Abstract
Debido variantes de proteínas juegan un papel crítico en muchas enfermedades incluyendo TDP-43 en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la alfa-sinucleína en la enfermedad y el beta-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, es de vital importancia para el desarrollo de reactivos específicos morfología que pueden dirigirse selectivamente Parkinson estas proteínas específica de la enfermedad variantes para estudiar el papel de estas variantes en la patología de la enfermedad y para posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Hemos desarrollado nuevos microscopía de fuerza atómica (AFM) técnicas biopanning base que permiten el aislamiento de los reactivos que reconocen selectivamente variantes de proteínas específicas de la enfermedad. Hay dos fases clave implicados en el proceso, las fases de panning negativos y positivos. Durante la fase de panning negativo, los fagos que son reactivos a los antígenos fuera de objetivo se eliminan a través de múltiples rondas de cribado sustractiva utilizando una serie de antígenos cuidadosamente seleccionados fuera de objetivo. Una característica clave de la negativafase de la panorámica es la utilización de imágenes de AFM para vigilar el proceso y confirmar que se eliminan todas las partículas de fago no deseados. Para la fase de panning positivo, el antígeno diana de interés se fija sobre una superficie de mica y fagos unidos se eluyen y se tamiza para identificar los fagos que se unen selectivamente al antígeno diana. La variante de proteína diana no necesita ser purificado proporcionando los controles negativos apropiados de panning se han utilizado. Incluso objetivo variantes de proteínas que sólo están presentes en concentraciones muy bajas en el material biológico complejo se puede utilizar en la etapa de panning positivo. A través de la aplicación de esta tecnología, hemos adquirido anticuerpos contra proteínas variantes de TDP-43 que se encuentran de forma selectiva en el tejido cerebral ALS humana. Esperamos que este protocolo debe ser aplicable a la generación de reactivos que se unen selectivamente variantes de proteínas presentes en una amplia variedad de diferentes procesos biológicos y enfermedades.
Introduction
La presencia de variantes de la proteína ha sido implicado como un factor en la progresión de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, Parkinson, ALS y la demencia frontotemporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de las proteínas beta-amiloide y la alfa-sinucleína se cree que son las especies tóxicas responsables de la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de la TAR DNA-proteína de unión 43 (TDP-43) se han relacionado con ALS y FTD 12,13,14. Por lo tanto los reactivos como los anticuerpos que se dirigen selectivamente las diferentes variantes de la proteína pueden ser herramientas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico y terapéuticos potenciales. En este estudio, se centró en el desarrollo de reactivos que se unen selectivamente variantes de la proteína TDP-43 implicados en la ELA, sin embargo, la técnica descrita en este documento debe ser aplicable al aislamiento de los reactivos frente a una amplia gama de protein variantes.
La agregación citoplásmica de TDP-43 ha sido identificada como una característica patológica en la ELA 15,16,17,18,19. Típicamente TDP-43 se encuentra en el núcleo de todas las células de un individuo normal, aunque tiende a desplazarse entre el citosol y el núcleo 15,17. Formas Sin embargo, en ALS agregados de TDP-43 se detectan en el citoplasma de neuronas y glia seleccione con concentraciones más bajas se encuentran en el núcleo lo que sugiere el movimiento de TDP-43 desde el núcleo hasta el citoplasma durante la progresión de la enfermedad 16,20. Mientras la agregación de TDP-43 se encuentra en la mayoría de los casos de ELA, que no tiene en cuenta todos los casos desde el 1% -2% de los casos de ELA total (o 15% -20% de los casos de ELA familiar) están vinculados a mutaciones en el superóxido dismutasa 1 (SOD1) 15,17 gen. Debido a la importancia del papel de TDP-43 en la gran mayoría de los casos de ELA, aquí nos centramos en el desarrollo de reactivos de anticuerpos basados que pueden unirse selectivamente a TDP-43 variantes que sonpresente en el tejido cerebral ALS humana utilizando nuestras técnicas biopanning basado novela AFM.
