Abstract
Zebravis hebben een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van de ontwikkeling, regeneratie, en kanker worden. Recenter zijn allogene celtransplantatie protocollen ontwikkeld die toelaten engraftment van normale en maligne cellen in bestraalde, syngene en immuun gecompromitteerde volwassen zebravissen. Deze modellen wanneer gekoppeld met geoptimaliseerde celtransplantatie protocollen zorgen voor de snelle beoordeling van stamcellen functie herstel na letsel, en kanker. Hier presenteren we een methode voor celtransplantatie van de skeletspieren zebravis volwassen en embryonale rhabdomyosarcoom (ERMS), een pediatrische sarcoom die kenmerken deelt met embryonale spier, in immuungecompromiteerde volwassen RAG2 E450fs homozygoot mutant zebravis. Belangrijk is dat deze dieren missen T-cellen en B-celfunctie verminderde, vergemakkelijkt aanslaan van een groot aantal weefsels van niet-verwante donordieren. Ons geoptimaliseerde protocollen tonen aan dat fluorescent gelabelde spiercel preparaties van α-actine-RFP transgene zebravis engraft robuust wanneer geïmplanteerd in de dorsale spieren van RAG2 homozygote mutant vis. We tonen ook aan het aanslaan van TL-transgene ERMS waar fluorescentie wordt beperkt tot cellen op basis van differentiatie status. Concreet ERMS werden gecreëerd in AB-stam Myf5-GFP; mylpfa-mCherry dubbel transgene dieren en tumoren geïnjecteerd in het buikvlies van volwassen immuungecompromiteerde vis. De bruikbaarheid van deze protocollen uitstrekt tot innesteling van een breed scala van normale en maligne donorcellen die kan worden geïmplanteerd in dorsale musculatuur of het buikvlies van volwassen zebravissen.
Introduction
Zebravis is een uitstekend model voor regeneratieve studies omdat zij geamputeerde vinnen, evenals een beschadigde hersenen, retina, ruggenmerg, hart, skeletspier en andere weefsels 1 kan regenereren. Stamcel en regeneratieve studies bij volwassen zebravissen zijn grotendeels gericht op de karakterisering van de wedergeboorte in reactie op letsel, terwijl de identificatie van stamcellen en stamcellen uit verschillende weefsels door celtransplantatie is pas sinds kort verkend 2. Zebravis ook steeds meer gebruikt voor het bestuderen van kanker worden door het genereren van transgene kanker modellen die menselijke ziekte na te bootsen 3-10.
In de setting van kanker, hebben celtransplantatie benaderingen raken wijd goedgekeurd en toestaan dat de dynamische evaluatie van belangrijke processen kanker waaronder zelfvernieuwing 11, functionele heterogeniteit 12,13, neovascularisatie 14, proliferatie,therapie respons 15, en de invasie 16,17. Echter, zijn geënt cellen vaak uit ontvanger vis te wijten aan afweersysteem dat vallen en te doden het transplantaat 18 hosten afgewezen. Verscheidene werkwijzen zijn gebruikt om afstoting van getransplanteerde cellen overwinnen. Zo kan de ontvanger dieren immuunsysteem tijdelijk worden geablateerd door lage dosis gammastraling vóór transplantatie 18,19. Echter, zal de ontvanger immuunsysteem te herstellen door 20 dagen na de bestraling en doden donorcellen 18. Alternatief is dexamethason behandeling gebruikt om T- en B-cellen onderdrukken, waardoor meer immuunonderdrukkende conditionering en vergemakkelijken innesteling van een breed spectrum van menselijke tumoren tot 30 dagen 14. Deze experimenten vereisen constante dosering van geneesmiddelen en zijn beperkt bestuderen van vaste tumoren. Op lange termijn het aanslaan assays hebben gebruikt genetisch identieke syngeneïsche lijnen 20-22, waarbij de donor en de genieterent cellen immuun zijn afgestemd. Echter, deze modellen vereisen transgene lijnen van belang worden gekruist in de syngenetische achtergrond voor meer dan vier generaties volledig syngeen lijnen te produceren. Om kwesties van afstoting in de ontvangende vis voorkomen, heeft onze groep recent een immuungecompromiteerde RAG2 E450fs homozygoot mutant (ZFIN allel aanduiding RAG2 FB101) lijn die T- en B-cel functie hebben verminderd en die het aanslaan van een breed scala van weefsels 23 mogelijk te maken. Soortgelijke immuungecompromiteerde muismodellen zijn uitgebreid gebruikt voor celtransplantatie van muis en humane weefsels 24.
