Abstract
Biofilms zijn oppervlak bevestigd microbiële gemeenschappen die complexe structuren hebben en produceren aanzienlijke ruimtelijke heterogeniteit. Biofilm ontwikkeling wordt sterk gereguleerd door de omringende stroom en voedingswaarde milieu. Biofilm groei verhoogt ook de heterogeniteit van de lokale micro-omgeving door het genereren van complexe stroomvelden en stoftransport patronen. Om de ontwikkeling van heterogeniteit in biofilms en interacties tussen biofilms en hun lokale micro-leefgebied te onderzoeken, we groeiden mono-species biofilms van Pseudomonas aeruginosa en dual-species biofilms van P. aeruginosa en Escherichia coli onder nutritionele gradiënten in een microfluïdische stroomcel. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het creëren van voedingsstoffen gradiënten binnen de stroom cel en voor de teelt en het visualiseren van biofilm ontwikkeling onder deze omstandigheden. We ook aanwezig protocollen voor een reeks optische methoden ruimtelijke patronen kwantificeren biofilmstructuur, stromen distrimies dan biofilms, en massatransport rond en binnen de biofilm kolonies. Deze methoden ondersteunen uitgebreide onderzoeken van de co-ontwikkeling van biofilm en de habitat heterogeniteit.
Introduction
Micro-organismen hechten aan oppervlakken en vormen biofilms - celaggregaten bevindt in een extracellulaire polymere matrix 1. Biofilms gedragen zich heel anders uit individuele microbiële cellen, omdat biofilms hebben dramatische ruimtelijke heterogeniteit als gevolg van een combinatie van interne beperkingen transport van opgeloste stoffen en ruimtelijke variaties in de celstofwisseling 2,3. Zuurstof en voedingsstoffen concentraties drastisch verlagen op het raakvlak van biofilm en omringende vloeistof en krijgen verder uitgeput binnen in de biofilm 2. Ruimtelijke variaties in biofilm ademhaling en eiwitsynthese kan ook optreden als reactie op gelokaliseerde zuurstof en voedingsstoffen beschikbaarheid 2.
In aquatische en bodem omgevingen, de meeste bacteriën wonen in biofilms. Natuurlijke biofilms uit te voeren belangrijke biogeochemische processen zoals fietsen koolstof en stikstof en het verminderen van metalen 4,5. Klinisch, biofilmvorming is responsbaar voor langere pulmonale en urineweginfecties 6. Biofilm geassocieerde infecties zijn zeer problematisch, omdat de cellen in biofilms hebben een extreem hoge weerstand tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met hun planktonische tegenhangers 6. Omdat biofilms zijn belangrijk in uiteenlopende situaties, is een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht op het begrijpen van de omgevingsfactoren die biofilm activiteiten en de ruimtelijke heterogeniteit in biofilms en het omliggende micro regelen.
Eerdere studies hebben aangetoond dat biofilm ontwikkeling sterk wordt gereguleerd door een aantal omgevingsfactoren: biofilms ontwikkelen verschillende morfologie onder verschillende stromingscondities; zuurstof en beschikbaarheid van voedingsstoffen invloed biofilm morfologie; en hydrodynamische shear stress invloed op de bevestiging van planktonische cellen aan oppervlakken en het detachement van de cellen van biofilms 7-9. Verder externe stroming beïnvloedt de levering van substraten into en binnen biofilms 10. De groei van biofilms verandert ook omringende fysische en chemische omstandigheden. Bijvoorbeeld biofilm groei leidt tot lokale uitputting van zuurstof en voedingsstoffen 2; biofilms accumuleren anorganische en organische verbindingen uit de omgeving 11; en biofilm clusters af te leiden stroom en toename oppervlakte wrijving 12,13. Omdat biofilms interactie met hun omgeving in een zeer complexe manieren, is het essentieel om informatie over de biofilm eigenschappen en milieu-omstandigheden gelijktijdig te verkrijgen, en multi-disciplinaire aanpak moeten worden gebruikt om volledig te karakteriseren biofilm-omgeving interacties.