Inicialmente tenemos un repertorio diverso de los dominios de unión a anticuerpos. Se combinaron los tres (scFv) bibliotecas de fragmentos diferentes de presentación de fagos de cadena único dominio variable de anticuerpo, (Tomlinson I y J y Hojas de bibliotecas 21). El proceso de toma panorámica se divide en fases de panorama negativo y positivo. Los fagos de las bibliotecas son primero sometidos al proceso de panning negativo durante el cual los fagos reactivo a múltiples antígenos están excluidos desviado. Después de la finalización de cada ronda de selección negativa contra cada antígeno fuera del objetivo, el proceso se controla por imágenes de AFM para asegurar que toda fago de unión a los antígenos fuera de objetivo se han eliminado. Sólo después de verificar por AFM de imágenes que se eliminan todos los fagos reactivos Qué podemos hacer para el próximo objetivo. Para aislar reactivos contra TDP-43 variantes implicadas en la ELA hemos utilizado los siguientes antígenos paneo negativos: 1) BSA para eliminar los fagos que se unen débilmente o no específicamente a las proteínas; 2) agregada alfa-sinucleína para eliminar los fagos que se unen a elementos estructurales genéricas de agregados de proteínas; 3) homogeneizados de tejido cerebral humano para eliminar los fagos que se unen a cualquiera de las proteínas u otros componentes presentes en las muestras post-mortem del tejido cerebral humano sano; 4) inmunoprecipitada TDP-43 a partir de cerebro humano sano para eliminar los fagos que se unen a todos TDP-43 formularios relacionados con el cerebro humano sano; y 5) inmunoprecipita TDP-43 aislada de homogeneizados de cerebro FTD para eliminar los fagos que se unen TDP-43 variantes asociadas con la no-ELA patología. Después de la eliminación de todos fago reactivo a todos los antígenos fuera de objetivo, se procedió entonces a la fase de panning positivo durante el cual se aíslan fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de interés, en este caso TDP-43 inmunoprecipitada a partir de tejido cerebral ALS humana. Estos anticuerpos aislados pueden ser reactivos a las formas de TDP-43 agregados o modificados.
"> Biopanning fago convencional se centra principalmente en la fase de panning positivo 22,23. Por lo general, la diana de interés se inmoviliza, la biblioteca de fagos añadió y los fagos unidos se eluyó. Los fagos se amplifican y se añade a la meta de nuevo. Este proceso de amplificación y la incubación por lo general se repite varias veces para aumentar el porcentaje de fagos de unión positiva. Si bien las variaciones de este proceso se han utilizado ampliamente para aislar reactivos de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos diana, por lo general requiere grandes cantidades de antígeno diana purificada 24,25,26, 27, mientras que nuestro proceso sólo requiere pequeñas cantidades de antígeno diana. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para aislar reactivos que se unen selectivamente a antígenos diana que están presentes en concentraciones muy bajas, sin la necesidad de purificación y la panoramización se pueden realizar directamente contra antígeno presente en muestras de tejidos complejos. El uso de protocolos de panning negativos exhaustivos que se han verificadopor AFM asegura que los clones aislados contra el antígeno positivo deben unirse selectivamente el objetivo incluso cuando no purificada o enriquecida.Kasturirangan y colaboradores (2003) han llevado a cabo un proceso biopanning negativa y positiva similar para aislar anticuerpos reactivos a oligomérica beta-amiloide mediante la concentración de nanogramos del objetivo 5. Aquí ampliar este proceso para permitir la generación de reactivos que se unen selectivamente a la proteína específica de la enfermedad variantes directamente a partir de muestras de tejidos humanos. En estudios futuros se pretende investigar más a fondo no sólo el valor de diagnóstico de los reactivos aislados aquí, sino también evaluar su relevancia terapéutica para el tratamiento de ALS.
En general, nuestra nueva tecnología basada biopanning AFM debe ser aplicable al aislamiento de cualquier variante de proteína específica de la enfermedad en cualquier material biológico sin la necesidad de purificación de proteínas o modificación, incluso cuando el antígeno diana concentrations son extremadamente bajos.
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Protocol
1. Los fagos Producción
- Realizar todos los procesos de producción de fagos y biopanning en un gabinete de bioseguridad. Producir fagos partículas de las diferentes bibliotecas (Tomlinson I y J bibliotecas y Hojas de biblioteca 21) para el proceso de biopanning utilizando las instrucciones del fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
NOTA: Nosotros usamos varias bibliotecas en nuestro proceso de exploración para aumentar la diversidad de los anticuerpos disponibles. - Brevemente, las bacterias de cultivo de las existencias de las tres bibliotecas en 200 ml de 2xYT que contiene 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C hasta que OD 600 es 0,4.
- Añadir 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de las bibliotecas Tomlinson I y J y 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 a 200 ml de la biblioteca Sheets. Incubar las muestras de la biblioteca con el fago auxiliar durante 30 min a 37 ° C sin agitación.