Hier presenteren we methoden voor de transplantatie van de skeletspieren en embryonale rhabdomyosarcoom (ERMS), een pediatrische sarcoom die kenmerken deelt met skeletspieren, in de nieuw beschreven RAG2 homozygote mutant zebravis. De beschikbaarheid van een immuungecompromitteerde volwassen zebravissenbreidt ons vermogen om grootschalige celtransplantatie studies uit te voeren om direct te visualiseren en stamcellen zelfvernieuwing beoordelen binnen de normale en kwaadaardige weefsels. Met deze methode, fluorescent gelabelde spiercel preparaten uit volwassen α-actine-RFP 25 transgene zebravis robuust engraft in RAG2 homozygote mutant zebravis volgende injectie in de dorsale spiermassa. Bovendien tonen we het aanslaan en uitbreiding van de primaire Myf5 GFP; mylpfa- mCherry transgene ERMS na intraperitoneale injectie in RAG2 E450fs homozygoot mutant zebravis. De bruikbaarheid van deze protocollen gaat dan de getoonde voorbeelden en kunnen gemakkelijk worden toegepast om extra zebravis regeneratieve weefsels en kanker.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Massachusetts General Hospital Subcommissie Research Animal Care, onder protocol # 2011N000127.
Afdeling 1. Skeletal Muscle Cell Transplantation in Adult RAG2 E450fs Homozygote Mutant zebravis
1. Voorbereiding van de Adult zebravis Donor skeletspiercellen
- Verkrijgen transgene volwassen zebravissen die fluorescent gelabeld hebben spier. In dit experiment, 30 α-actine-RFP donor vis 25 werden gebruikt tot 1 x 10 6 cellen per ontvangende vis transplantatie.
- Offer donor zebravis in 1,6 mg / ml tricaïne methaansulfonaat (MS222) gedurende 10 minuten of tot er geen operculum beweging is evident.
- Plaats donor vis op een absorberend keukenpapier en accijnzen de rugspier met een schone scheermesje. De snede moet worden gemaakt in de buurt van de anus bij een hoek van 45 ° om weefsel collectie (maximaliseren zoals opgemerkt in figuur 1A
- Voeg 500 ul suspensie buffer (voorgekoeld 0.9x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS)) naar het ontleed weefsel. Tot 10 donor zebravis kan samen in dit volume worden geplaatst.
- Hak het weefsel met een scheermesje> 20 totdat cellen uniforme suspensie. De gehele dorsale spieren wordt gehomogeniseerd inbegrip van de huid, botten en vinnen. Voeg 2 ml suspensie buffer. Pipetteer 5 ml, vermaal de celsuspensie ≥20 maal cellen dissociëren.
- Filter de celsuspensie door een 40 urn zeef in een 50 ml conische buis op ijs geplaatst.
- Was de petrischaal met een extra 2,5 ml suspensie buffer restmateriaal verzamelen en filtreer door dezelfde zeef en conische buis, tot een eindvolume van 5 ml (10 donor vis kan worden toegepast per isolaat).
OPMERKING: Huid, botten en vinnen worden uitgesloten na filtratie. Eventueel combineren soortgelijke suspensies in dezelfde conische buis. - Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw kleurstof en een hemocytometer.
- Boek 500 ul voor flowcytometrie desgewenst (optioneel, stap 2).
