Abstract
Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.
Introduction
Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas - agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero 1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular 2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula 2. Las variaciones espaciales en la respiración de biopelículas y la síntesis de proteínas también pueden ocurrir como respuesta al oxígeno localizada y la disponibilidad de nutrientes 2.
En los ambientes acuáticos y del suelo, la mayoría de las bacterias viven en los biofilms. Biofilms naturales llevan a cabo importantes procesos biogeoquímicos incluyendo el ciclo del carbono y nitrógeno y reduciendo metales 4,5. Clínicamente, la formación de biopelículas es responsble para pulmonar prolongada e infecciones urinarias 6. Infecciones biofilm asociado son muy problemático porque las células en biofilms tienen muy alta resistencia a los antimicrobianos en comparación con sus homólogos planctónicas 6. Debido a que las biopelículas son importantes en diversos entornos, una cantidad sustancial de investigación se ha centrado en la comprensión de los factores ambientales que controlan las actividades de biofilm y la heterogeneidad espacial en biofilms y el microambiente que rodea.
Estudios previos han encontrado que el desarrollo de biopelículas está fuertemente regulada por una serie de factores ambientales: biopelículas se desarrollan diferentes morfologías en diversas condiciones de flujo; oxígeno y nutrientes disponibilidad influencia morfología de la biopelícula; y la tensión de cizallamiento hidrodinámico afecta a la unión de las células planctónicas a las superficies y el desprendimiento de las células de las biopelículas 7-9. Por otra parte, el estado de flujo externo influye en la entrega de los sustratos into y dentro de los biofilms 10. El crecimiento de biofilms también altera rodea condiciones físicas y químicas. Por ejemplo, el crecimiento de biopelículas conduce a la reducción local de oxígeno y nutrientes 2; biofilms se acumulan compuestos inorgánicos y orgánicos desde el ambiente circundante 11; y grupos de biofilm desvían el flujo y el aumento de superficie de fricción 12,13. Debido a que las biopelículas interactúan con su entorno de maneras muy complejas, es fundamental para obtener simultáneamente información sobre las propiedades del biofilm y las condiciones ambientales, y los enfoques multidisciplinarios necesita ser utilizado para caracterizar exhaustivamente interacciones biofilm y medio ambiente.
Aquí les presentamos una serie de métodos integrados para caracterizar los patrones espaciales en el crecimiento microbiano en mono-especies y biofilms de doble especies bajo un gradiente nutricional impuesta, y observar la consiguiente modificación de la química local y microambiente fluido. Nos FIRst describen el uso de una celda de flujo microfluídico de doble entrada recientemente desarrollado para observar el crecimiento de biopelícula bajo gradientes químicos bien definidos. A continuación, demuestran el uso de esta celda de flujo de microfluidos para observar el crecimiento de dos especies de bacterias, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, en biofilms bajo un rango de condiciones nutricionales. Se muestra cómo en la visualización in situ de propagación trazador fluorescente en colonias de biopelícula puede ser utilizado para evaluar cuantitativamente los patrones de transporte de solutos en biofilms. Por último, se muestra cómo microescala velocimetría de seguimiento de partículas, realizado con microscopía confocal, se puede utilizar para obtener el campo de flujo local alrededor de las biopelículas que crecen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Configuración de la célula 1. Flujo y Inoculación
NOTA:. Utilice una celda de flujo de microfluidos de doble entrada se describe en Song et al, 2014 14 para crecer biopelículas. Esta celda de flujo es capaz de crear gradientes químicos lisas bien definidos. El diseño de la célula de flujo se muestra en la figura 1 y el flujo de fabricación de células se ha descrito anteriormente en Song et al., 2014 14. Aquí detalle nuestros métodos mediante el uso de P. aeruginosa y E. coli para formar biopelículas, pero otras especies puede ser adecuado también. Se utilizó P. aeruginosa PAO1- gfp, que expresa constitutivamente una proteína fluorescente verde (GFP), como un organismo modelo para el desarrollo de biopelículas. Además, se utilizó E. coli DH5a para formar biopelículas de especies mixtas con P. aeruginosa. P. aeruginosa y E. cepas de E. coli se cultivaron en placas de agar LB.
- Prepare la celda de flujo usando polidimetilsiloxano (PDMS) unido a uncubreobjetos de vidrio a través del tratamiento con plasma de oxígeno como se describe en 14. Las dimensiones de la cámara de celda de flujo son 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longitud x anchura x profundidad).