- Centrifugar lacultivos a 3.000 xg durante 10 min y resuspender el sedimento celular en 200 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 g / ml de kanamicina.
- Incubar las culturas O / N a 30 ° C con agitación y luego girar durante 30 minutos a 3300 xg al día siguiente.
- Añadir 50 ml de polietilenglicol (PEG) 8000 en NaCl 2,5 M a los 200 ml de sobrenadante de cada una de las bibliotecas e incubar en hielo durante 1 hr. Después de precipitación con PEG, girar las soluciones de nuevo durante 30 min a 3300 x g.
- Añadir 1-2 ml de tampón fosfato salino (PBS) al sedimento celular (dependiendo del tamaño de la pastilla) y la transferencia a tubos de microcentrífuga.
- Incubar las partículas de fago en hielo durante 1 hora a 37 ° C con mezcla ocasional antes de centrifugar durante 10 min a 11.600 x g. Recoger el sobrenadante y se almacena a -80 ° C.
- Antes de congelar, transferir un pequeño volumen de las partículas de fago a partir de las tres bibliotecas a otro tubo de microcentrífuga, y titule cada bibliotecaindividualmente utilizando células TG1 para determinar la concentración. A continuación se muestra una descripción del proceso de título para una biblioteca.
- Se cultivan las células TG1 a OD 600 de 0,4. Añadir 990 l de PBS a 6 tubos de microcentrífuga.
- Para el primer tubo de añadir 10 l de las partículas de fago. Después de mezclar, eliminar 10 l de tubo uno y añadir al tubo 2. Repita este paso para los 4 tubos restantes.
- Añadir 200 l de células TG1 con 6 tubos y añadir 10 l de cada uno de los seis diluciones de fago a estos tubos. Permita que las partículas de fago para infectar durante 30 minutos sin agitación a 37 ° C.
- Plate 100 l de las células á Luria-Bertani placas de agar con 100 g / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C y luego determinar la pfu / ml utilizando el número de colonias visibles.
2. Negativo Proceso biopanning
NOTA: Evite demasiados congelación y descongelación de los fagos en todo el proceso biopanning. Identificacióneally, lo mejor es llevar a cabo ya que muchos de los pasos de panorama negativos como sea posible en un día. Después de la finalización de las rondas de cribado negativo o positivo contra cada objetivo es importante para salvar algunos de los fagos en caso de contaminación en cualquier paso.
- 12 rondas de cribado negativo contra la albúmina de suero bovino (BSA)
- Añadir 4 ml de 1 mg ml solución / BSA en PBS a 12 inmunotubos e incubar O / N a 4 ° C.
- Combine 1 x 10 12 partículas de fago de cada una de las tres bibliotecas (dejar de lado una pequeña cantidad de esta mezcla de fagos para la futura verificación del proceso de encuadramiento negativo).
- Descartar la solución de BSA desde el primer tubo y se lava el tubo de 2-3 veces con PBS para eliminar cualquier BSA no unido.
- Añadir las bibliotecas de fagos combinados a este primer tubo, incubar durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos.
- Repita el paso 2.1.3 con la segunda inmunotubo y añadir los fagos recogidos desde el paso 2.1.4 a esta immunotube. Repita el paso 2.1.4.
- Repita los pasos 2.1.3-2.1.4 con los 10 tubos restantes de la solución de BSA y el fago no unido recogido después de cada incubación.
- Para verificar la eliminación de todas las carpetas de BSA fagos utilizar AFM. Añadir 10 l de fago de la etapa 2.1.2 y 10 l de fago restante después de la etapa 2.1.7 separado a 10 g / ml de BSA unidas a mica escindido. Una versión breve del proceso de AFM se describe en la sección 8.
- Es importante guardar una pequeña cantidad de fagos después de terminar las numerosas rondas de cribado negativo contra cada objetivo para verificar el éxito del proceso de la panorámica.
- 10 rondas de cribado negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína
NOTA: En este proyecto, queremos eliminar los fagos que podrían unirse otras formas agregadas de proteínas como la alfa-sinucleína (monómero, dímero, trímero, etc.) y lo vamos a eliminar alguno de estos fagos (el objetivo es eliminar el mayor muchos fagos de reacción cruzada como sea posible). Permita purificada alfa-sinucleína a agregarse durante al menos 7 días, así que ambas formas monómeros y oligómeros están presentes para paneo negativo.- Preparar 4 inmunotubos con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína en PBS y 4 inmunotubos con 100 mg / ml de agregados de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C.
