Abstract
Biyofilmler kompleks yapılara sahip ve önemli mekansal farklılıklarını üreten yüzey bağlı mikrobiyal topluluklar vardır. Biyofilm geliştirme güçlü çevredeki akışı ve besin ortamında düzenlenir. Biyofilm büyüme de karmaşık akış alanları ve çözünen taşıma modellerini üreterek yerel mikroçevresinin heterojenliğini artırır. Biyofilm ve yerel mikro-yaşam arasındaki Biyofilmlererde ve etkileşim içinde heterojenite gelişimini araştırmak için, biz Pseudomonas aeruginosa mono-tür biyofilm ve P. çift türler biyofilm büyüdü mikroakışkan akış hücresi beslenme geçişlerini altında aeruginosa ve Escherichia coli. Bu akış hücresi içinde besin gradyanları oluşturmak için büyüyen ve bu koşullar altında biyofilm geliştirme görselleştirmek için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz aynı zamanda optik yöntemler bir dizi için mevcut protokoller distri akış, biyofilm yapısı mekansal desen ölçmek içinrı payı etrafında biyofilm ve kitle ulaşım üzerinde ve biyofilm koloniler içinde. Bu yöntemler biyofilm ve habitat heterojenite eş-geliştirme kapsamlı araştırmalar destekler.
Introduction
Bir hücre dışı-polimer matrisi 1 içine hücre agrega - İman yüzeyler ve form biyofilm eklemek. Biyofilm hücre metabolizmasında 2,3 iç çözünen taşıma sınırlamaları ve mekansal varyasyonların bir arada kaynaklanan dramatik mekansal heterojenlik çünkü Biyofilmler, çok farklı bireysel mikrobiyal hücrelerin davranır. Oksijen ve besin konsantrasyonları önemli ölçüde biyofilm ve sıvı ve daha biyofilm 2 içinde tükenen çevreleyen arasındaki arayüzde azalır. Biyofilm solunum ve protein sentezinde Mekansal varyasyonları da lokalize oksijen ve besin durumu 2 yanıt olarak oluşabilir.
Sucul ve toprak ortamlarında, çoğu bakteri biyofilmlerde yaşamak. Doğal biyofilm karbon ve azot bisiklet ve metaller 4,5 azaltarak gibi önemli biyokimyasal süreçlerini yürütmek. Klinik, biyofilm oluşumu tepk olduğunuUzun süreli akciğer ve üriner enfeksiyonlar 6 ible. Biyofilmlererde hücreler planktonik muadillerine göre 6 antibiyotiklere son derece yüksek direnç var çünkü biyofilm ilişkili enfeksiyonlar oldukça sorunludur. Biyofilm farklı ortamlarda önemli olduğundan, araştırma önemli bir miktarda biyofilm faaliyetleri ve biyofilm mekansal heterojenlik ve çevredeki mikroortam kontrol çevresel faktörleri anlamaya odaklanmıştır.
Önceki çalışmalar, biyofilm geliştirme; çevresel bir dizi faktöre göre düzenlenir olduğunu bulduk: biyofilm çeşitli akış koşullarında farklı morfolojiler geliştirilmesi; oksijen ve besin kullanılabilirliği etkisi biyofilm morfolojisi; ve hidrodinamik kayma gerilmesi yüzeylere planktonik hücreler eki ve biyofilm 7-9 hücrelerinin ayrılmasını etkiler. Ayrıca, dış akış durumu yüzeyler int teslim etkilero ve biyofilm 10 içinde. biyofilm büyüme de fiziksel ve kimyasal koşulları çevredeki değiştirir. Örneğin, biyofilm büyüme oksijen ve besin 2 yerel tükenmesine yol açar; biyofilm çevresini 11 inorganik ve organik bileşikler birikir; ve biyofilm kümeleri akış ve artış yüzey sürtünmesi 12,13 yönlendirir. Biyofilm onların çok karmaşık yollarla çevreyi saran etkileşim nedeniyle, aynı anda biyofilm özellikleri ve çevre koşulları hakkında bilgi edinmek için kritik ve çok disiplinli yaklaşımlar kapsamlı biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek için kullanılması gerekmektedir.