- Preparar modificado medio de crecimiento FAB 15. Para observar el crecimiento de biopelícula bajo un gradiente nutricional dentro de la celda de flujo, la introducción de Fab modificado medio 15 con glucosa 0,6 mM en una entrada y introducir medio FAB sin ninguna fuente de carbono a través de la otra entrada. Filtro-esterilizar (tamaño de poro = 0,2 micras) la solución de glucosa de valores (60 mM) antes de añadir al medio de FAB. También autoclave el medio FAB con el ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes de su uso.
- Esterilizar el sistema de flujo. Antes de la inoculación, autoclave toda la trayectoria de flujo (botellas medianas, tubos, trampas de burbujas, las células de flujo) usando el ciclo 1, a excepción de las válvulas de tres vías de plástico desechables (y pre-esterilizados) situados aguas arriba de la celda de flujo. (Válvulas de tres formas se utilizan para inyectar células cultura, trazador fluorescente y microperlas.) Para evitar la contaminación durante el montaje, cubre todas las aberturas de tubos y conectores con papel de aluminio o bolsas de autoclave antes de la esterilización en autoclave.
- Conectar el sistema de flujo. Montar los componentes del sistema de celda de flujo cuidadosamente (ver video para el montaje sistema de flujo) y entregar medio de crecimiento a la célula de flujo a través de una bomba peristáltica que controla con precisión la velocidad de flujo.
- Preparar el cultivo de células para la inoculación mediante la transferencia de una colonia de P. aeruginosa o E. coli a partir de placas de LB a 3 ml de caldo LB y agitar el cultivo O / N a 225 rpm y 37 ° C. Diluir los cultivos de células S / N en 1 ml esterilizados agua a una DO final 600 = 0,01 como el inóculo. (Cultura y diluir las bacterias en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.)
- Para los experimentos con las biopelículas de especies mixtas, diluir los dos cultivos bacterianos a una relación de 1: 1 en 1 ml con una DO 600 = 0,01 equivalente para cada bacteria.
- Inocular la celda de flujo. Inyectar 1 ml de inóculo a la entrada de la celda de flujo de la válvula de tres vías. Después de la inyección, una pausa en el flujo durante 1 hora para permitir que las células bacterianas que se adhieren a la cubierta de vidrio. (Asegúrese de que la celda de flujo se coloca con el lado cubreobjetos hacia abajo para permitir que las células suspendidas se asienten en el cubreobjetos.)
- Después de 1 hr, reanudar el flujo y bombear el medio de crecimiento a la célula de flujo a una velocidad constante de 0,03 ml / min para cada entrada durante 3 días.
2. Caracterización de Biofilm Desarrollo en respuesta a gradientes de nutrientes Utilizando Microscopía Confocal
NOTA: P. aeruginosa se pueden obtener imágenes con GFP expresada constitutivamente, pero E. coli en las biopelículas de especies mixtas debe ser imaginada por counterstaining.
- Tenga en cuenta las biopelículas de 3 días usando microscopía confocal. Para los resultados representativos, observar biofilms utilizando un microscopio confocal con un objetivo 63X. Antes de la proyección de imagen, marcala célula de doble entrada de flujo con una rejilla en el lado de cubierta de vidrio. (El propósito de esta rejilla es permitir que el experimentador para localizar las regiones de formación de imágenes dentro de la cámara de la celda de flujo.)
- Para contrateñir, diluir 10 l de rojo fluorescente colorante de ácidos nucleicos de células permeante, tales como mancha nucleico fluorescente verde ácido, tal como STYO 62, solución madre (1 mM) en 990 l de agua esterilizada y luego inyectar lentamente la mancha diluida utilizando una jeringa en la cámara de la celda de flujo de la válvula de tres vías aguas arriba. Mantenga la celda de flujo estancado y en la oscuridad durante 30 min, luego reanudar el flujo para lavar la mancha no unida durante 15 min.
- Realizar imagen confocal. Active el 488 nm láser de argón para la excitación y la emisión de canales de recogida de las buenas prácticas agrarias (500-535 nm) y la mancha de ácido nucleico (por colorante de ácidos nucleicos fluorescente verde, 650-750 nm). Ajustar las ganancias y las compensaciones para los dos canales para tener imágenes brillantes y limpias. Seleccione xyz y el modo de imágenes simultáneas. Utilice el mando de control de z para identificar la parte inferior y la parte superior de la biopelícula en el campo. Ajuste el z-paso para 0,5 micras para la adquisición de una imagen pila 3-D. (Para garantizar una alta calidad de imagen, utilice un promedio de la línea de cuatro para la adquisición de imágenes.)