- Descartar la solución de uno de los tubos con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína, lavar con PBS y añadir la biblioteca de fagos recogidos después de las 12 rondas de paneo negativo con BSA.
- Incubar el tubo durante 30 min a RT en el rotador y recoger los fagos no unidos.
- Repetir los pasos 2.2.3 y 2.2.4 para los tubos restantes con 500 g / ml de agregado alfa-sinucleína y después los tubos con 100 g / ml de agregado alfa-sinucleína utilizando el fago no unido recogido cada vez después de la etapa 2.2.4.
- Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 500 g / ml de alfa agregadasinucleína y el fago después de la octava ronda de selección negativa en contra de 100 g / ml de alfa-sinucleína.
- Para eliminar todas las carpetas negativos contra la alfa-sinucleína preparar dos inmunotubos extra con 500 g / ml de agregados de alfa-sinucleína y repita los pasos 2.2.2-2.2.4.
- 10 rondas de cribado negativo contra Saludable Human Brain Tissue Homogenado
- Añadir tampón 1x STEN (50 mM Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% NP-40, 0,2% de BSA, 20 mM PMSF y cóctel inhibidor de proteasa) para el tejido cerebral humano 28. Homogeneizar a 24.000 rpm durante 1 min, las muestras de centrifugación a 3000 rpm y se recoge el sobrenadante.
- Prepare 2 inmunotubos con 2 ml de 50 mg / ml de tejido cerebral humano en PBS y 8 inmunotubos con 10 mg / ml de tejido cerebral humano e incubar O / N a 4 ° C.
- Repita los pasos 2.2.3-2.2.5 primero con los tubos que contienen 50 mg / ml de tejido cerebral humano y luego con aquellos que contienen 10 mg / ml de b humanatejido lluvia usando el fago no unido recogido después el panorama negativo contra la alfa-sinucleína.
- Repita el paso 2.1.8 usando el fago después de la primera de paneo negativa en contra de 50 g / ml de tejido cerebral humano y el fago después de la décima ronda de selección negativa en contra de tejido cerebral humano.
- 8 rondas de cribado negativo contra Saludable Immunoprecipitated TDP-43
- Immunoprecipitate saludable proteína TDP-43 desde sano tejido cerebral humano utilizando el protocolo descrito en la sección 9. Debido a la menor cantidad de proteína inmunoprecipitada, llevar a cabo estas rondas de cribado negativo utilizando mica.
- Cleave ocho superficies de mica.
- Para la primera mica añadir ~ 100 l de 5 mg / ml de la proteína inmunoprecipitada y se incuba durante 5-10 min a TA.
- Lavar la mica 5 veces con 0,1% PBS con Tween 20 (PBST).
- Añadir ~ 100 l de fago después el panorama negativo contra el tejido sano del cerebro y se incuba durante 5-10 min aRT.
- A medio camino de la incubación del paso 2.4.5, realizar la etapa 2.4.3 usando el segundo mica.
- Recoger el fago del paso 2.4.5 y lavar la mica 5 veces con 0,1% PBST.
- Lave mica desde el paso 2.4.6 y añadir el fago de 2.4.7.
- Repita los pasos 2.4.4 al 2.4.9 hasta que el fago se desplaza negativamente contra los ocho mica con la proteína inmunoprecipitada. Repita el paso 2.1.7 usando el fago después de una y ocho ronda de cribado negativo.
- 2 rondas de cribado negativa contra FTD Immunoprecipitated TDP-43
- Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con FTD.
- Cleave 2 superficies de mica.
- Añadir 50 l de 10 g / ml de FTD TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA.
- Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST.
- Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable. Incubar durante 5 min.
- Recoge los fagos no unidos.
- Repeats pasos 2.5.3 a 2.5.6 con el segundo mica y el fago no unido recogida en 2.5.6.
3. Desplazamiento Positivo contra Immunoprecipitated TDP-43 de las personas con ELA
- Immunoprecipitate proteína TDP-43 de los cerebros de las personas con ELA. Cleave 3 superficies de mica. Añadir 50 l de 10 g / ml de ALS TDP-43 a uno mica. Incubar durante 5 min a TA. Lave la mica 5 veces con 0,1% PBST.