Hier presenteren we een reeks geïntegreerde methoden ruimtelijke patronen in microbiële groei in mono-soorten en dual-species biofilms karakteriseren onder een opgelegde voeding gradiënt, en de resulterende wijziging van de lokale chemische en vloeibare micro observeren. We sparst beschrijven het gebruik van een recent ontwikkelde dubbele inlaat microfluïdische stroom cel biofilmgroei observeren onder goed gedefinieerde chemische gradiënten. We demonstreren dan het gebruik van deze microfluïdische stroomcel de groei van beide soorten bacteriën, Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli, in biofilms observeren onder verschillende voedingsomstandigheden. We zien hoe in situ visualisatie van fluorescerende tracer propagatie in biofilm kolonies kunnen worden gebruikt om kwantitatief beoordelen patronen van stoftransport in biofilms. Tenslotte laten we zien hoe microschaal particle volgen velocimetry, uitgevoerd onder confocale microscopie kan worden gebruikt om locale stromingsveld verkrijgen rond de groeiende biofilms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flow Cell Setup en Enting
. OPMERKING: Gebruik een dubbel-inlaat microfluïdische stroom cel in Song et al, 2014 14 tot biofilms groeien. Deze stroom cel is in staat om goed gedefinieerde gladde chemische gradiënten creëren. De stroomcel ontwerp wordt getoond in figuur 1 en stroomcel fabricage is eerder beschreven Song et al., 2014 14. Hier detail we door gebruikmaking P. aeruginosa en E. coli biofilms te vormen, maar andere soorten kunnen ook geschikt zijn. We gebruikten P. aeruginosa PAO1- gfp, die constitutief brengt een groen fluorescerend eiwit (GFP) als modelorganisme voor biofilm ontwikkeling. Daarnaast gebruikten we E. coli DH5a naar mixed-species biofilms met P. vormen aeruginosa. P. aeruginosa en E. coli stammen werden gekweekt op LB-agarplaten.
- Bereid de stroom cel met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) gebonden aan eendekglaasje via zuurstofplasma behandeling zoals beschreven in 14. De afmetingen van de stroomcel kamer zijn 23 mm x 13 mm x 0,24 mm (lengte x breedte x diepte).
- Bereid gewijzigd FAB groeimedium 15. Om biofilmgroei observeren onder een voedingswaarde gradiënt binnen de stroom cel, introduceren gewijzigd FAB medium 15 met 0,6 uM glucose in één inlaat en FAB medium invoeren, zonder dat koolstofbron door de andere inlaat. Filter-steriliseren (poriëngrootte = 0,2 pm) van de glucose-stockoplossing (60 mM) alvorens het aan het FAB medium. Ook autoclaaf de FAB medium met cyclus 1 (vloeistof, 15 min; 121 ° C, 17 psi) voor gebruik.
- Steriliseren van de stroom systeem. Voorafgaand aan inoculatie autoclaaf de gehele stroombaan (gemiddeld flessen, buizen, bel vallen, stroom cellen) met cyclus 1, behalve de kunststof driewegkleppen (wegwerp en vooraf gesteriliseerde) stroomopwaarts van de stroomcel. (Drie manieren kleppen worden gebruikt voor het injecteren Cell Cultuur, fluorescerende tracer en microkraaltjes.) Om besmetting tijdens de montage te voorkomen, hebben betrekking op alle slangen en connector openingen met aluminiumfolie of autoclaafzakken voor het autoclaveren.
- Sluit de stroom systeem. Monteer de componenten van de stroom celsysteem voorzichtig (zie Video stroomsysteem montage) en leveren groeimedium aan de stroomcel via een peristaltische pomp die precies regelt de stroomsnelheid.