Burada bir uygulanan besin derecesinde mono- türler ve ikili türler biyofilm içindeki mikrobik büyüme uzamsal desen karakterize etmek ve yerel kimyasal ve sıvı mikro-elde edilen modifikasyon gözlemlemek için entegre yöntem bir dizi sunulmuştur. Biz köknarst iyi tanımlanmış kimyasal geçişlerini altında biyofilm büyüme gözlemlemek için bir süre önce geliştirilen çift giriş mikroakışkan akış hücresinin kullanımını tarif. Daha sonra beslenme koşulları kümesi altında biyofilm bakteri, Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli, iki türün gelişimini izlemek için bu mikro-akışkan akış hücresinin kullanımını göstermektedir. Biz biyofilm koloniler halinde floresan izleyici yayılma yerinde görselleştirme nicel Biyofilmlererde çözünen ulaşım modellerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, biz konfokal mikroskobu altında yapılan mikro parçacık izleme velosimetri, büyüyen biyofilm etrafında yerel akış alanını elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Akış Hücre Kurulum ve Aşılama
NOT:. Song ve ark tarif çift giriş mikroakışkan akış hücresi kullanın, 2014 14 biyofilm büyümeye. Bu akış hücresi iyi tanımlanmış pürüzsüz kimyasal degradeler oluşturmak mümkün. Akış hücresi tasarım, önceden Song açıklanan, Şekil 1 'de gösterilen ve hücre imalat akış ve ark., 2014 14. Burada detaylı Yöntemlerimizi P kullanılarak aeruginosa, E. E. coli biyofilm oluşturulması için, ancak diğer türlerin de uygun olabilir. Biz P. kullanılan aeruginosa kurucu biyofilm geliştirilmesi için bir model organizma olarak, yeşil floresan protein (GFP) ifade gfp, PAO1-. Ayrıca, E. kullanılan coli DH5a P. ile karışık türler biyofilm oluşturmak için aeruginosa. P. aeruginosa, E. E. coli suşları LB agar plakaları üzerinde yetiştirildi.
- A (PDMS) bağlı akış hücresi kullanarak polidimetilsiloksan hazırlayın14 de tarif edildiği gibi, oksijen plazma muamelesi üzerinden cam lamel. Akış hücresi odasının boyutları 0.24 mm (uzunluk x genişlik x derinlik) × 23 mm × 13 mm.
- Hazırlayın FAB büyüme ortamı 15 güncellenmiştir. Akış hücre içinde bir beslenme degrade altında biyofilm büyüme gözlemlemek için, bir girişinde 0,6 mcM glukoz ile 15 orta FAB değiştirilmiş ve diğer giriş boyunca herhangi bir karbon kaynağı olmadan FAB orta tanıtmak getiriyordu. Filtre ile sterilize (gözenek boyutu = 0.2 mm) FAB orta eklemeden önce glikoz stok çözeltisi (60 mM) getirilmiştir. Ayrıca döngüsü 1 FAB orta otoklav (sıvı, 15 dakika, 121 ° C, 17 psi) ile yıkanmıştır.
- Akış sistemi sterilize. Aşılamadan önce, bütün akış yolunu (orta şişe, boru, kabarcık tuzakları, akış hücreleri) akış hücresinin üst bulunan (tek ve önceden sterilize) plastik üç yollu vana hariç, döngüsü 1 kullanarak otoklav. (Üç Yollu vana hücre c enjekte edilmesi için kullanılanulture, floresan izleyici ve mikroboncukları.), montaj sırasında kirlenmesini önlemek alüminyum folyo veya otoklav önce otoklav torbaları ile tüm boru ve bağlantı açıklıkları karşılamak için.
- Akış sistemi bağlayın. Dikkatle akış hücresi sistemi bileşenlerini monte (akış sistemi montajı için video bakınız) ve tam akış hızını kontrol eden bir peristaltik pompa vasıtasıyla akış hücresi büyüme ortamı sunmak.
- P. bir koloni aktararak aşılama için hücre kültürü hazırlayın aeruginosa veya E. LB plakaları 3 LB et suyu ilave edildi ve 225 rpm'de ve 37 ° C'de kültür O / N sallamak için E. coli. Son OD 600 su sterilize 1 ml O / N hücre kültürleri sulandırmak = 0.01 inokulum olarak. (Kültür ve kirlenmeyi önlemek için bir laminer akış kaputu bakteri sulandırmak.)