- Añadir 50 l de fago recogido después de paneo negativa en contra de TDP-43 saludable a la mica. Incubar durante 5 min.
- Recoge los fagos no unidos. También recoge los fagos unidos usando tres métodos de elución. Es importante mantener todos los fagos recogidos en estos pasos paneo independientes.
- En primer lugar, añadir 50 l de tripsina (1 mg / ml en PBS) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Recoger la solución y guardar. A continuación, añadir 50 l de trietilamina 100 mM (TEA) a cada mica e incubar durante no más de 10 min. Collect la solución, añadir un volumen igual de tampón 1 M Tris-HCl pH 7,4 y guardar.
- En tercer lugar, añadir 50 l de TG1 a una DO 600 de 0,4 directamente a la mica y se incuba durante 30 min a 37 ° C. También añadir los fagos recogidos de los dos métodos de elución en 3.3.1 a 100 l de TG1 en OD 600 de 0,4 y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
- Repita los pasos 3,1 con una segunda mica.
- Tome el fago no unido recogido en el apartado 3.3.2. utilizando la primera mica con ELA TDP-43 y agregarlo a la segunda mica con ELA TDP-43. Incubar durante 5 min.
- Repite todos los pasos de 3,3 segundos para estos conjuntos de mica.
- Combinar las células TG1 infectadas con los fagos eluidos con tripsina de las dos ALS TDP-43 y la placa de mica en placas de LBA. Repetir el mismo proceso para el té y TG1 eluyó fagos de los dos ALS TDP-43 mica para un total de tres placas.
NOTA: Debido a la participación de la TDP-43, tanto en la ELA y FTD, algunos de los clones aislados en eldos rondas de cribado positivo contra la ELA TDP-43 pueden ser específicas para este objetivo, pero algunos también pueden unirse FTD. Para aislar mejor ALS clones específicos, tomar el fago no unido recogido después de 2 rondas de cribado negativo contra FTD TDP-43 (ya que estas dos rondas de cribado negativo deberían haber eliminado cualquier objetivo que es reactivo a FTD TDP-43) y el uso de estos fagos en una ronda más de panning positiva contra la ALS TDP-43 antígeno sobre mica (ALS preparar el TDP-43 mica como se describe anteriormente en 3.3 y 3.4). - Repite todos los pasos de 3,3 con esta tercera mica ALS y la placa de las células TG1 infectadas en tres placas LBA O / N a 37 ° C. Al día siguiente, contar el número de colonias en las placas de 6 LBA con el potencial clones ALS. Debe haber un menor número de colonias en las tres placas LBA con los posibles clones ALS después de la tercera ronda de cribado positivo en comparación con las tres placas LBA después de las dos rondas de cribado positivo.
4. El cultivo y el fago Productoion de potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43
- Crecer cada colonia a partir de los 6 placas en placas de 96 pocillos que contienen 100 l de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° CO / N.
- La siguiente transferencia día 10 l de los pocillos que contienen los clones de las 3 placas de LBA después de la tercera ronda de selección positiva con la proteína ALS TDP-43 a tubos de microcentrífuga que contienen 1 ml de 2xYT con 1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina .
- Añadir glicerol a todas las culturas en las placas de 96 pocillos a una concentración final de 15% y congelar las placas a -80 ° C. Permita que las culturas 1 ml crezcan durante 2-3 horas con agitación a 37 ° C.
- Añadir 10 9 de fago auxiliar KM13 y permitir que el fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C con agitación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 3000 xg, descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa, 100 g / ml de ampicilina y 50 mg / ml de Kanamycin.
- Cultura de las células O / N a 30 ° C con agitación. Centrifugar los tubos a 3.300 xg durante 30 min, Transferir el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga y se añaden 250 l de PEG / NaCl a cada tubo.
- Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Centrifugar los tubos de nuevo en 3300 xg durante 30 min, descartar el sobrenadante y añadir 100 l de PBS a cada tubo.
- Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. Girar los tubos durante 10 min a 11.600 xg y transferir el sobrenadante a nuevos tubos. Guarde los fagos a -80 ° C.
5. La secuenciación de potenciales Clones ALS
- Repita el paso 4.2 y permite a las culturas creciendo O / N a 37 ° C con agitación. El día siguiente realizar preparaciones de plásmidos de ADN de los clones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuenciar los clones usando la apropiada adelante y atrás primers.