- Centrifugeer celsuspensie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Gooi supernatant en resuspendeer cellen op 3,33 x 10 5 cellen / l (0.9x PBS + 5% FBS). In totaal zal 3 pi worden geïnjecteerd per ontvanger vis voor een totaal van 1 x 10 6 cellen per ontvanger (stap 3).
OPMERKING: Minder dan 3 pi celsuspensie worden getransplanteerd in de ontvangende vis. Als het nummer van de cel is het beperken, kan zo laag als 5 x 10 4 cellen per ontvanger leiden tot succesvolle innesteling (tabel 1).
2. Flowcytometrieanalyse van Donor Skeletal Muscle Cell Voorbereiding (optioneel)
- Isoleer spier van een wildtype, niet-transgene vissen zoals geschetst in stap 1.1. Dit voorbeeld dient als negatieve controle en is nuttig voor het instellen van flowcytometrie poorten.
- Voeg een geschikte levensvatbaarheid kleurstof. Bijvoorbeeld, voeg 5 ul leverbaar DAPI oplossing (500 ng / ul) en 500 pi spiervoorbereiding. Vortex iets voorafgaand aan de analyse. Verwerven 5 x 03-1 oktober x 10 4 evenementen. Analyseer wild type controlemonsters eerste poorten gevolgd door analyse van spiercellen geïsoleerd uit transgene vis te plaatsen.
OPMERKING: Flow cytometrische analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd binnen 1 uur na spierweefsel dissectie, gedurende welke tijd de ontlede cellen behouden meer dan 60% levensvatbaarheid (figuur 2). De cellen moeten worden bewaard op ijs te allen tijde. Totaal cellevensvatbaarheid kan opnieuw worden onderzocht vóór transplantatie met trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer.
3. Intramusculaire Transplantatie van skeletspiercellen in Adult RAG2 Homozygote Mutant zebravis
- Reinig een 10 μ; L 26S G micro-spuit door in en verdrijven van 10% bleekmiddeloplossing (5 maal), gevolgd door 70% ethanol (5 maal) en daarna gevolgd door suspensie buffer (0.9x PBS + 5% FBS, 10 keer).
- Verdoven van 2-4 maanden oude homozygote RAG2 mutant vis of wild type ontvanger vis (zoals controles) door het toevoegen van enkele druppels tricaïne methaansulfonaat (MS222, 4 mg / ml stockoplossing) in een petrischaal met de vis in het systeem water totdat operculum bewegingen langzaam en vis zijn nog steeds.
OPMERKING: Dosis tricaïne anesthesie zal afhangen van de leeftijd en de grootte van de ontvanger zebravis. - Plaats verdoofd ontvanger zebravis op een vochtige papieren handdoek of spons, met de linker kant naar boven.
- Steek de naald in de latero-dorsale spieren (zie figuur 1A). Zorg ervoor dat injecties worden uitgevoerd bij een hoek van 45 °. Injecteer 3 ul van de celsuspensie (bereid in stap 1.12) per vis voor een totaal van 1 x 10 6 cellen per ontvanger.
- Breng zorgvuldig ingespoten zebravis in een schone tank met behulp van een plastic lepel om te herstellen.
- Beoordelen ontvanger zebravis voor innesteling tarieven bij 10, 20, 30 dagen na de transplantatie door beeldvorming verdoofd vis onder helder veld en epifluorescentiemicroscopie.
Afdeling 2. Embryonale Rhabdomyosarcoom (ERMS) transplantatie in Adult Homozygote RAG2 Mutant zebravis
4. DNA-micro-injectie van zebravis embryo's
- Lineariseren de RAG2-kRASG12D plasmide 7 door digestie van 10 ug DNA met XhoI, bij 37 ° C gedurende 6 uur of O / N.
- Zuiver DNA door standaard fenol: chloroform extractie en neerslaan met ethanol. Resuspendeer in 20 pl gedeioniseerd water (alternatief commerciële DNA fragment zuivering kolommen kunnen worden gebruikt).
