की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ हम प्रदर्शन AFM के परिणामों में से कुछ दिखानेपहले और नकारात्मक panning के बाद बाध्यकारी फेज के स्तर पर। (ए) के फेज नकारात्मक पैनिंग के पहले दौर के बाद एकत्रित अल्फा synuclein कणों को पाया जा सकता है बाध्यकारी है, लेकिन (ख) कोई फेज नकारात्मक panning के आठ दौर के बाद दिखाई दे रहे हैं। (सी ) बाध्यकारी स्वस्थ ऊतकों फेज के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के पहले दौर से स्पष्ट है, लेकिन (डी) कोई बाध्यकारी नकारात्मक पैनिंग के 10 दौर के बाद पता चला है के बाद। सभी छवियों 5 माइक्रोन हैं। AFM छवियों पर बड़े सफेद संरचनाओं आमतौर पर फेज उत्पादन के दौरान खूंटी वर्षा कदम से buffers या अवशिष्ट खूंटी में मौजूद लवण की वजह से कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नकारात्मक Biopannप्रक्रिया मीका का उपयोग आईएनजी। मीका का उपयोग कर योजनाबद्ध प्रदर्शन अतिरिक्त नकारात्मक biopanning। कारण सीमित नमूना अभ्रक सतह पहली स्वस्थ करने के लिए बाँधने को समाप्त करने के लिए कार्यरत है और फिर FTD तेदेपा-43 immunoprecipitated। FTD तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के दो दौर के लिए आगे बढ़ने से पहले, फेज (सकारात्मक panning के चरण के दौरान ए एल एस तेदेपा-43 अनन्य फगेस की असफल अलगाव की स्थिति में) आधे में विभाजित है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

चित्रा 4
चित्रा 4. ए एल एस सकारात्मक Biopanning प्रक्रिया। योजनाबद्ध ए एल एस सकारात्मक biopanning प्रक्रिया का प्रदर्शन है। FTD तेदेपा-43 के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद अनबाउंड फगेस तेदेपा-43 elute करने के लिए ए एल एस के खिलाफ सकारात्मक पैनिंग के एक दौर में उपयोग किया जाता है और अधिक ए एल एसतेदेपा-43 विशिष्ट क्लोन। इसके अलावा, ए एल एस तेदेपा-43 के खिलाफ सकारात्मक पैनिंग के दो दौर मीका सतह और स्वस्थ इन फगेस स्वस्थ तेदेपा-43 बाँध नहीं करना चाहिए, क्योंकि तेदेपा-43 (बन्धे फगेस, eluted हैं immunoprecipitated हालांकि कुछ के खिलाफ नकारात्मक panning के बाद अनबाउंड फगेस का उपयोग कर बाहर किया जाता है ए एल एस और FTD) दोनों के साथ पार प्रतिक्रियाशील हो सकता है। तीन क्षालन विधियों सभी बाउंड फगेस हटा रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए (ट्रिप्सिन, चाय और TG1 कोशिकाओं) का इस्तेमाल किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Homogenized मानव ए एल एस, FTD और हम अलग क्लोन से उत्पादित फेज का उपयोग कर अप्रत्यक्ष एलिसा प्रदर्शन किया स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों (हिंदुस्तान टाइम्स) नमूने का उपयोग संभावित ए एल एस क्लोन (एच टी बनाम ए एल एस)। चित्रा 5. फेज एलिसा स्क्रीनिंग। परिणाम प्रतिनिधित्व कर रहे हैं स्वस्थ ऊतकों के नमूनों के अनुपात के रूप में। परिणाम कुछ क्लोन ए एल एस रोगियों और स्वस्थ में उन लोगों में पाया तेदेपा-43 के बीच अंतर दिखाया। ए एल एस, FTD और हिंदुस्तान टाइम्स के ऊतकों तीन व्यक्तियों से मस्तिष्क के नमूने (मोटर कोर्टेक्स) का मिश्रण कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 संभावित ए एल एस क्लोन के फेज एलिसा स्क्रीनिंग (FTD बनाम ए एल एस)। यहाँ हम FTD रोगियों बनाम ए एल एस के फेज एलिसा परिणाम दिखाते हैं। क्लोन के अधिकांश FTD से अधिक ए एल एस के लिए एक प्राथमिकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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संभावित ए एल एस क्लोन (एच टी बनाम ए एल एस) चित्रा 7. scFv एलिसा स्क्रीनिंग। हम तेदेपा-43 स्वस्थ खत्म ALS रोगियों से लिए एक प्राथमिकता है कि क्लोन निरीक्षण कर सकते हैं प्रत्येक क्लोन से उत्पादित scFvs का उपयोग करना। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा संस्करण देखने के लिए इस आंकड़े की।