6. Detección potenciales clones positivos contra la ELA específico TDP-43 Uso de ELISA indirecto
- Añadir 100 l de 2,5 mg / ml de ALS, FTD y el tejido cerebral humano sano a los pocillos de una placa de ELISA de alta unión para cada clon potencial ALS. Incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta.
- Lavar las placas 3 veces con PBST 0,1%. Añadir 200 l de 2% de leche en polvo en PBS al pocillo e incubar las placas a 37 ° C durante 1 hora con agitación lenta.
- Repetir la etapa de lavado y luego añadir 100 l de cada fago diluida al menos 1/100 en PBS a los pocillos. Después de la incubación y etapas de lavado, añadir 100 l de 1 / 1.000 anti-M13 HRP a cada pocillo. Lavar las placas y visualizar utilizando el kit de sustrato de quimioluminiscencia femto ELISA.
7. Producción scFv y de detección sistemática mediante ELISA indirecto
- Crecer HB 2151 células a OD 600 de 0,4. Añadir 5 l de las diferentes fagos para 20 l de las células HB 2151. Permita que los fagos 30 min para infectar a 37 ° C sin agitación. Divida placas LBA en las redes de maneraque aproximadamente 20 clones se pueden sembrar en cada uno.
- Añadir 5-10 l de cada uno de fagos infectados bacterias en la placa e incubar O / N a 37 ° C. Al día siguiente añadir colonias individuales a 1 ml de 2xYT con 0,1% de glucosa y 100 g / ml de ampicilina y agitar a 37 ° C durante 3-4 horas hasta que OD 600 es de 0,6.
- Añadir 1 l de 1 M isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo y se incuba O / N a 30 ° C con agitación. Girar los tubos a 11.600 xg durante 10 min y cosechar el sobrenadante para la prueba de ELISA.
- Para la prueba ELISA seguir los mismos procedimientos en la sección 6, excepto que en lugar de fagos en 6,5 añadir el scFv sin diluir y el 6,6 añadir 100 l de 1/1000 9E10 HRP.
8. Proceso AFM
- Añadir 10-20 l de antígeno diana a mica escindido y se incuba durante 5-10 min. Lavar la mica 5 veces con agua. Añadir 10 a 20 l de los fagos a la mica e incubar durante 5 a 10 min.
- Lave la mica 5 veces wi nuevoª agua y deje que la mica se seque al aire. Visualizar fago de unión utilizando AFM 1. Ejecutar el proceso de formación de imágenes AFM utilizando el modo tapping AFM con un controlador Nanoscope IIIa en el aire a temperatura ambiente 29. Las sondas de AFM de silicio tienen una frecuencia de resonancia de 300 kHz y una constante de resorte de 40 N / m. Utilice una velocidad de barrido de 3,05 Hz y una resolución de escaneo de 512 muestras / línea.
- Procesar las imágenes por aplanamiento básica del fondo para asegurar que todos los tamaños de partícula son comparables dentro de cada imagen. Ancho de Fago (no la longitud) puede variar de una imagen a otra debido a otros tamaños de partículas y el área de exploración, pero nunca va a comprometer la precisión de si o no fago se une al antígeno.
- Si durante la verificación de AFM para cada conjunto de fagos de panning negativos son visibles en la mica, realizar rondas de adición hasta que no se detectan los fagos antes de proceder a la siguiente serie de panning negativo.
9. La inmunoprecipitación de Target Antígeno
- Para Isolate el antígeno diana (TDP-43), añadir 250 g de tejido homogeneizar cerebro (de corteza motora), 100 l de dilución 1/100 de la anti-TDP 43 anticuerpo policlonal y 1x STEN búfer a 700 l volumen total a un Eppendorf tubo 28.
- Incubar O / N a 4 ° C en un rotador. Lavar A / G cuentas de agarosa con el 1x STEN amortiguan 2-3 veces y añadir 25 ml de la mezcla de tejidos. Se incuba a 4 ° C durante 1,5 horas en un rotor y centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min.
- Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento una vez con tampón 1x STEN y 5 veces con PBS. Añadir 40-60 l de tampón 1x STEN al sedimento y hervir durante 5 min. Después de que las muestras son frescas, centrifuga y se recoge el sobrenadante. Utilice SDS-PAGE y transferencia Western para verificar el éxito del proceso de inmunoprecipitación 30.
10. Dot Blot Analysis
- Cortar papel de nitrocelulosa en pequeños rectángulos para cada clon que se pondrá a prueba. Dot 2 l de ALS, FTD y muestras de tejido cerebral humanos sanos hasta el papel de nitrocelulosa y deje que se seque por completo.