- Voer de gedigesteerde en geknipte DNA op een 1% agarosegel en het gehalte aan DNA by spectrometer lezen. Alternatief draaien monsters 1: 1, 1: 5 en 1:10 verdunningen op een 1% agarosegel en kwantificeren in vergelijking met een DNA ladder.
- Bereid een injectie mix in een eindconcentratie van 15 ng / ul gedigereerd RAG2-kRASG12D DNA in 0,1 M KCl en 0,5 x Tris-EDTA. De uiteindelijke DNA hoeveelheid geïnjecteerd in 2 nl van de injectie volume 30 pg zijn.
OPMERKING: drie verschillende DNA-constructen kunnen efficiënt co-geïnjecteerd in maximaal 60 pg DNA per embryo. Deze transgenen worden geïntegreerd in het genoom en co-expressie in de zich ontwikkelende tumor 26. - Injecteren gelineariseerde RAG2-kRASG12D tot één-cel stadium embryo's in hoofdzaak zoals beschreven 27 in een zebravis stam van belang (figuur 1B). Injecties worden uitgevoerd in de cel en niet in de dooier met hoger rendement. In dit experiment, een dubbel transgene AB-stam; Myf5-GFP werd mylpfa-mCherry gebruikt. Raise zebravis met behulp van standaard opfok protocols 28.
OPMERKING: Injectie overleven is vaak afhankelijk van de zebravis gebruikte stam. Gemiddeld wordt 30% van de geïnjecteerde embryo's ontwikkelen ERMS. 300-600 embryo's worden geïnjecteerd per experiment zodat voldoende GFP-positieve en mCherry-positieve primaire tumoren worden gegenereerd voor transplantatie en analyse.
5. Screening voor Primaire ERMS in zebravis Larven
- Observeren geïnjecteerd zebravis van 10 tot 30 dagen na injectie voor het ontstaan van buitenaf zichtbare primaire ERMS.
- Op 30 dagen na de injectie, verdoven ontvanger zebravis door het toevoegen van enkele druppels tricaïne methaansulfonaat (MS222 4 mg / ml stockoplossing) in een petrischaal met vis systeem water totdat operculum bewegingen langzaam en vis zijn nog steeds.
OPMERKING: Dosis tricaïne anesthesie is afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de ontvanger zebravis. Primaire tumor-dragende zebravis lagere doses nodig van tricaïne. - Selecteer primaire ERMS-dragendevis die zijn Myf5-GFP-positieve en mylpfa-mCherry -positieve, met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
6. ERMS Tumor Voorbereiding
- Offeren gekozen primaire ERMS-dragende zebravis in 1,6 mg / ml tricaïne methaansulfonaat (MS222) gedurende 10 minuten of tot er geen operculum beweging is evident.
- Verwerk afzonderlijk elke tumor-dragende zebravis. Leg vis in een schone petrischaal en ontleden rond de tumor met een scheermesje en fijne pincet (zie figuur 1B). Breng de ontleed tumorweefsel een schone petrischaal.
- Voeg 100 ul van voorgekoeld 0.9x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS). Gehakt weefsel met een schone scheermesje> 20 totdat cellen uniforme suspensie.
- Voeg 900 ul van dezelfde buffer (0.9x PBS + 5% FBS), pipet op en neer meerdere malen cellen met 1000 pi gefilterde pipetpunt dissociëren. Filtreer door een 40 &# 956; m zeef in de overeenkomstige 50 ml conische buis. Slaan op het ijs.
- Was de petrischaal met een extra 2-4 ml buffer, en passeren dezelfde zeef en in de overeenkomstige conische buis.
- Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en resuspendeer in 100 ul buffer.
- Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw kleurstof en een hemocytometer.
- Verdun cellen gewenste concentratie in dezelfde buffer (0.9x PBS + 5% FBS). De cellen moeten worden verdund tot 5 x 10 3 cellen / l voor het transplanteren van 5 ul per ontvanger zebravis in een totaal van 2,5 x 10 4 cellen per ontvanger.