- Eşdeğer OD 600 ile 1 ml 1 = 0.01 Her bir bakteri için: karışık türleri biyofilm ile deneyler için, 1 oranında iki bakteri kültürleri seyreltin.
- Akış hücresi inoküle. Üç yollu bir valf akış hücresi girişine aşı 1 ml enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, bakteriyel hücreler cam kapak takmak için izin 1 saat akışını durdurun. (Akış hücresi askıya hücreler lamel üzerine yerleşmek için izin aşağı lamel tarafı ile yerleştirildiğinden emin olun.)
- 1 saat sonra, akış devam ve 3 gün süre ile her bir giriş için 0.03 ml / dakikalık bir sabit oranda akış hücresi büyüme ortamı pompa.
Konfokal Mikroskobu kullanılarak Besin Gradiyentler Cevabı 2. karakterizasyon Biyofilm Geliştirme
NOT: P. aeruginosa kurucu olarak ifade edilen GFP ile görüntülenmiş, ve bununla birlikte E. edilebilir karma türler Biyofilmlererde coli counterstaining tarafından görüntülendi gerekir.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak 3 gün biyofilm gözlemleyin. Temsilcisi sonuçları için bir 63X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak biyofilm gözlemlemek. Görüntüleme önce işaretleyinizkapak cam tarafında bir ızgara ile çift giriş akış hücresi. (Bu ızgara amacı deneyci akış hücresi odasının içinde görüntüleme bölgeleri bulmak için izin vermektir.)
- Örneğin STYO, 62, 990 ul stok çözeltisi (1 mM) ile sterilize edilmiş su ve daha sonra yavaş yavaş bir şırınga içine kullanılarak seyreltilmiştir leke enjekte, yeşil flüoresan nükleik asit boya olarak hücre-geçirgen kırmızı floresan nükleik asit leke 10 ul seyreltilmiş, counterstain için yukarı üç yollu vana akış hücresi odası. Durgun akış hücresi edin ve 30 dakika boyunca karanlıkta üretilmişler ve sonra 15 dakika için bağlanmamış leke üzerinden yıkama akışı devam eder.
- Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Uyarma için 488 nm Argon lazer ve GFP (500-535 nm) ve (yeşil floresan nükleik asit leke, 650-750 nm) nükleik asit leke kanalları toplama emisyon etkinleştirin. Parlak ve temiz görüntüler için her iki kanal için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Seç xyz ve eşzamanlı görüntüleme modu. Iden z kontrol düğmesini kullanınalanında biyofilm alt ve üst tespit edebilecektir. 3-D görüntü yığını elde etmek için 0.5 mikron z-adım ayarlayın. (Görüntü elde etmek için dört bir çizgi ortalama kullanmak, yüksek görüntü kalitesini sağlamak için.)
- Üç ya da mekansal akış hücresi içinde biyofilm geliştirme şekilleri, görüntü biyofilm eşlemek için daha uzunlamasına (x) akış hücresi girişi boyunca mesafeler ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi, üç enine (y), uygulanan besin derecesinde göre konumlandırır .
Muhafazakar Floresan Tracer Enjeksiyonların 3. karakterizasyon İç Katı Ulaşım
NOT: Cy5 gibi tutucu bir floresanlı işaret ley ic, biyofilm içinde çözünen nakil kalıpları karakterize etmek için kullanılabilir.
- Bir stok çözeltisi olarak 10 mg / ml'ye bir son konsantrasyona kadar su içinde Cy5 (mono-reaktıf NHS esterlı) içinde çözülür. -20 ° C derin dondurucuda Cy5 stok solüsyonu saklayın.
NOT: Cy5 ışık Sensit olduğu gibiive, mağaza, sulandırmak ve karanlıkta Cy5 çözümleri enjekte. - Floresan izleyici enjeksiyonları öncesinde, (bir 63X amacı ile) konfokal mikroskobu ile 3 gün biyofilm 3-D görüntü yığını alır. (Biyofilm kolonilerin geniş bölgeleri boya nakil zaman serisi gözlemler için idealdir.) (Şekil 5A'da gösterildiği gibi) aynı zamanda görüntüleme için iyi ayrılmış koloniler ile bir z düzlemi seçin.