- Añadir 1-2 ml de 5% de leche en polvo en PBS y se deja agitar durante 1 hora a RT. Añadir 1 ml de dilución 1/100 de cada fago y se deja agitar O / N a 4 ° C. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min cada uno con 0,5% PBST.
- Añadir 1 ml de 1 / 1.000 dilución de anti-M13 HRP y se deja agitar durante 1 hora a RT. Repita el procedimiento de lavado y se visualizaron utilizando la solución de quimioluminiscencia occidental.
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Representative Results
En la Figura 1, el esquema muestra el proceso paneo negativo por el cual hemos eliminado fago de unión fuera de objetivo antígenos de nuestra biblioteca utilizando inmunotubos. Inicialmente Empezamos con BSA ya que este es un agente de bloqueo común y cualquier fagos que reaccionan de forma no específica con este objetivo sería problemático en inmunoensayos futuras. A continuación, hemos eliminado aglutinantes a agregados de alfa-sinucleína para eliminar los fagos que son reactivos con estructuras genéricas de agregados de proteínas (es decir, un anticuerpo que sería una reacción cruzada con agregados de alfa-sinucleína, TDP-43, Abeta, etc.). Resultados de AFM mostraron vinculante después de 1 ronda de selección negativa en contra de la agregada alfa-sinucleína (Figura 2A) y no vinculante después de 8 rondas (Figura 2 B) del fago. A continuación, cribamos negativamente contra el tejido del cerebro humano sano para eliminar el fago de unión a los antígenos presentes en muchos saludable homogeneizado de cerebro humano. Figura 2C (Figura 2D). Como la cantidad de saludable y FTD inmunoprecipitado TDP-43 proteína disponible para la panoramización era baja, utilizando mica en lugar de inmunotubos utilizan menos volumen y por lo tanto bajaron proteína consumida total (Figura 3). Después de 8 rondas de cribado negativo contra TDP-43 saludable inmunoprecipitado, el fago se dividió. La mitad del fago se gastó en dos rondas de cribado negativo contra FTD TDP-43. El objetivo era eliminar cualquier FTD TDP-43 clones reactivos (debido a la participación de la TDP-43 en FTD), conservando los posibles ALS TDP-43 clones específicos.
Para la parte de panning positivo (Figura 4), que también empleó mica como sustrato para minimizar el uso de material. Se utilizó el fago no unido después el panorama negativo FTD TDP-43 contra la ELA TDP-43 para adquirir cualquieraALS clones específicos. También cribamos positivamente contra la ELA TDP-43 dos veces en el caso de que no se obtuvieron clones después de usar el fago no unido de la panorámica negativa contra FTD TDP-43. Después de todo el proceso de la panorámica, nuestros tres métodos de elución produjeron 154 clones de los dos paneo positivo contra ALS TDP-43 (clones que pueden ser reactivos a la ELA y FTD) y 45 potenciales clones específicos ALS (utilizando el fago no unido de la FTD TDP- 43 paneo negativo).
Para reducir aún más los potenciales 45 clones específicos de ALS, los clones se secuenciaron y sólo los clones sin ningún codón de parada se consideraron más, a excepción de un clon que apareció dos veces. Esto nos dejó con 23 posibles clones específicos de ELA. Después de preparar tanto fagos y scFv soluble con estos clones, que se ponen a prueba en los ELISA indirectos para la especificidad de tejido ALS. Casi la totalidad de los fagos mostraron una preferencia por tejido ALS sobre el tejido sano (Figura 5). Resultados similares son obtained al comparar la unión a ALS al tejido FTD fago (Figura 6). Para los estudios futuros es esencial que estos clones expresan altos rendimientos de scFv funcionales, por lo que produce pequeños lotes de las diferentes scFv y llevó a cabo pruebas ELISA indirectos similares. Comparación de los scFv de unión al tejido ALS tanto saludable (Figura 7) y el tejido FTD (Figura 8) de nuevo mostró unión selectiva al tejido ALS en casi todos los clones.
Utilizamos otro inmunoensayo (transferencias de puntos) para comprobar la veracidad de la unión a los tejidos ALS y también para determinar qué clones son reactivos en otras aplicaciones inmunológicas. 2A Clone unión a tejido ALS se muestra (Figura 9). Todos estos clones mostraron resultados prometedores en uno o ambos de los fagos y scFv ELISA. Estos resultados confirman que nuestro proceso de biopanning basado AFM es una técnica muy poderosa que se puede utilizar para generar reactivos que se unen selectivamente a la proteína específica de la enfermedad varihormigas directamente de fuentes complejas.