- Para asignar los patrones espaciales de desarrollo de la biopelícula dentro de la celda de flujo, las biopelículas de la imagen en tres o más longitudinal (x) las distancias a lo largo de la entrada de la celda de flujo, y a las tres transversal (y) posiciones relativas al gradiente nutricional impuesta, como se muestra en la Figura 1 .
3. Caracterización de solutos Interna Transporte por inyecciones de trazador fluorescente Conservador
NOTA: Un indicador fluorescente conservador, como Cy5, puede ser utilizado para caracterizar los patrones de transporte de solutos dentro de la biopelícula.
- Disolver Cy5 (Mono-reactiva NHS Ester) en agua a una concentración final de 10 mg / ml como una solución madre. La solución madre, Cy5 en un congelador a -20ºC.
NOTA: Como Cy5 es luz-sensitive, almacenar, diluir e inyectar soluciones Cy5 en la oscuridad. - Antes de las inyecciones de trazador fluorescente, tomar una imagen de la pila 3-D de la biopelícula de 3 días con la microscopía confocal (con un objetivo 63X). (Regiones anchas de colonias biofilm son ideales para las observaciones de series de tiempo de transporte de tinte.) También elegir un plano z con colonias bien separadas para imágenes (como se muestra en la Figura 5A).
- Para cada experimento de inyección Cy5, diluir 2 l de la solución madre Cy5 en 998 l de agua esterilizada para producir una solución de inyección que tiene una concentración Cy5 de 20 mg / ml.
- Parar la bomba para pausar el flujo e inyectar la solución en el Cy5 aguas arriba de la celda de flujo usando una jeringa a través de la válvula de 3 vías. (Es importante para evitar las burbujas de aire entren en la trayectoria de flujo mientras se inyecta. Trampas de burbujas deben mantenerse abierta durante la inyección de nuevo.)
- Después de inyectar la solución Cy5, cerrar las trampas de burbujas, ajuste la válvula de 3 vías, y reinicie elbomba para suministrar la solución Cy5 se inyecta en la celda de flujo.
- Cambiar el modo de imagen confocal para XYT. Activar canales Cy5 y GFP bajo el modo de imágenes simultáneas. Ajustar la configuración confocal en intensidad Cy5 (intensidad del láser, la ganancia y offset) para evitar la saturación de señales, lo cual es crítico para la cuantificación. (Se prefiere alta resolución temporal para la visualización de penetración del colorante. Sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.) Elija la velocidad de exploración adecuada y media línea para equilibrar el tiempo de resolución de la imagen y la calidad de imagen. Para este protocolo utilizar un promedio de la línea de cuatro y una velocidad de 0,15 Hz.
- Reanudar el flujo para entregar Cy5 en la célula de flujo (todavía a un caudal de 0,03 ml / min). Al mismo tiempo la hora de inicio de la serie de imagen confocal.
- Cuantificar la penetración Cy5 por radialmente promedio de intensidad Cy5 dentro de una colonia biofilm circular 2-D. Para promedio, primero identificar el borde de un clúster de biofilm, a continuación, generar un mapa de distancia para una sección de 2-D de la agrupaciónY, finalmente, los patrones radiales promedio de las intensidades de Cy5 para generar una curva de penetración (véase la figura 6).
- Para darse cuenta computacionalmente paso 3.8, utilice Biospa (Análisis del patrón espacial Biofilm) paquete de software (no publicado, paquete de software y manual disponibles bajo petición) u otros programas de análisis de imágenes.
- Para utilizar Biospa, primero importar una imagen definida en Biospa. A continuación, seleccione el umbral adecuado para los canales de las buenas prácticas agrarias y Cy5 para que las imágenes binarias. En el menú de análisis / cálculo, seleccione Análisis Avanzado y luego Análisis Difusión. Utilice el canal de las buenas prácticas agrarias para definir el borde de un clúster y utilizar la herramienta de polígono para seleccionar un clúster como la región de interés (ROI).
- Haga doble clic en el cluster biofilm seleccionado para realizar el análisis de la difusión. Guardar los resultados del análisis de difusión y calibrar la intensidad de Cy5 a la concentración de Cy5 usando una curva de calibración.