- Her bir Cy5 enjeksiyon deney için, 20 ug / ml arasında bir Cy5 konsantrasyona sahip bir enjeksiyon çözeltisi elde etmek için su ile sterilize 998 ul Cy5 stok çözeltisi, 2 ul seyreltin.
- Akışını duraklatmak ve 3-yollu vana vasıtasıyla bir şırınga kullanılarak akış hücresinin memba içine Cy5 çözüm enjekte etmek pompayı durdurun. (Bu enjekte ederken akış yolunu girmesini hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. Kabarcık tuzakları geri enjeksiyon sırasında açık tutulmalıdır.)
- Cy5 çözüm enjekte ettikten sonra, 3-yollu vana ayarlamak, kabarcık tuzakları kapatın ve yeniden başlatınakış hücresi enjekte Cy5 çözüm sunmak için pompa.
- XYT için konfokal görüntüleme moduna geçiş. Eşzamanlı görüntüleme modunda Cy5 ve GFP kanalları etkinleştirin. (Lazer yoğunluğu kazanmak ve ofset) Cy5 yoğunluğuna konfokal ayarlarını yapma ölçümü için kritik sinyaller, doyurarak önlemek için. (Yüksek çözünürlüklü zamansal boya penetrasyonu görselleştirmek için tercih edilir. Ancak, hızlı tarama görüntü kalitesini düşürür.) Görüntüleme süresi çözünürlük ve görüntü kalitesi dengelemek için uygun tarama hızı ve çizgi ortalama seçin. Bu protokol için dört bir çizgi ortalama ve 0.15 Hz kare hızı kullanın.
- (Hala 0.03 ml / dk'lık bir akış hızında) akış hücresi içine Cy5 sağlamak için akış devam edin. Aynı anda zaman serisi konfokal görüntüleme başlatın.
- Radyal 2-D dairesel biyofilm koloni içinde Cy5 yoğunluğunu ortalama olarak Cy5 nüfuz niceliğini. Ilk biyofilm küme kenarını tanımlamak, ortalama, ardından kümenin 2-D bölümü için bir mesafe haritası oluşturmakVe son olarak, Cy5 yoğunluklarının ortalaması radyal kalıpları bir penetrasyon eğrisi (bakınız Şekil 6) üretir.
- Hesaplama 3.8 adıma gerçekleştirmek için, BioSpa (Biyofilm Mekansal Desen Analizi) yazılım paketi (yayınlanmamış, yazılım paketi ve el istek üzerine) veya diğer görüntü analiz programları kullanın.
- BioSpa kullanmak için, öncelikle BioSpa içine ayarlanmış bir görüntüyü içe. Sonra ikili görüntüleri yapmak için GFP ve Cy5 kanalları için uygun eşik seçmek. Analiz / Hesaplama menüsünde, Gelişmiş Analizi ve ardından Difüzyon Analizi seçin. Bir küme kenarını tanımlamak ve faiz (ROI) bölgesi gibi bir küme seçmek için poligon aracını kullanmak için GFP kanalı kullanın.
- Çift difüzyon analizi gerçekleştirmek için seçilen biyofilm kümeyi tıklatın. Difüzyon analiz sonuçlarını kaydedin ve bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak Cy5 konsantrasyonuna Cy5 yoğunluğunu ayarlayın.
- Bir Cy5 conce üzerinde Cy5 yoğunluklarını ölçmek, Cy5 konsantrasyonu kalibrasyon eğrisi oluşturmak içinkonfokal mikroskopta ntration degrade. (Cy5 yoğunluğu ve konsantrasyonu doğrusal bir ilişki vardır.)