- Bereid celcultuur voor inenting door de overdracht van een kolonie van P. aeruginosa of E. coli van LB platen 3 ml LB bouillon en schud de cultuur O / N bij 225 rpm en 37 ° C. Verdun de O / N celkweken in 1 ml gesteriliseerd water tot een uiteindelijke OD600 = 0,01 in het inoculum. (Cultuur en verdun de bacteriën in een laminaire stroming kap om besmetting te voorkomen.)
- Voor de experimenten met gemengde species biofilms verdunnen twee bacterieculturen tot een verhouding van 1: 1 in 1 ml met een equivalente OD 600 = 0,01 voor elke bacterie.
- Inoculeer de stroom cel. Injecteer 1 ml van het inoculum aan de stroomcel toevoer van de driewegklep. Na de injectie onderbreken de stroom gedurende 1 uur om bacteriële cellen te hechten aan het dekglas. (Zorg ervoor dat de stroom cel wordt geplaatst met het dekglaasje kant naar beneden te laten opgeschort cellen om zich te vestigen op het dekglaasje.)
- Na 1 uur hervat de stroom en pomp het groeimedium naar de stroomcel met een constante snelheid van 0,03 ml / min voor elke inlaat voor 3 dagen.
2. Kenmerkend Biofilm ontwikkeling in reactie op Nutrient Verlopen Met behulp van confocale microscopie
OPMERKING: P. aeruginosa kan worden afgebeeld met constitutief tot expressie gebracht GFP, maar E. coli in mixed-species biofilms moet worden afgebeeld door tegenkleuring.
- Let op de 3-daagse biofilms met behulp van confocale microscopie. Voor de representatieve resultaten, observeren biofilms met een confocale microscoop met een 63x objectief. Voorafgaand aan de beeldvorming, markde dubbele inlaat stroom cel met een raster op de cover glas kant. (Het doel van dit netwerk is om de experimentator om de beeldvorming regio's te lokaliseren binnen de stroom cel kamer.)
- Om tegenkleuring, verdunnen 10 ul van cel-permeant rode fluorescerende nucleïnezuur vlek, zoals groen fluorescerend nucleïnezuur vlek zoals STYO 62, stockoplossing (1 mM) in 990 pi gesteriliseerd water en dan langzaam te injecteren de verdunde vlek met behulp van een injectiespuit in de stroomcel kamer uit de stroomopwaartse driewegklep. Houd de doorstroomcel stagnerende en in het donker gedurende 30 min, vervolgens opnieuw de stroom te spoelen ongebonden kleurstof gedurende 15 min.
- Voeren confocale beeldvorming. Activeer de 488 nm Argon laser voor excitatie en de uitstoot verzamelen kanalen voor GFP (500-535 nm) en nucleïnezuur vlek (voor groen fluorescerend nucleïnezuur vlek, 650-750 nm). Pas winsten en offsets voor beide kanalen om heldere en zuivere beelden te hebben. Selecteer xyz en gelijktijdige imaging-modus. Gebruik de z-bedieningsknop naar identify de onderkant en bovenkant van de biofilm op het veld. Stel de z-stap tot 0,5 urn voor het verkrijgen van een 3-D afbeelding stack. (Om een hoge beeldkwaliteit te garanderen, gebruikt u een lijn gemiddeld vier voor het acquisitie.)
- Om de ruimtelijke patronen van biofilm ontwikkeling binnen de stroomcel, stock biofilms kaart met drie of meer lengterichting (x) afstanden langs de stroomcel inlaat en drie dwarse (y) posities ten opzichte van de opgelegde nutritionele verloop, zoals in figuur 1 .
3. Kenmerkend Intern transport van opgeloste stoffen door injecties van Conservatieve TL Tracer
OPMERKING: Een conservatieve fluorescerende tracer, zoals Cy5, kan worden gebruikt om stoftransport patronen te detecteren binnen de biofilm.
- Los Cy5 (Mono Reactive-NHS Ester) in water tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml als een voorraadoplossing. Bewaar de Cy5- voorraad oplossing in een -20 ° C vriezer.