- Flow cytometrie analyse kan ook worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid van de suspensie van stap 6.5 de relatieve verhoudingen van fluorescerende cellen kwantiseren in het monster.
OPMERKING: opzij 100 ul celsuspensie (na filtering in stap 3.5) Instellen en verdun met 400 ulvan 0.9x PBS + 5% FBS schorsing buffer voor flowcytometrieanalyse. Om een goede gating garanderen, voert de aanvullende analyse met behulp van enkele transgene tumorweefsel of spieren geïsoleerd uit volwassen wild-type, Myf5-GFP en mylpfa-mCherry vis. Voeren flowcytometrie in hoofdzaak zoals beschreven in stap 2 van deel 1.
7. Transplantatie van ERMS in Adult RAG2 Homozygote Mutant zebravis
- Maak een 10 pl 26S G micro-spuit door in en verdrijven van 10% bleekmiddeloplossing (5 maal), gevolgd door 70% ethanol (5 maal) en daarna gevolgd door suspensie buffer (0.9x PBS + 5% FBS, 10 keer ).
- Verdoven ontvanger homozygote RAG2 mutant vis door het toevoegen van enkele druppels tricaïne methaansulfonaat (MS222 4 mg / ml stockoplossing) in een petrischaal met de vis in het systeem water tot operculum bewegingen zijn traag en vis zijn nog steeds.
- Plaats verdoofd ontvanger zebravis op een natte papieren handdoek of spoNSE, met de ventrale zijde naar boven.
- Injecteer 5 pi van de celsuspensie in de peritoneale holte (2,5 x 10 4 cellen per ontvanger).
OPMERKING: De injectienaald moet worden gereinigd tussen injecties van verschillende tumoren zoals beschreven in stap 4.1. 5-10 pl efficiënt intraperitoneaal getransplanteerd, afhankelijk ontvanger vis. Tumor engraftment kan worden bewerkstelligd door het injecteren van 1 x 04-5 oktober x 10 5 cellen per ongesorteerde ontvangende vis (tabel 1). - Plaats ontvanger zebravis voorzichtig in een schone tank met een plastic lepel.
- Beoordelen ontvanger zebravis voor innesteling tarieven bij 10, 20, 30 dagen na de transplantatie door beeldvorming verdoofd vis onder helder veld en epifluorescentiemicroscopie.
- Gebruik maken geënt vis voor downstream-toepassingen, waaronder Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) om differentiatie status (Figuur 3H), standaard histologische analy beoordelensis (Figuur 3F), beeldvorming therapie reacties 15 en / of seriële transplantatie zal inbegrip verdunningsanalyse 11 beperken.
Representative Results
Een procedure voor de voorbereiding en het transplanteren van de skeletspier cellen van α-actine-RFP transgene donoren in immuungecompromiteerde homozygote RAG2 mutant zebravis aangetoond (protocol van 1, figuur 1A en figuur 2). Spierweefsel werd bereid uit α-actine-RFP transgene donoren en de resulterende enkele celsuspensie bevatte 84.3% levensvatbare cellen zoals vastgesteld door DAPI uitsluiting volgende flowcytometrie analyse (Figuur 2B). RFP-positieve cellen omvatte 35,3% van deze enkele celsuspensie (figuur 2C). Transplantatie van cellen in de dorsale skeletspier van RAG2 homozygote mutant ontvangende vis tot consistente en sterke enting zoals beoordeeld door differentiatie van afzonderlijke cellen in meerkernige vezels (1 x 10 6 cellen geïnjecteerd per vis, Tabel 1, Figuur 2D-I). Wild typerecipiënt vissen niet spiervezels via 30 dagen experiment (n = 13) enten. Door 10 dagen na transplantatie, 9 van de 14 RAG2 homozygote mutant zebravis bevatte RFP-positieve spiervezels in de buurt van de plaats van injectie (64,3%, figuur 2E, F). Belangrijk geënt RFP-positieve spier bleef tot 30 dagen na transplantatie (figuur 2G-I), met een subset van de dieren gevolgd voor 115 dagen na enting en vertonen sterke en aanhoudende spier engraftment (gegevens niet getoond). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd door onze groep 23 met hetzelfde protocol (Tabel 1).