4. Takip Floresan Parçacıklar tarafından Etraftaki Akış Field karakterize
NOT: floresan mikro Flüoresan parçacıklar, biyofilm çevresinde akış alanı karakterize etmek için kullanılabilir. Biyofilm etrafında akış alanı parçacık izleme velosimetri yazılımını kullanarak parçacık pozisyonların zaman serisi gözlemlerinden hesaplanabilir. Burada gösterilen sonuçlar Akımlar 2.02 yazılım paketi 16 (yazılım indir ve mevcut kullanıcı kılavuzu ile elde edilmiştir http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- % 0.2'lik bir nihai katı konsantrasyonu ve 0.5 ml nihai hacme kadar steril su içinde floresan, mikro (çap yaklaşık 1 um) seyreltin. Vortex mikroboncukları emin olmak içiniyi dağılmıştır.
- Enjekte ve adımlar 3,3-3,5 arası prosedürleri aşağıdaki akış hücre içine seyreltilmiş floresan mikroboncukları teslim. Parçacık yolunun doğru izleme, (bu yazıda parçacık izleme sonuçları için 0.01 ml / saat) nispeten düşük akış hızını kullanmak izin vermek için.
- Bir z-dilim partikül hareketi izlemek ve zaman serisi görüntüleri çekmek için modu XYT için konfokal ayarları geçin. (1 Hz A kare hızı, bu yazıda gösterilen temsilcisi sonuçları için kullanılmıştır.) Tekrar parçacık enjeksiyon ve görüntü farklı z yerlerde 3-D akış alanını oluşturmak için.
- Ön işlem zaman serisi (mevcut yazılım indirme ve kılavuzu ImageJ kullanarak arka plan floresan sinyali (görüntü kümesinin ilk kazanılmış görüntüde sinyali) çıkarılarak konfokal görüntüleri http://imagej.nih.gov/ij/ ) veya diğer programlar.
- ImageJ, bir görüntü kümesinin ilk görüntüyü açmak ve ardından görüntü seti ithal. Süreci altında / Görüntü Calculator, görüntü kümesinden ilk görüntüyü çıkarma. Önceden işlenmiş görüntü kümesi kaydedin.
- Akarsu 2.02 akış vektörleri, ithalat zaman serisi konfokal görüntüleri hesaplamak için. "Açık süreç görüntüsü" altında seçin ve "parçacıkları tanımlamak" yürütmek. Parçacıkları tanımlamak üzere uygun eşik kullanın. 1 um parçacıkları için minimum ve maksimum çapı eşik olarak 0.5 ile 5 um kullanın.
- Ardından "Aç süreç görünümü" altında, seçmek ve parçacık yolları üretmek için "PTV analiz boru hattı" yürütmek. Onlar parçacık hareketi temsil görmek için parçacık yolları kontrol edin. Son olarak, seçmek ve bir akış vektör haritası oluşturmak için "hız alanını oluşturma" yürütmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
çift giriş mikro-akışkan akış hücresi akış bölme içinde iki çözeltinin karıştırılması ile oluşturulan bir iyi tanımlanmış kimyasal derecesinde biyofilm büyüme gözlenmesini sağlar. Elde edilen kimyasal degrade eski boya enjeksiyonu ile gözlenen ve Şarkı ark. 14 tarafından ayrıntılı olarak karakterize edildi. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, pürüzsüz değişim ölçüleri, enine yönde oluşturulmuştur. Konsantrasyon profili girişin yanındaki dik nedeniyle difüzyon (Şekil 1) için aşağı doğru rahat gördü. Bir besin derecesinde biyofilm gelişimini gözlemek için, sadece tek karbon kaynağı olarak bir girişine ilave glükoz ile tarif edilen en az bir büyüme ortamını (FAB ortamı) kullanılabilir. Tüm diğer besin homojen dağıtılmış ise bu akış hücresi odasında bir glikoz degrade vermiştir. P. büyüme aeruginosa PAO1 biyofilm güçlü glikoz yerel teslimat (Şekil 2) korelasyon saptandı.Enine glukoz konsantrasyonu degrade girişinin yakınına dik olarak, biyofilm biyokütle düşük glukoz bölgeye yüksek glikoz bölgesinden dramatik bir düşüş gösterdi. Alt baş rahat enine glukoz gradyan olarak, biyofilm biyokütle daha homojen hale geldi. Biz daha P. etkileşimlerini incelemek için bu akış hücresinin kullanımını gösterdi aeruginosa, E. Bir glikoz degrade altında Biyofilmlererde coli (Şekil 3). Sonuçlar, bu iki türün beslenme degrade büyüme göreceli olarak farklı mekansal desenleri gösterdi ve bu nedenle farklı ekolojik niş işgal gösterdi: P. aeruginosa yüksek glukoz konsantrasyonları ve E bölgelerde biyofilm biyokütle hakim coli düşük glukoz konsantrasyonları (Şekil 3) ile bölgelerde hakim.