OPMERKING: Als Cy5- is licht-SENSITive, op te slaan, te verdunnen en injecteer Cy5 oplossingen in het donker. - Voorafgaand aan de injectie van de fluorescerende tracer, neem een 3-D afbeelding stapel van de 3-daagse biofilm met confocale microscopie (met een 63x objectief). (Wide gebieden van biofilm kolonies zijn ideaal voor tijdreeksen observaties kleurstof transport.) Kies Ook een z-vlak met goed gescheiden kolonies voor beeldvorming (zie figuur 5A).
- Voor elk Cy5 injectie experiment, verdun 2 pi van de Cy5 voorraadoplossing in 998 pi gesteriliseerd water injectievloeistof met een Cy5 concentratie van 20 ug / ml verkregen.
- Stop de pomp om de stroom onderbreken en injecteer het Cy5 oplossing in het stroomopwaartse deel van de stroomcel met een injectiespuit via de 3-wegklep. (Het is belangrijk om luchtbellen te voorkomen dat de stroombaan tijdens het injecteren. Bubble vallen moeten worden opengehouden gedurende het opnieuw injecteren.)
- Na het injecteren van de Cy5 oplossing, sluit de zeepbel vallen, passen de 3-weg klep, en start depompen naar de geïnjecteerde Cy5 oplossing in de stroomcel leveren.
- Schakel confocale imaging-modus om XYT. Activeren Cy5 en GFP-kanalen onder gelijktijdige imaging-modus. Pas confocale instellingen op Cy5- intensiteit (laser intensiteit, gain en offset) om te voorkomen dat het verzadigen van signalen, die van cruciaal belang voor de kwantificering. (Hoge temporele resolutie heeft de voorkeur voor het visualiseren van de kleurstofpenetratie. Echter, snel scannen vermindert de beeldkwaliteit.) Kies de juiste scansnelheid en lijn gemiddeld om de tijd resolutie van beeldvorming en de beeldkwaliteit in evenwicht te brengen. Voor dit protocol gebruiken een lijn gemiddelde van vier en een frame rate van 0,15 Hz.
- Hervat de stroom naar Cy5 geven in de stroomcel (nog steeds bij een stroomsnelheid van 0,03 ml / min). Tegelijkertijd starten tijdreeksen confocale beeldvorming.
- Kwantificeren Cy5- penetratie door radiaal gemiddeld Cy5- intensiteit binnen een 2-D ronde biofilm kolonie. Om gemiddeld eerst de rand van een biofilm cluster identificeren vervolgens een afstand kaart voor een 2-D gedeelte van de clusterEn tenslotte gemiddelde radiale patronen van Cy5 intensiteiten penetratie curve (zie figuur 6) te genereren.
- Om computationeel realiseren stap 3.8, gebruiken BioSPA (Biofilm Ruimtelijke Pattern Analysis) softwarepakket (ongepubliceerd, software en handleiding beschikbaar op aanvraag) of andere beeldanalyse programma.
- Om BioSPA gebruiken, eerst importeren een beeld geplaatst in BioSPA. Selecteer vervolgens de juiste drempel voor GFP en Cy5 kanalen om binaire beelden te maken. In de analyse / berekening menu, selecteer Geavanceerde Analyse en vervolgens Diffusion Analysis. Gebruik de GFP kanaal naar de rand van een cluster definiëren en gebruik het vormgereedschap een cluster als het gebied van belang (ROI) te selecteren.
- Dubbelklik op de geselecteerde biofilm cluster diffusie analyses uit te voeren. Sla de verspreiding analyseresultaten en kalibreren Cy5 intensiteit Cy5 concentratie met behulp van een kalibratiecurve.
- Om Cy5- concentratie ijklijn opstellen, meten Cy5- intensiteiten over een Cy5 concentration gradiënt onder confocale microscopie. (Cy5 intensiteit en concentratie hebben een lineair verband.)