- Para generar Cy5 curva de calibración de concentración, medir intensidades de Cy5 sobre un conce Cy5gradiente ntration bajo microscopía confocal. (Intensidad Cy5 y la concentración tienen una relación lineal.)
4. Caracterización de la Rodeando Flow Field de Seguimiento fluorescente Partículas
NOTA: Las partículas fluorescentes, como microperlas fluorescentes, se puede utilizar para caracterizar el campo de flujo alrededor de las biopelículas. Campo de flujo alrededor de biofilms puede calcularse a partir de las observaciones de series de posiciones de las partículas que utilizan el software de seguimiento de partículas velocimetría. Los resultados mostrados aquí fueron obtenidos con el software Streams 2.02 paquete de 16 (descarga de software y guía del usuario disponible en http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).
- Diluir las microperlas fluorescentes (diámetro ~ 1 mM) en agua esterilizada a una concentración de sólidos final de 0,2% y un volumen final de 0,5 ml. Vortex para asegurarse de que las microperlasson bien dispersado.
- Inyectar y entregar las microperlas fluorescentes diluido en la celda de flujo siguiendo los procedimientos de los pasos 3.3 a 3.5. Para permitir un seguimiento preciso de la trayectoria de la partícula, utilice una tasa relativamente baja de flujo (0,01 ml / h para los resultados de rastreo de partículas en este documento).
- Cambie la configuración confocal al modo XYT para seguir el movimiento de las partículas en un z-slice y tomar imágenes de series de tiempo. (A la velocidad de fotogramas de 1 Hz se utilizó para los resultados representativos que se muestran en este documento.) Repetir la inyección de partículas y la imagen en diferentes lugares z para generar flujo de campo 3-D.
- Pre-proceso de la serie temporal de imágenes confocal restando la señal de fluorescencia de fondo (la señal en la primera imagen adquirida del conjunto de imágenes) utilizando ImageJ (descargar el software y el manual disponible en http://imagej.nih.gov/ij/ ) u otros programas.
- En ImageJ, abrir la primera imagen de un conjunto de imágenes y luego importar el conjunto de imágenes. Bajo Proceso / Imagen Calculator, reste la primera imagen de la imagen de conjunto. Guarde el conjunto de imágenes pre-procesado.
- Para calcular los vectores de flujo, la importación de series de tiempo confocal de imágenes en Streams 2.02. En "vista del proceso abierto", seleccionar y ejecutar "Identificar partículas". Utilice umbral adecuado para identificar partículas. Utilice 0,5 y 5 micras de diámetro como umbrales mínimos y máximos de 1 micras partículas.
- A continuación, en "vista del proceso abierto", seleccionar y ejecutar "análisis de tuberías PTV" para generar trayectorias de las partículas. Compruebe las trayectorias de las partículas para ver si representan el movimiento de las partículas. Por último, seleccionar y ejecutar "Crear campo de velocidad" para generar un mapa vectorial de flujo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La celda de flujo microfluídico de doble entrada permite la observación del crecimiento del biofilm en virtud de un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. El gradiente químico resultante se observó anteriormente por inyección de colorante y caracteriza en detalle por Song et al. 14. Gradientes de concentración lisas se formaron en la dirección transversal, como se muestra en la Figura 1. El perfil de concentración era empinada cerca de la entrada y consiguió relajó aguas abajo debido a la difusión (Figura 1). Para observar el desarrollo de biopelículas bajo un gradiente nutricional, se utilizó un medio definido mínima de crecimiento (medio FAB) con glucosa añadido sólo a una entrada como la única fuente de carbono. Esto produjo un gradiente de glucosa en la cámara de la celda de flujo, mientras que todos los otros nutrientes se distribuyeron homogéneamente. El crecimiento de P. biofilms aeruginosa PAO1 fue fuertemente correlacionada con la administración local de la glucosa (Figura 2).Como el gradiente de concentración de glucosa transversal era empinada cerca de la entrada, la biomasa de biopelícula mostró una disminución dramática de la región de alta glucosa a la región de baja glucosa. Como el gradiente de glucosa transversal relajado aguas abajo, la biomasa de biopelícula se hizo más homogénea. Además, demostró el uso de esta celda de flujo para estudiar las interacciones de P. aeruginosa y E. coli en biofilms bajo un gradiente de glucosa (Figura 3). Los resultados mostraron que estas dos especies mostraron patrones espaciales distintos en crecimiento relativo al gradiente nutricional, y por lo tanto ocupan nichos ecológicos diferentes: P. aeruginosa dominado biomasa biopelícula en regiones con altas concentraciones de glucosa y E. coli dominado en regiones con bajas concentraciones de glucosa (Figura 3).