Biyofilm büyüme ve çevredeki akış ortamı arasındaki geri bildirim anlamak için, biz etrafında büyüyen biyo akış alanını karakterizekonfokal mikroskobu altında floresan parçacık izleme ölçümleri ile filmler. enjekte floresan mikro gözlenen hareket 1. yerel akış vektörü bilgileri Akımlar yazılım paketi kullanılarak parçacık hızları, en az 4,200 ayrı ölçümün ortalaması elde edildi Film gösterilmiştir. Akış alanının üç boyutlu haritalama çoklu dikey pozisyonlarda (Şekil 4) parçacıkları takip ederek elde edilmiştir. Biyofilm büyümesi önemli ölçüde artmış akım heterojenite (Şekil 4). Biyofilm üssü yakınlarında Akış artan heterojenite yol açan, biyofilm kümeleri etrafında yönlendirilir ve hızı (Şekil 4) azalmıştır. Biyofilm üstündeki Akış yüksek hıza sahip ve (Şekil 4) daha homojen.
Biyofilm içinde sınırlı çözünen taşıma dolayı iç heterojenliğini anlamak için, biz konfokal mikroskobu ile biyofilm içinde Cy5 taşınmasını gözlendi. Zaman serisi penetrasyonCy5 bir biyofilm küme içine Cy5 konsantrasyon profilleri için 1-D difüzyon modeli uydurma hesaplanmıştır Film 3. Biyofilmlererde Cy5 etkin difüzyon katsayısı gösterilen Movie 2. zaman serisi Cy5 penetrasyon eğrileri gösterilmiştir:
burada Cı floresan yoğunluğu hesaplandı radyal ortalama Cy5 konsantrasyonu ve biyofilm 17 içine mesafedir. Cy5 toplu akışında yüksek konsantrasyon gösterdi ve biyofilm (Şekil 5) girdikten dik azalmıştır.
1. Çift giriş mikroakışkan akış hücresi Şekil. Pürüzsüz glukoz degradeler gluko (bir karbon kaynağı ile iki girişlerine FAB orta tanıtarak akış odasının içinde oluşturulan se), bir girişten tek sağladı. gölgeleme ile belirtilmiştir akış hücresi içindeki glikoz desen yaratılmıştır. Koyu gölgeleme yüksek glukoz konsantrasyonları temsil eder. Konfokal görüntüleme akış hücresi dokuz noktada yapıldı. 2 ve 3, yerle bakınız Şekil sunulan sonuçlar, Şekil 1-9 sayılı. Bu rakam, Song ve arkadaşları sonra tadil edilmiştir. (2014), Res. 1. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Glukoz gradyanlarıyla Şekil 2. PAO1 biyofilm büyümesi. 3 günlük PAO1 biyofilmler, Şekil 1 'de gösterilen 9 yerle görüntülenmişlerdir. Tablo aralığı = görüntü 1-8 18 um ve görüntü 9, 24 um.g "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3. P. gelişimi aeruginosa, E. glikoz geçişlerini altında coli çift türler biyofilmleri. P. aeruginosa kurucu GFP ifade ve biyofilm de genel nükleik asit leke Syto 62 ile zıt. Burada gösterilen Görüntüler GFP (yeşil) ve Syto 62 (kırmızı) kanalları bindirmeleri vardır. P. aeruginosa nedenle yeşil veya sarı (yeşil + kırmızı), ve E. görünür E. coli kırmızı görünür. Ölçek çubukları 47 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Akış hızı vektör alanları z = 4, 10 ve biyofilm küme yaklaşık 16 mikron. Ok uzunluğu hızının büyüklüğünü temsil eder. Düşük akış hızı biyofilm tabanı (z = 4, mavi oklar) görülmektedir. Akış biyofilm üst (z = 16, kırmızı oklar) yakınında daha homojen olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Biyofilm içine Şekil 5. Cy5 penetrasyon. T = 190 sn biyofilm kümeler halinde Cy5 kısmi penetrasyon gösteren z = 18 mikron (A) Eşodaklı mikrografı. Ölçek çubukları 10 mikron =. (B) Cy5 konsantrasyonu haritası kalıplarını Ortaya. (C) Cy5 konsantrasyon profili bir biyofilm kümedeki. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
6. Prosedürler Şekil bir Cy5 penetrasyon profili oluşturmak için Sol:. 2-D biyofilm küme içeren yatırım getirisi Seçilen. Orta: biyofilm küme mesafe haritası. Sağ: Radyal-ortalama Cy5 yoğunluk profili. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Film 1 : biyofilm kümeleri etrafında enjekte floresan parçacıkların hareketi (konfokal video).
