Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilms zijn oppervlak bevestigd microbiële gemeenschappen die complexe structuren hebben en produceren aanzienlijke ruimtelijke heterogeniteit. Biofilm ontwikkeling wordt sterk gereguleerd door de omringende stroom en voedingswaarde milieu. Biofilm groei verhoogt ook de heterogeniteit van de lokale micro-omgeving door het genereren van complexe stroomvelden en stoftransport patronen. Om de ontwikkeling van heterogeniteit in biofilms en interacties tussen biofilms en hun lokale micro-leefgebied te onderzoeken, we groeiden mono-species biofilms van Pseudomonas aeruginosa en dual-species biofilms van P. aeruginosa en Escherichia coli onder nutritionele gradiënten in een microfluïdische stroomcel. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het creëren van voedingsstoffen gradiënten binnen de stroom cel en voor de teelt en het visualiseren van biofilm ontwikkeling onder deze omstandigheden. We ook aanwezig protocollen voor een reeks optische methoden ruimtelijke patronen kwantificeren biofilmstructuur, stromen distrimies dan biofilms, en massatransport rond en binnen de biofilm kolonies. Deze methoden ondersteunen uitgebreide onderzoeken van de co-ontwikkeling van biofilm en de habitat heterogeniteit.
Introduction
Micro-organismen hechten aan oppervlakken en vormen biofilms – celaggregaten bevindt in een extracellulaire polymere matrix 1. Biofilms gedragen zich heel anders uit individuele microbiële cellen, omdat biofilms hebben dramatische ruimtelijke heterogeniteit als gevolg van een combinatie van interne beperkingen transport van opgeloste stoffen en ruimtelijke variaties in de celstofwisseling 2,3. Zuurstof en voedingsstoffen concentraties drastisch verlagen op het raakvlak van biofilm en omringende vloeistof en krijgen verder uitgeput binnen in de biofilm 2. Ruimtelijke variaties in biofilm ademhaling en eiwitsynthese kan ook optreden als reactie op gelokaliseerde zuurstof en voedingsstoffen beschikbaarheid 2.
In aquatische en bodem omgevingen, de meeste bacteriën wonen in biofilms. Natuurlijke biofilms uit te voeren belangrijke biogeochemische processen zoals fietsen koolstof en stikstof en het verminderen van metalen 4,5. Klinisch, biofilmvorming is responsbaar voor langere pulmonale en urineweginfecties 6. Biofilm geassocieerde infecties zijn zeer problematisch, omdat de cellen in biofilms hebben een extreem hoge weerstand tegen antimicrobiële middelen in vergelijking met hun planktonische tegenhangers 6. Omdat biofilms zijn belangrijk in uiteenlopende situaties, is een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht op het begrijpen van de omgevingsfactoren die biofilm activiteiten en de ruimtelijke heterogeniteit in biofilms en het omliggende micro regelen.
Eerdere studies hebben aangetoond dat biofilm ontwikkeling sterk wordt gereguleerd door een aantal omgevingsfactoren: biofilms ontwikkelen verschillende morfologie onder verschillende stromingscondities; zuurstof en beschikbaarheid van voedingsstoffen invloed biofilm morfologie; en hydrodynamische shear stress invloed op de bevestiging van planktonische cellen aan oppervlakken en het detachement van de cellen van biofilms 7-9. Verder externe stroming beïnvloedt de levering van substraten into en binnen biofilms 10. De groei van biofilms verandert ook omringende fysische en chemische omstandigheden. Bijvoorbeeld biofilm groei leidt tot lokale uitputting van zuurstof en voedingsstoffen 2; biofilms accumuleren anorganische en organische verbindingen uit de omgeving 11; en biofilm clusters af te leiden stroom en toename oppervlakte wrijving 12,13. Omdat biofilms interactie met hun omgeving in een zeer complexe manieren, is het essentieel om informatie over de biofilm eigenschappen en milieu-omstandigheden gelijktijdig te verkrijgen, en multi-disciplinaire aanpak moeten worden gebruikt om volledig te karakteriseren biofilm-omgeving interacties.
Hier presenteren we een reeks geïntegreerde methoden ruimtelijke patronen in microbiële groei in mono-soorten en dual-species biofilms karakteriseren onder een opgelegde voeding gradiënt, en de resulterende wijziging van de lokale chemische en vloeibare micro observeren. We sparst beschrijven het gebruik van een recent ontwikkelde dubbele inlaat microfluïdische stroom cel biofilmgroei observeren onder goed gedefinieerde chemische gradiënten. We demonstreren dan het gebruik van deze microfluïdische stroomcel de groei van beide soorten bacteriën, Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli, in biofilms observeren onder verschillende voedingsomstandigheden. We zien hoe in situ visualisatie van fluorescerende tracer propagatie in biofilm kolonies kunnen worden gebruikt om kwantitatief beoordelen patronen van stoftransport in biofilms. Tenslotte laten we zien hoe microschaal particle volgen velocimetry, uitgevoerd onder confocale microscopie kan worden gebruikt om locale stromingsveld verkrijgen rond de groeiende biofilms.
Protocol
Representative Results
Discussion
We toonden een suite van methoden om drie belangrijke biofilm-omgeving interacties te karakteriseren: biofilm reactie op chemische gradiënten, effecten van biofilm groei op de omliggende stroom micromilieu, en biofilm heterogeniteit als gevolg van interne beperkingen transport.
Wij toonden eerst het gebruik van een nieuwe microfluidic stroomcel een goed gedefinieerde chemische helling biofilm ontwikkeling leggen. Een goed gedefinieerde chemische gradiënt binnen de stroomcel genereren, is h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Matt Parsek aan de Universiteit van Washington (Seattle, WA) voor het verstrekken van P. aeruginosa en E. coli-stammen en Roger Nokes aan de Universiteit van Canterbury (Nieuw-Zeeland) voor het verschaffen van toegang tot Streams software. Dit werk werd ondersteund door subsidie R01AI081983 van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. Confocale beeldvorming werd uitgevoerd bij de Northwestern Biologische Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