4. Het karakteriseren van de Omringende Flow Field door Tracking fluorescerende deeltjes
OPMERKING: Fluorescerende deeltjes, zoals fluorescerende microbolletjes kunnen worden gebruikt om het stromingsveld karakteriseren om biofilms. Stromingsveld rond biofilms kan worden berekend vanaf het moment-serie observaties van deeltje posities met behulp van Particle Tracking velocimetry software. De hier getoonde resultaten werden verkregen met de Streams 2.02 softwarepakket 16 (software te downloaden en gebruikershandleiding verkrijgbaar bij http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Verdun de fluorescerende microbolletjes (diameter ~ 1 m) in gesteriliseerd water tot een uiteindelijke vaste concentratie van 0,2% en een eindvolume van 0,5 ml. Vortex om ervoor te zorgen dat de microbolletjeszijn goed verspreid.
- Injecteren en leveren de verdunde fluorescerende microbolletjes in de stroom cel volgende procedures uit stappen 3,3-3,5. Zodat een nauwkeurig volgen van de deeltjes pad gebruiken relatief lage stroomsnelheid (0,01 ml / uur voor het deeltje traceerresultaten in dit document).
- Schakel confocale instellingen modus XYT naar deeltje beweging volgen op een z-slice en neem de tijd-serie beelden. (Een frame rate van 1 Hz gebruikt voor representatieve resultaten in deze paper.) Herhaal deeltje injectie en het op verschillende plaatsen z 3-D stromingsveld genereren.
- Pre-proces van de tijdreeksen confocale beelden door het aftrekken van de achtergrond fluorescentie signaal (het signaal in de eerste verworven afbeelding van het beeld set) met behulp van ImageJ (software te downloaden en handleiding beschikbaar op http://imagej.nih.gov/ij/ ) of andere programma's.
- In ImageJ, open de eerste afbeelding van een afbeelding set en importeer de afbeelding set. Onder Proces / Image Calculator, aftrekken van de eerste afbeelding uit de afbeelding set. Sla de pre-bewerkte afbeelding set.
- Om stroom vectoren, import tijdreeksen confocale beelden in Streams 2,02 berekenen. Onder "Open proces view", selecteren en uitvoeren "Identificeer deeltjes". Gebruik de juiste drempel om deeltjes te identificeren. Gebruik 0,5 en 5 micrometer als minimale en maximale diameter van drempels voor 1 micrometer deeltjes.
- Vervolgens onder "Open proces view", selecteren en uitvoeren "PTV analyse pijplijn" om deeltje paden te genereren. Controleer het deeltje paden om te zien of ze vertegenwoordigen deeltje beweging. Tot slot, selecteren en uitvoeren "Create snelheidsveld" om een stroom vector kaart te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dubbele inlaat microfluidic stroomcel maakt waarneming van biofilm groei onder een welbepaalde chemische gradiënt gevormd door het mengen van twee oplossingen binnen de stromingskamer. De resulterende chemische gradiënt werd vroeger waargenomen door kleurstof injectie en in detail gekarakteriseerd door Song et al. 14. Smooth concentratie gradiënten werden gevormd in de dwarsrichting, zoals getoond in figuur 1. Het concentratieprofiel was steil nabij de inlaat heb downstream ontspannen door diffusie (figuur 1). Om biofilm ontwikkeling, voortvloeiende nutritioneel gradiënt, gebruikten we een bepaald minimaal groeimedium (FAB gemiddeld) met glucose toegevoegd slechts één inlaat als de enige koolstofbron. Dit leverde een glucose gradiënt in de stroomcel kamer terwijl alle andere voedingsstoffen homogeen verdeeld. De groei van P. aeruginosa PAO1 biofilms was sterk gecorreleerd met de lokale afgifte van glucose (figuur 2).Aangezien de dwarse glucoseconcentratie gradiënt was steil nabij de inlaat, de biofilm biomassa vertoonden een dramatische daling van hoog glucosegehalte gebied de lage glucose regio. Aangezien de dwarse glucose gradiënt stroomafwaarts ontspannen, de biofilm biomassa werd homogeen. We verder aangetoond het gebruik van deze stroom cel interacties P. bestuderen aeruginosa en E. coli in biofilms onder een glucose gradiënt (figuur 3). De resultaten toonden dat beide soorten vertoonden duidelijke ruimtelijke patronen in groei ten opzichte van de nutritionele gradiënt, dus bezet onderscheiden ecologische niches: P. aeruginosa gedomineerd biofilm biomassa in regio's met hoge concentraties glucose en E. coli domineerde in gebieden met een geringe concentraties glucose (figuur 3).