Figura 1. Proceso de biopanning Negativo Utilizando inmunotubos. Esquemática que demuestra el proceso de biopanning negativo. Los fagos que son reactivos a proteínas tales como BSA, agregados de alfa-sinucleína y el tejido sano del cerebro se eliminan usando inmunotubos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Confirmación de los resultados negativos de la toma panorámica. AFM de imágenes se utiliza para vigilar los pasos de panorama negativas en contra de los diversos objetivos para garantizar que se extraen todos los fagos reactivos. Aquí te mostramos algunos de los resultados que demuestran la AFMnivel de unión antes y después de la panorámica negativo fago. (A) Fago vinculante puede ser detectada a las partículas alfa-sinucleína agregados después de la primera ronda de selección negativa, pero (B) no fago son visibles después de 8 rondas de cribado negativo. (C ) Después de la primera ronda de selección negativa en contra de fago tejido sano unión es evidente, pero se detecta (D) no vinculante después de 10 rondas de cribado negativo. Todas las imágenes son de 5 micras. Las grandes estructuras blancas en las imágenes de AFM son por lo general debido a las sales presentes en los tampones o PEG residual de la etapa de precipitación con PEG durante la producción de fagos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Negativo Biopanning Proceso Utilizando Mica. demostrando esquemática adicional biopanning negativa usando mica. Debido a limitado de la muestra se emplea superficie de mica para eliminar primero aglutinantes a sano y luego FTD inmunoprecipitó TDP-43. Antes de proceder a las dos rondas de cribado negativo contra FTD TDP-43, el fago se divide por la mitad (en caso de aislamiento sin éxito de ELA TDP-43 fagos exclusivos durante la fase de paneo positivo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4. Proceso de ALS biopanning positiva. Esquemática que demuestra el proceso de biopanning positivo ALS. Los fagos no unidos después de la panoramización negativa contra FTD TDP-43 se utilizan en una ronda de cribado positivo contra la ELA TDP-43 para eluir más ALSTDP-43 clones específicos. Además, dos rondas de cribado positivo contra la ELA TDP-43 se llevaron a cabo utilizando superficie de mica y los fagos no unidos después de panning negativa contra sana inmunoprecipitó TDP-43 (los fagos unidos se eluyen desde estos fagos no deben obligar a TDP-43 sano, sin embargo, algunos puede ser de reacción cruzada con tanto ALS y FTD). Tres métodos de elución se utilizan (tripsina, TEA y células TG1) para garantizar que se extraen todos los fagos unidos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. El fago ELISA de detección de clones potenciales con ELA (ALS frente HT). Usando humano homogeneizado de tejido cerebral sano (HT) muestras que realizamos ELISA indirecto utilizando el fago producido a partir de los diferentes clones ALS, FTD y. Los resultados se representan como la proporción de muestras de tejidos sanos. Los resultados mostraron que algunos clones distinguen entre TDP-43 encontrado en pacientes con ELA y aquellos en saludable. Los tejidos con ELA, FTD y HT son una mezcla de muestras de cerebro (corteza motora) de tres individuos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. El fago ELISA de detección de potenciales clones con ELA (ALS frente FTD). Aquí le mostramos los resultados de ELISA de fagos de ELA versus pacientes FTD. La mayoría de los clones tienen una preferencia por ALS más de FTD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 7. scFv ELISA de detección de potenciales Clones con ELA (ALS frente HT). El uso de los scFv producidos a partir de cada clon podemos observar clones que tienen una preferencia por la TDP-43 de los pacientes con ELA más saludable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 8. scFv ELISA de detección de potenciales clones con ELA (ALS frente FTD). El éxito de nuestro proceso de paneo se demuestra aún más al comparar ALS a FTD para los diferentes scFv en los ELISA indirectos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 9. Dot Blot análisis del potencial de clones con ELA. El uso de transferencia de puntos en lugar de ELISA es otra técnica para mostrar la especificidad de los clones de ALS más de FTD o HT. Clone 2A se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una subvención del NIH: R21AG042066. Nos gustaría dar las gracias a Philip Schulz por sus contribuciones en la creación de los videos de captura de pantalla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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