We hebben ook getoond een werkwijze voor de productie, bereiding en transplantatie van ERMS tumorcellen in de peritoneale holte van RAG2 homozygote mutant ontvangende vis (protocol van 2, figuur 1B en figuur 3). ERMS werden gegenereerd in double transgene Myf5-GFP, mylpfa-mCherry vis die is aangetoond dat de visualisatie van intratumorale heterogeniteit en functionele analyse van tumorcel subpopulaties na transplantatie 11 mogelijk. Een verdere moleculaire karakterisatie van elke subpopulatie is moeilijk omdat vissen klein wanneer ze ERMS tussen 10 tot 30 dagen van het leven en het aantal tumorcellen beperkend voor downstream toepassingen. Een oplossing is om tumorcel nummers uitbreiden door enten ERMS tot volwassen zebravissen ontvanger. Tot op heden zijn soortgelijke experimenten uitgevoerd op CG1-stam syngene vis en vereist dan 4 generaties terugkruising tot syngene lijnen die transgeen voor Myf5-GFP werden ontwikkeld; mylpfa-mCherry. Om deze problemen te omzeilen, hebben we laten zien het nut van immuungecompromiteerde RAG2 homozygoot mutant ontvanger zebravis om primaire ERMS engraft uit een AB-stam zebravis. Alle primaire ERMS geënt in rag2 homozygote mutante dieren vergemakkelijken uitbreiding van de tumor (tabel 1). Vergelijkbare resultaten werden onlangs gemeld, waar 24 van de 27 RAG2 homozygote mutant zebravis geënt ERMS, terwijl 0 van 7 wild type broers en zussen geënt ziekte 23. Een representatief voorbeeld van een geënt ERMS wordt getoond op 30 dagen na de transplantatie in figuur 3E. Geënt ERMS delen histologische kenmerken van embryonale rhabdomyosarcoom, vergelijkbaar met die in de primaire tumor (Figuur 3B en 3F). FACS analyse bevestigde dat ERMS bevatte functioneel verschillende tumor propageren cellen en gedifferentieerde cellen die Myf5-GFP en / of mylpfa-mCherry uiten. De overlevingspercentages na de intraperitoneale injectie procedure waren dan 95%. Ontvanger zebravis vaak bezwijken van tumorbelasting na de 30 dagen na de transplantatie tijdstip.
Figuur 1. Protocol schema voor (A) normaal (B) maligne skeletspiercel transplantatie in RAG2 homozygoot mutant zebravis. Optionele stappen zijn gemarkeerd met (*).
Figuur 2. Skeletspieren innesteling in RAG2 homozygoot mutant zebravis. (A) α-actine-RFP transgene donor zebravis. (B) Cellevensvatbaarheid van geïsoleerde spier celsuspensie zoals beoordeeld door DAPI kleurstof uitsluiting en flowcytometrie. (C) Percentage RFP-positieve cellen binnen de spiercel suspensie van α-actine-donor RFP (rood), vergeleken met een wildtype controle(Grijs). (DE) Samengevoegd helder veld en fluorescerende beelden van wild-type dieren (D) of RAG2 homozygoot mutant vis (E) op 30 dagen na de transplantatie. (F) Aanslaan tarieven in de tijd. Rood duidt aantal engrafted dieren, terwijl grijs toont niet-geënt vis. Aantal dieren op elk tijdstip geanalyseerd aangegeven. (GI) Hoge vergroting afbeeldingen boxed regio paneel E getoonde 10 (G), 20 (H) en 30 (I) dagen na transplantatie, met behoud van gedifferentieerde spiervezels tijd (pijlpunten). Schaalbalken zijn gelijk aan 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Transplantatie van Myf5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS in RAG2 homozygoot mutant . zebravis (AD) RAG2-kRASG12D geïnduceerde primaire ERMS ontstaan in AB-stam Myf5-GFP; mylpfa-mCherry zebravis op 30 dagen van het leven. (EH) RAG2 homozygoot mutant zebravis geënt met ERMS en op 30 dagen na de transplantatie geanalyseerd. (A, E) Samengevoegd helder veld en fluorescerende beelden van primaire en getransplanteerd ERMS. Tumor gebied geschetst en pijlpunt geeft injectie in E. (B, F) Hematoxylin- en eosine gekleurde paraffine secties van primaire (B) en geënte ERMS (F) waarop de gebieden van verhoogde cellulariteit geassocieerd met kanker. (C,G) Cel levensvatbaarheid zoals vastgesteld met DAPI kleurstofuitsluiting en flowcytometrie. (D, H) TL tumorcel subpopulaties, zoals beoordeeld door flowcytometrie. Schaalbalken zijn gelijk aan 2 mm (A, E) en 50 micrometer (B, F). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1. Engraftment resultaten spier- en ERMS celtransplantatie. (*) Duidt eerder gerapporteerde gegevens met dezelfde technieken 23. De gegevens worden afgedrukt met toestemming van Nature Methods. Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.