Om de feedback tussen groei biofilm en de omliggende stroom omgeving te begrijpen, zijn we bekend om het stromingsveld rond groeiende biofilms van fluorescerende deeltjes volgen velocimetry onder confocale microscopie. De waargenomen beweging van de geïnjecteerde fluorescerende microbolletjes is weergegeven in Film 1. Plaatselijke stroom vector- werd uit een gemiddelde van ten minste 4,200 discrete metingen van deeltjessnelheden met de Streams softwarepakket. Driedimensionaal in kaart brengen van het stromingsveld werd verkregen door het volgen van deeltjes op meerdere verticale posities (figuur 4). Biofilmgroei aanzienlijk grotere stroom heterogeniteit (figuur 4). Flow dichtbij biofilm base omgeleid rond biofilm clusters, leidt tot heterogeniteit en verminderde snelheid (figuur 4). Flow op biofilm boven een hogere snelheid en homogener (figuur 4).
Om de interne heterogeniteit veroorzaakt door beperkte transport van opgeloste stoffen binnen biofilms te begrijpen, zagen we het transport van Cy5- binnen biofilms door confocale microscopie. Tijdreeksen penetratieCy5 in een biofilm cluster wordt getoond in Film 2. De tijdreeksen Cy5 penetratie curven weergegeven in Film 3. De effectieve diffusiecoëfficiënt van Cy5 in biofilms werd berekend door aanbrengen van een 1-D diffusiemodel de Cy5 concentratieprofielen:
waarbij C de radiaal gemiddelde Cy5 concentratie berekend uit de fluorescentie-intensiteit en de afstand in de biofilm 17. Cy5 toonde de hoogste concentratie in de bulk stroom en verlaagde steil bij binnenkomst in de biofilm (figuur 5).
Figuur 1. Double-inlaat microfluïdische stroom cel. Soepele glucose gradiënten zijn gemaakt binnen de stroom kamer door de invoering van FAB medium om de twee inlaten met een koolstofbron (gluco Alleen se) voorzien in een inlaat. De resulterende patronen van glucose in de doorstroomcel worden aangegeven door arcering. Donkere schaduw vertegenwoordigt hogere concentraties glucose. Confocale beeldvorming werd uitgevoerd op negen locaties in de stroomcel. Resultaten weergegeven in de figuren 2 en 3, naar de locaties genummerd 1-9 in de figuur. Dit cijfer wordt gewijzigd nadat Song et al. (2014), Fig. 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. PAO1 biofilmgroei onder glucose gradiënten. 3 dagen PAO1 biofilms werden afgebeeld op de 9 locaties figuur 1. Rasterafstand = 18 urn voor het 1-8 en 24 urn voor het 9.g "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. De ontwikkeling van P. aeruginosa en E. coli dual-species biofilms onder glucose gradiënten. P. aeruginosa expressie constitutief GFP en de biofilms werden tegengekleurd met SYTO 62, dat een algemeen nucleïnezuur vlek. Beelden die hier getoond worden overlays van GFP (groen) en SYTO 62 (rood) kanalen. P. aeruginosa lijkt dus groen of geel (groen + rood), en E. coli verschijnt rood. Schaalbalken = 47 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Stroomsnelheid vectorvelden bij z = 4, 10 en 16 urn om een biofilm cluster. De lengte van de pijl geeft de grootte van de snelheid. Lage stroomsnelheid toont aan biofilm basis (z = 4, blauwe pijlen). Flow is homogener buurt biofilm top (z = 16, rode pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Cy5 penetratie in biofilms. (A) confocale microscoop bij z = 18 urn geeft gedeeltelijke penetratie van Cy5 tot biofilm clusters bij t = 190 sec. Schaalbalken = 10 urn. (B) Resulterende patronen van Cy5 concentratie kaart. (C) Cy5 concentratieprofiel in een biofilm cluster. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Procedures een Cy5 penetratie profiel genereren. Links: Geselecteerde ROI met een 2-D biofilm cluster. Midden: Afstand kaart van de biofilm cluster. Rechts: Radiaal-gemiddelde Cy5- intensiteitsprofiel. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Film 1 : Motie van geïnjecteerd fluorescerende deeltjes rond biofilm clusters (confocale video).