आंकड़ा 8
संभावित ए एल एस क्लोन के 8 चित्रा scFv एलिसा स्क्रीनिंग (FTD बनाम ए एल एस) अप्रत्यक्ष ELISAs में अलग scFvs के लिए FTD के लिए ए एल एस की तुलना करते। हमारे पॅनिंग प्रक्रिया की सफलता के आगे प्रदर्शन किया है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तरीके "> 9 चित्रा
चित्रा संभावित ए एल एस क्लोन 9. डॉट धब्बा विश्लेषण। के बजाय एलिसा के डॉट धब्बा का प्रयोग FTD या हिंदुस्तान टाइम्स से अधिक ए एल एस के लिए क्लोन की विशिष्टता को दिखाने के लिए एक और तकनीक है। क्लोन 2A दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Acknowledgments

इस शोध एनआईएच से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: R21AG042066। हम स्क्रीन पर कब्जा वीडियो बनाने में उनके योगदान के लिए फिलिप स्चुल्ज़ को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tomlinson I and J Libraries MRC (Cambridge, England)
Sheets Library MRC (Cambridge, England)
2xYT BD Sciences 244020
Glucose Amresco 0188-2.5KG
Ampicillin Amresco 0339-25G Irritant
KM13 Helper Phage MRC (Cambridge, England)
Kanamycin OmniPur 5880 Irritant
Polyethylene Glycol 8000 OmniPur 6510 Irritant
Sodium Chloride Macron 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Amresco 0404-1KG Irritant
Potassium Chloride EMD PX1405-1 Irritant
Potassium Phosphate Monobasic Amresco 0781-500G Irritant
TG1 Cells MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar EMD 1.10283.0500
Bovine Serum Albumin Amresco 0332-100G
STEN buffer Crystalgen Inc. 33429775
Immunotubes Thermo Scientific 470319
Mica Spruce Pine Mica 24365
Tween 20 EMD
Trypsin Sigma T-0303 Irritant
Triethylamine Sigma T-0886 Flammable
Glycerol Amresco 0854-1L Irritant
DNA Plasmid Prep Kit qiagen 27106 Irritant
Non-Fat Milk Powder Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate Costar 3590
Anti-M13 HRP GE Healthcare Life Sciences 27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit Thermo Scientific 37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody ProteinTech 10782-2-AP
A/G Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
HB 2151 Cells MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside Teknova 13325
9e10 HRP Santa Cruz Biotechnology sc-40
Nitrocellulose Membrane Biorad 162-0115 Flammable
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope Veeco
AFM Probes VistaProbes T300R-10

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 96 Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस तेदेपा-43 Biopanning परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी scFv neurodegenerative रोगों
Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस में तेदेपा-43 वेरिएंट के खिलाफ आकृति विज्ञान विशिष्ट अभिकर्मकों के अलगाव के लिए उपन्यास परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के आधार Biopanning
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Williams, S. M., Venkataraman, L., Tian, H., Khan, G., Harris, B. T., Sierks, M. R. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (96), e52584, doi:10.3791/52584 (2015).

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