Film 2 : biyofilm kümeleri içine Cy5'in Yayılım (konfokal video).
_content "> Film 3 : biyofilm kümeleri içine Cy5'in Yayılım (konsantrasyon videoyu profilleri).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyofilm kimyasal geçişlerini yanıt, çevredeki akış mikroçevre üzerinde biyofilm büyüme ve iç ulaşım sınırlamaları kaynaklanan biyofilm heterojenite etkileri: Biz üç önemli biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek yöntemler paketi gösterdi.
İlk biyofilm gelişimi için iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı empoze etmek için yeni bir mikro-akışkan akış hücresinin kullanmıştır. Akış hücresi içinde, bir iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı üretmek için, her iki girişleri için aynı akış oranının muhafaza etmek önemlidir. Peristaltik pompa iyi aynı oranda Yetiştirme ortamı sunmak için her iki akış kanalları için ayarlanmış olduğundan emin olun. Ayrıca biyofilm büyüme sırasında akış yolunda hiçbir tıkanma olduğundan emin olun. Kimyasal eğimleri büyük biyofilm içinde biyofilm büyüme ve türler arası etkileşimleri etkilenen bu akış hücresi gösterisinde çift türler biyofilm büyüme Gözlemleri. Kimyasal geçişlerini yaygındırnakliye kısıtlamaları, kimyasal bağlanma ve reaksiyonlar ve mikrobik alımı ve metabolizmasındaki 18-20 bir kombinasyonundan ötürü biyofilm büyümeye ortamlar. Bu mikroakışkan akış hücresi tek bir cihaz içinde kimyasal koşulları tanımlanmış aralığı altında farklı biyofilm faaliyetleri soruşturmaları sağlar. Örneğin, bu akış hücresi bir antimikrobik gradyan 14 altında biyofilm öldürme çalışılması için yararlı olduğu gösterilmiştir.
Sonra biyofilm kümeleri etrafında akış alanını gözlemlemek için partikül izleme velosimetri kullanımını gösterdi. Enjekte floresan parçacıkların doğru izleme sağlamak için, akış hızı optimize edilmesi gerekmektedir. Genel olarak, düşük bir akım hızının parçacıkların hareket bakış konfokal alanda yakalanmasını sağlar. Ayrıca tarama kare hızı görüntü kalitesi ve zaman çözünürlüğü dengelemek için optimize edilmesi gerekmektedir. Parçacıklar hareketi yakalamak için çok hızlı hareket ederse, alt çizgi veya çerçeve ortalama veya payına göre arttırılmış kullanınase tarama hızı. Biz bir biyofilm küme üzerinde üç dikey pozisyonlarda akış alanını eşlenen ve biyofilm büyüme akış heterojenite arttığını gördük. Biyofilm etrafındaki akış alanını karakterize anahtar akış biyofilm etkileşimleri keşfedilmeyi sağlar. Örneğin, bu yüzey 1,21 hücrelerin sıvı sürükleme ve kayma biyofilm üzerinde ve elde edilen biyofilm yetmezliği ve ayrılmasını düzenleyen mekanizmaların değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Bu süreçler anlayış hem akış sistemleri (örneğin, biyolojik kirlenmeye) ve biyofilm morfolojisi 8 düzenlenmesi üzerindeki biyofilm etkilerine önemlidir. Biyofilm etrafında akış koşulları da biyofilm süreçleri geniş bir yelpazede için önemlidir kitle ulaşım, kontrol. Örneğin, biyofilm yüzeyinde yerel sıvı hızı adveksiyon 22 ile biyofilm besin ve yüzeylerde teslim etkiler.