Movie 2 : Voortplanting van Cy5- in biofilm clusters (confocale video).
_content "> Movie 3 : Voortplanting van Cy5- in biofilm clusters (concentratie profielen video).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We toonden een suite van methoden om drie belangrijke biofilm-omgeving interacties te karakteriseren: biofilm reactie op chemische gradiënten, effecten van biofilm groei op de omliggende stroom micromilieu, en biofilm heterogeniteit als gevolg van interne beperkingen transport.
Wij toonden eerst het gebruik van een nieuwe microfluidic stroomcel een goed gedefinieerde chemische helling biofilm ontwikkeling leggen. Een goed gedefinieerde chemische gradiënt binnen de stroomcel genereren, is het belangrijk om dezelfde stroomsnelheid beide inlaten handhaven. Zorg ervoor dat de peristaltische pomp goed is afgesteld voor zowel stroom kanalen bij aan de groei medium te leveren tegen hetzelfde tarief. Ook zorg ervoor dat er geen verstopping in de stroomweg tijdens biofilm groei. Observaties van de groei van de dual-species biofilms in deze stroom cel laten zien dat chemische gradiënten sterk beïnvloed groei van biofilm en tussen species interacties binnen biofilms. Chemische gradiënten zijn gebruikelijk inomgevingen waar biofilms groeien, door een combinatie van beperkingen transport, chemische binding en reacties en microbiële opname en metabolisme 18-20. Dit microfluïdische stroom cel in staat stelt onderzoeken van diverse biofilm activiteiten onder een bepaald bereik van chemische omstandigheden binnen een enkel apparaat. Zo heeft deze stroomcel aangetoond bruikbaar voor de studie van biofilm afmaken antimicrobieel gradiënt 14 zijn.
Vervolgens hebben we aangetoond dat het gebruik van deeltje volgen velocimetry naar het stromingsveld observeren rond biofilm clusters. Om een nauwkeurig volgen van de geïnjecteerde fluorescerende deeltjes garanderen, het debiet moet worden geoptimaliseerd. Meestal laag debiet kan de beweging van deeltjes te worden vastgelegd in confocale gezichtsveld. Ook het scannen framesnelheid moet worden geoptimaliseerd om de beeldkwaliteit en tijdsresolutie evenwicht te brengen. Als de deeltjes bewegen te snel voor het vastleggen van de beweging, gebruiken onderste lijn of kader gemiddelde of Increase scansnelheid. We kaart gebracht op het gebied doorstroming op drie verticale posities over een biofilm cluster, en vond dat biofilmgroei verhoogde de stroom heterogeniteit. Karakteriseren van het stromingsveld rond biofilms maakt sleutel stroom-biofilm interacties om ontdekt te worden. Bijvoorbeeld kan deze worden gebruikt om mechanismen fluïdumtrek en afschuiving op de biofilm en de resulterende biofilm falen en loskomen van cellen reguleren van de oppervlakte 1,21 evalueren. Deze processen zijn belangrijk om inzicht zowel de effecten van biofilms op stroom systemen (bijvoorbeeld, biofouling) en regulering van de biofilm morfologie 8. Stromingscondities rond biofilms, bestuurt massatransport, wat belangrijk is voor een groot aantal biofilmprocessen. Bijvoorbeeld, de lokale vloeistofsnelheid in de biofilm oppervlak beïnvloedt de levering van nutriënten en substraten biofilms door advectie 22.