Discussion
Efficiënte en robuuste aanslaan van volwassen dorsale skeletspier werd verkregen met een zeer eenvoudige cel bereidingswijze gevolgd door injectie van cellen in de dorsale musculatuur van RAG2 homozygote mutant vis. In het algemeen intramusculaire injectie procedures waren zeer robuust, met enkele bijbehorende dood onmiddellijk na de implantatieprocedure, variërend van 10% tot 35% afhankelijk experiment. Extra optimalisatie zal waarschijnlijk toegespitst op het gebruik van kleinere naalden voor injectie en ontwikkeling stationaire injectie-inrichting met een microscoop en micromanipulator, die gemakkelijk implanteren cellen vergemakkelijkt. Onze aanpak ook gebruikt ongesorteerde spiercellen van donordieren en slechts ongeveer 30% spier voorlopercellen bevatten. Gebruik van transgene reporter lijnen die stamcellen en FACS isolatie label zal waarschijnlijk zorgen verrijkte celsuspensies die leiden tot een verhoogde innesteling in de ontvangende vis. Skeletspieren cells kan ook worden verrijkt en gekweekt voorafgaand aan transplantatie, zoals eerder beschreven 29. Opmerkelijk, onze resultaten geven ook aan dat de stappen van niche vestiging en differentiatie van donor spierweefsel optreden voordat 10 dagen na transplantatie, tot oprichting van dit model als een robuuste en snelle experimenteel platform om spieren innesteling en regeneratie beoordelen. Bovendien, deze experimenten schril contrast met die bij muizen, waarbij pre-schade spier met cardiotoxine of barium chloride vereist twee dagen voor engraftment 30,31 voltooid. Het is waarschijnlijk dat de naald schade die tijdens de transplantatie procedure potentieert enting door het stimuleren van de productie van een regeneratieve omgeving binnen het ontvangende dier 32,33. Wij voorzien dat onze werkwijze gemakkelijk kan worden aangepast aan de transplantatie van skeletspierweefsel jongere zebravis, waardoor bepaling van de genetische mutaties die vroegtijdige skeletspier ontwikkeling beïnvloedenmaar leiden tot sterfte bij de larvale stadia.