Son olarak, analiz etmek için flüoresan izleyiciler enjekte kullanımı için verildibiyofilm içinde çözünen taşıma modelleri. Biz muhafazakar izleyici olarak burada Cy5 kullanılan ve bu flor genellikle biyofilm 23 konservatif davranmaya görünür. Bu nedenle sonuçlar biyofilmlerde olmayan reaktif, nötr çözünenlerin ulaşım modellerinin temsilcisi olmalıdır. Sonuçlar biyofilm kütle akışı konsantrasyonu sadece ~% 50 iç kısmında bir Cy5 konsantrasyonu verecek şekilde biyofilm yüzeyine yakın Cy5 konsantrasyonda dik bir düşüş göstermiştir. Böyle dik konsantrasyon profilleri biyofilm 2,24 içinde oksijen, besin ve antimikrobik önceden bildirilen ölçümleri ile tutarlıdır. Cy5 penetrasyon eğrileri biyofilm kümeler halinde çözünen difüzyon hakkında bilgi vermek. Ancak, biz burada sunmak yöntem biyofilm yatay (xy) düzlemlerde 2-D çözünen taşıma analiz sınırlıdır. Yeni hızlı görüntüleme yeteneği sayesinde disk konfokal mikroskopi iplik örneğin, boya penetrasyonu da biyofilm içinde 3-D görüntülenmiştir olabilir, WHIch düşey taşıma süreçleri üzerinde bir soruşturma sağlayacaktır. Ayrıca, floresanlı işaretleyici ve partiküller dış akış koşulları ve aynı zamanda iç eriyik taşıma bilgi elde etmek üzere enjekte edilebilir. Bu bilgiler toplu akışı ve biyofilm arasında advective ve pasif çözünen taşıma ayırt etmek ve biyofilm iç çözünen taşıma dış akış etkisini değerlendirmek için yararlıdır.
Genel olarak, biz bir ortamda kimyasal uyaranlara biyofilm yanıtların çalışma için kimyasal eğimleri iyi tanımlanmış sağlayan bir roman mikroakışkan akış hücresi kullanılarak ayrıntılı protokolleri sunuyoruz. Daha iyi biyofilm ve onların çevresindeki microhabitat heterojeniteyi karakterize etmek için, biz biyofilm ve biyofilm içinde iç çözünen taşıma çevreleyen akış alanında hem desenleri karakterize burada yöntemleri sunuyoruz. Her yöntem biyofilm özellikleri ve / veya çevresel koşullar hakkında farklı bilgiler sağlar. Bu yöntemlerentegre, çok sayıda bilgi yönleri aynı anda elde edilebilir. Kombine bilgiler daha karmaşık sorunlara yaklaşmaya araştırmacıların sağlar. Örneğin, bu yöntemleri kullanarak, başarılı bir besin degrade altında Biyofilmlererde biyofilm gelişimi ve türler arası etkileşimleri analiz. Bu yöntemler aynı zamanda daha gerçekçi bir bağlamda biyofilm süreçleri hakkında soruşturma izin verir mikrobiyal topluluk ve kimyasal ortamda, karmaşıklığı artırmak için deneysel yeteneği sağlar. Bu yöntemlerin Potansiyel uygulamalar biyofilm yaşam döngüsü, biyofilmlerin, biyofilm heterojenite, biyofilm taşıma süreçleri ve biyofilm akış etkileşimi de dahil olmak üzere biyofilm araştırma farklı yönlerini kapsamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz P sağlamak için Washington Üniversitesi (Seattle, WA) Matt Parsek teşekkür aeruginosa, E. Akarsular yazılıma erişim sağlamak için Canterbury (Yeni Zelanda) Üniversitesi'nde coli suşları ve Roger Nokes. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R01AI081983 tarafından desteklenmiştir. Konfokal görüntüleme Kuzeybatı Biyolojik Görüntüleme Tesisi (BIF) gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