Tenslotte toonden we het gebruik van het injecteren van fluorescerende tracers te analyserenstoftransport patronen binnen de biofilm. We gebruikten Cy5- hier als een conservatieve tracer, en dit fluor lijkt te gedragen zich vaak conservatief in biofilms 23. Daarom moeten de resultaten representatief zijn voor het vervoer patronen van niet-reactief, neutrale opgeloste stoffen in biofilms zijn. De resultaten toonden een sterke afname van Cy5 concentratie nabij de biofilm oppervlak, waardoor een Cy5 concentratie in het inwendige van de biofilm slechts -50% van de concentratie in de bulk flow. Dergelijke steile concentratie profielen zijn consistent met eerder gerapporteerde metingen van zuurstof, voedingsstoffen en antibiotica in biofilms 2,24. Cy5- penetratie bochten geven informatie over opgeloste stof diffusie in biofilm clusters. Echter, is de methode die we hier presenteren beperkt tot 2-D transport van opgeloste stoffen in horizontale (xy) vliegtuigen in biofilms te analyseren. Met nieuwere snel imaging vermogen, bijvoorbeeld draaiende schijf confocale microscopie, kleurstofpenetratie kan ook in de 3-D in biofilms gevisualiseerd, whilech zal een onderzoek op verticaal transport processen mogelijk te maken. Bovendien kunnen fluorescerende tracer en deeltjes tezamen worden geïnjecteerd om informatie externe stroomomstandigheden en intern opgeloste stoffen tegelijk verkrijgen. Dergelijke informatie is nuttig advectief en diffusie stoftransport tussen massastroming en biofilms differentiëren en het effect van externe stroom interne stoftransport in biofilms beoordelen.
Kortom, presenteren wij gedetailleerde protocollen Volgens een nieuw microfluidic stroomcel die heeft goed gedefinieerde chemische gradiënten voor de studie van biofilm reacties op chemische signalen in de omgeving. Om heterogeniteit beter te karakteriseren in biofilms en hun omliggende microhabitat, presenteren we hier methoden om patronen te detecteren in zowel het stromingsveld rond biofilms en intern transport van opgeloste stoffen binnen biofilms. Elke methode biedt unieke informatie over biofilm eigenschappen en / of omgevingsomstandigheden. Aangezien deze methodengeïntegreerd, kunnen meerdere aspecten gelijktijdig informatie worden verkregen. Gecombineerde informatie stelt onderzoekers in staat om meer complexe problemen te benaderen. Bijvoorbeeld met behulp van deze werkwijzen, hebben we met succes biofilm ontwikkeling en interspecies interacties in biofilms geanalyseerd in een nutriënt gradiënt. Deze werkwijzen geven ook experimentele mogelijkheid om de complexiteit van de microbiële gemeenschap en de chemische omgeving die onderzoeken naar biofilmprocessen maakt een meer realistische context verhogen. Mogelijke toepassingen van deze methoden te dekken diverse aspecten van biofilm onderzoek, met inbegrip van biofilm levenscyclus, multispecies biofilms, biofilm heterogeniteit, transportprocessen in biofilms en biofilm-flow samenspel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Matt Parsek aan de Universiteit van Washington (Seattle, WA) voor het verstrekken van P. aeruginosa en E. coli-stammen en Roger Nokes aan de Universiteit van Canterbury (Nieuw-Zeeland) voor het verschaffen van toegang tot Streams software. Dit werk werd ondersteund door subsidie R01AI081983 van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. Confocale beeldvorming werd uitgevoerd bij de Northwestern Biologische Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