We hebben ook een gedetailleerd protocol voor het aanslaan van de zebravis ERMS door intraperitoneale injectie in niet-geconditioneerd, RAG2 homozygote mutant vis. Deze aanpak is bruikbaar voor uitbreiding van dubbele transgene primaire tumoren zonder opwekken tumoren binnen syngene transgene lijn. Onze recente werk heeft aangetoond dat celtransplantatie benaderingen roman experimentele modellen te ERMS geneesmiddelgevoeligheid beoordelen in vivo, waarbij een enkele tumor kan worden uitgebreid tot duizenden dieren en beoordeeld op effecten op de groei, zelf-vernieuwing, en neovascularisatie 15. Bovendien hebben we met succes geïmplanteerd diverse tumoren in RAG2 homozygoot mutant vis waaronder T-cel acute lymfoblastische leukemie, melanoom en ERMS 23. Op zoek naar de toekomst, we voor ogen hebben deze lijnen zal nuttig zijn voor de beoordeling van belangrijke functionele eigenschappen van kanker invivo alsmede het beoordelen intratumorale heterogeniteit, invasie, metastase, angiogenese, en therapie weerstand. Bovendien zal het genereren van RAG2 homozygote mutant vissen in de optisch heldere Casper stam zebravis 34 mogelijke directe beeldvorming van veel van deze kenmerken van kanker vergemakkelijken.
In totaal bieden we gedetailleerde protocollen voor de succesvolle innesteling van fluorescent-gelabelde normale en kwaadaardige skeletspier bij tot volwassen RAG2 homozygote mutant immuungecompromiteerde zebravis.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Alex's Lemonade Stand Foundation (DML), American Cancer Society (DML), de MGH Howard Goodman Fellowship (DML), en de Amerikaanse National Institutes of Health verleent R24OD016761 en 1R01CA154923 (DML). CNY flowcytometrie Core en Flow Image Analysis, gedeeld instrumentatie subsidie nummer 1S10RR023440-01A1. IMT wordt gefinancierd door een beurs van de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (Fundação para a Ciência e Tecnologia - FCT). QT wordt gefinancierd door de China Scholarship Council. Wij danken Angela Volorio voor haar behulpzame opmerkingen en adviezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-EDTA buffer solution 1x | Sigma-Aldrich | 93283-100ML | Microinjection. Injection mix. |
| Potassium Chloride | Fisher Science Education | S77375-1 | Microinjection. Injection mix. |
| XhoI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0146S | Microinjection. Plasmid linearization. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 (50) or 28106 (250) | Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb. |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | BP1753I-100 | Microinjection. For purification of linearized plasmid. |
| UltraPure Agarose, 500 g | Invitrogen | 16500-500 | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx | Microinjection. Linearized plasmid quantification. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | flow cytometry/FACS |
| 5 ml polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352058 | flow cytometry collection tube |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | FACS |
| 5 ml polypropylene round bottom tube | BD Falcon | 352063 | FACS collection tube |
| BD LSR II | BD Biosciences | Special Order Research Products (SORP) program | flow cytometry |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | transplantation |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-01 | transplantation |
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Western Chemical Inc. | http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html | Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin. |
| VWR Absorbent Bench Underpads | VWR | 56616-018 | Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative. |
| Singe Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | transplantation |
| Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile | VWR | 25384-302 | transplantation |
| Cell Strainer, 40 µm Nylon | Falcon-Corning Incorporated | 352340 | transplantation |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430828 | transplantation |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | transplantation |
| Hemacytometer Set | Hausser Scientific | 1483 | transplantation |
| Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) | Hamilton | 80366 | transplantation |
| Austin's A-1 Bleach, Commercial | James Austin Company | Transplantation. Any commercial solution can be used. | |
| Ethanol 190 Proof | Decon Labs, Inc. | DSP-MD.43 | Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial solution can be used. |
| High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge | Denville Scientific Inc. | C0265-24 | transplantation |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | 75004539 | Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US). |
| 5 ml serological pipets | BD Falcon | 357529 | transplantation |
| Corning Stripettor Plus Pipetting Controller | Corning Incorporated | 4090 | Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used. |
| Powder free examination gloves | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Filter pipet tips and micropipettes | All steps. Any commercial brand can be used. | ||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11205-20 | transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used. |
| Olympus DP72 microscope digital camera | Olympus | DP72 | Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used. |
References
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
- Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I.
- Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
- Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
- Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
- Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
- Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
- Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768 (2011).
- Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
- Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801 (2013).
- Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
- Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086 (2012).
- Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790 (2011).
- Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
- Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
- Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
- Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
- Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532 (2014).
- Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
- Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).
