Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biyofilmler kompleks yapılara sahip ve önemli mekansal farklılıklarını üreten yüzey bağlı mikrobiyal topluluklar vardır. Biyofilm geliştirme güçlü çevredeki akışı ve besin ortamında düzenlenir. Biyofilm büyüme de karmaşık akış alanları ve çözünen taşıma modellerini üreterek yerel mikroçevresinin heterojenliğini artırır. Biyofilm ve yerel mikro-yaşam arasındaki Biyofilmlererde ve etkileşim içinde heterojenite gelişimini araştırmak için, biz Pseudomonas aeruginosa mono-tür biyofilm ve P. çift türler biyofilm büyüdü mikroakışkan akış hücresi beslenme geçişlerini altında aeruginosa ve Escherichia coli. Bu akış hücresi içinde besin gradyanları oluşturmak için büyüyen ve bu koşullar altında biyofilm geliştirme görselleştirmek için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz aynı zamanda optik yöntemler bir dizi için mevcut protokoller distri akış, biyofilm yapısı mekansal desen ölçmek içinrı payı etrafında biyofilm ve kitle ulaşım üzerinde ve biyofilm koloniler içinde. Bu yöntemler biyofilm ve habitat heterojenite eş-geliştirme kapsamlı araştırmalar destekler.
Introduction
Bir hücre dışı-polimer matrisi 1 içine hücre agrega – İman yüzeyler ve form biyofilm eklemek. Biyofilm hücre metabolizmasında 2,3 iç çözünen taşıma sınırlamaları ve mekansal varyasyonların bir arada kaynaklanan dramatik mekansal heterojenlik çünkü Biyofilmler, çok farklı bireysel mikrobiyal hücrelerin davranır. Oksijen ve besin konsantrasyonları önemli ölçüde biyofilm ve sıvı ve daha biyofilm 2 içinde tükenen çevreleyen arasındaki arayüzde azalır. Biyofilm solunum ve protein sentezinde Mekansal varyasyonları da lokalize oksijen ve besin durumu 2 yanıt olarak oluşabilir.
Sucul ve toprak ortamlarında, çoğu bakteri biyofilmlerde yaşamak. Doğal biyofilm karbon ve azot bisiklet ve metaller 4,5 azaltarak gibi önemli biyokimyasal süreçlerini yürütmek. Klinik, biyofilm oluşumu tepk olduğunuUzun süreli akciğer ve üriner enfeksiyonlar 6 ible. Biyofilmlererde hücreler planktonik muadillerine göre 6 antibiyotiklere son derece yüksek direnç var çünkü biyofilm ilişkili enfeksiyonlar oldukça sorunludur. Biyofilm farklı ortamlarda önemli olduğundan, araştırma önemli bir miktarda biyofilm faaliyetleri ve biyofilm mekansal heterojenlik ve çevredeki mikroortam kontrol çevresel faktörleri anlamaya odaklanmıştır.
Önceki çalışmalar, biyofilm geliştirme; çevresel bir dizi faktöre göre düzenlenir olduğunu bulduk: biyofilm çeşitli akış koşullarında farklı morfolojiler geliştirilmesi; oksijen ve besin kullanılabilirliği etkisi biyofilm morfolojisi; ve hidrodinamik kayma gerilmesi yüzeylere planktonik hücreler eki ve biyofilm 7-9 hücrelerinin ayrılmasını etkiler. Ayrıca, dış akış durumu yüzeyler int teslim etkilero ve biyofilm 10 içinde. biyofilm büyüme de fiziksel ve kimyasal koşulları çevredeki değiştirir. Örneğin, biyofilm büyüme oksijen ve besin 2 yerel tükenmesine yol açar; biyofilm çevresini 11 inorganik ve organik bileşikler birikir; ve biyofilm kümeleri akış ve artış yüzey sürtünmesi 12,13 yönlendirir. Biyofilm onların çok karmaşık yollarla çevreyi saran etkileşim nedeniyle, aynı anda biyofilm özellikleri ve çevre koşulları hakkında bilgi edinmek için kritik ve çok disiplinli yaklaşımlar kapsamlı biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek için kullanılması gerekmektedir.
Burada bir uygulanan besin derecesinde mono- türler ve ikili türler biyofilm içindeki mikrobik büyüme uzamsal desen karakterize etmek ve yerel kimyasal ve sıvı mikro-elde edilen modifikasyon gözlemlemek için entegre yöntem bir dizi sunulmuştur. Biz köknarst iyi tanımlanmış kimyasal geçişlerini altında biyofilm büyüme gözlemlemek için bir süre önce geliştirilen çift giriş mikroakışkan akış hücresinin kullanımını tarif. Daha sonra beslenme koşulları kümesi altında biyofilm bakteri, Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli, iki türün gelişimini izlemek için bu mikro-akışkan akış hücresinin kullanımını göstermektedir. Biz biyofilm koloniler halinde floresan izleyici yayılma yerinde görselleştirme nicel Biyofilmlererde çözünen ulaşım modellerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, biz konfokal mikroskobu altında yapılan mikro parçacık izleme velosimetri, büyüyen biyofilm etrafında yerel akış alanını elde etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyofilm kimyasal geçişlerini yanıt, çevredeki akış mikroçevre üzerinde biyofilm büyüme ve iç ulaşım sınırlamaları kaynaklanan biyofilm heterojenite etkileri: Biz üç önemli biyofilm-çevre etkileşimlerini karakterize etmek yöntemler paketi gösterdi.
İlk biyofilm gelişimi için iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı empoze etmek için yeni bir mikro-akışkan akış hücresinin kullanmıştır. Akış hücresi içinde, bir iyi tanımlanmış kimyasal gradyanı üretmek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz P sağlamak için Washington Üniversitesi (Seattle, WA) Matt Parsek teşekkür aeruginosa, E. Akarsular yazılıma erişim sağlamak için Canterbury (Yeni Zelanda) Üniversitesi'nde coli suşları ve Roger Nokes. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R01AI081983 tarafından desteklenmiştir. Konfokal görüntüleme Kuzeybatı Biyolojik Görüntüleme Tesisi (BIF) gerçekleştirildi.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