Para entender la retroalimentación entre el crecimiento de biopelículas y el medio ambiente que rodea el flujo, que caracteriza el campo de flujo alrededor creciente biopelículas de fluorescente velocimetría de seguimiento de partículas menores de microscopía confocal. El movimiento observado de las microperlas fluorescentes inyectados se muestra en la película 1. información del vector de flujo local se extrajo de un promedio de al menos 4.200 mediciones discretas de velocidades de las partículas utilizando el paquete de software corrientes. Mapeo tridimensional del campo de flujo se obtuvo mediante el seguimiento de partículas en múltiples posiciones verticales (Figura 4). El crecimiento de biopelículas aumentado significativamente la heterogeneidad de flujo (Figura 4). Flujo cerca de la base del biofilm desviado alrededor racimos biofilm, lo que aumenta la heterogeneidad y la disminución de la velocidad (Figura 4). Flujo en la parte superior biofilm tiene mayor velocidad y es más homogénea (Figura 4).
Para entender la heterogeneidad interna causada por el transporte de solutos limitada dentro de los biofilms, observamos el transporte de Cy5 dentro de los biofilms por microscopía confocal. Penetración de series de tiempode Cy5 en un racimo de biopelículas se muestra en la película 2. Las series cronológicas de Cy5 curvas de penetración se muestra en la película 3. El coeficiente de difusión efectiva de Cy5 en las biopelículas se calculó mediante la instalación de un modelo de difusión 1-D para los perfiles de concentración Cy5:
donde C es la concentración Cy5 radialmente promediada calculada a partir de la intensidad de fluorescencia, y es la distancia en el biofilm 17. Cy5 mostró la mayor concentración en el flujo a granel y disminuyó abruptamente al entrar en el biofilm (Figura 5).
Figura 1. celda de flujo de microfluidos de doble entrada. Degradados suaves glucosa se crean dentro de la cámara de flujo mediante la introducción de medio FAB a las dos entradas con una fuente de carbono (gluco se) proporciona sólo en una entrada. Resultando patrones de glucosa dentro de la celda de flujo se indican mediante sombreado. Sombreado oscuro representa las concentraciones de glucosa más altos. Formación de imágenes confocal se realizó en nueve ubicaciones en la celda de flujo. Los resultados presentados en las Figuras 2 y 3 se refieren a los lugares numerados 1-9 en la figura. Esta cifra se modifica después de Song et al. (2014), Fig. 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. PAO1 crecimiento biofilm bajo gradientes de glucosa. De 3 días biofilms PAO1 fueron imágenes a las 9 ubicaciones que se muestran en la Figura 1. Espaciado de cuadrícula = 18 micras para una imagen 8.1 y 24 micras para una imagen 9.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El desarrollo de P. aeruginosa y E. Coli biofilms de doble especies menores gradientes de glucosa. P. aeruginosa expresa constitutivamente GFP, y las biopelículas también se contratiñeron por SYTO 62, que es un colorante de ácidos nucleicos general. Las imágenes mostradas aquí son superposiciones de GFP (verde) y SYTO 62 (rojo) canales. P. por lo tanto aeruginosa aparece en verde o amarillo (verde + rojo), y E. coli aparece roja. Las barras de escala = 47 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Campos Figura 4. Flujo del vector de velocidad en z = 4, 10 y 16 m alrededor de un clúster de biofilm. La longitud de la flecha representa la magnitud de la velocidad. Baja velocidad de flujo muestra en la base de biopelículas (z = 4, flechas azules). El flujo es más homogénea cerca de la cima de biopelículas (z = 16, flechas rojas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cy5 penetración en los biofilms. (A) Confocal micrografía en z = 18 micras mostrando penetración parcial de Cy5 en grupos de biofilm en t = 190 seg. Las barras de escala = 10 m. (B) resultante patrones de Cy5 mapa concentración. (C) perfil de concentración Cy5 en un clúster de biofilm. 602fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Procedimientos para generar un perfil de penetración Cy5 Izquierda:. ROI seleccionada que contiene un clúster de biofilm 2-D. Mapa Distancia del cluster biofilm: Medio. Derecha: perfil de intensidad Cy5 radialmente promediada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Película 1 : Movimiento de partículas fluorescentes inyectado alrededor de racimos biofilm (video confocal).
Película 2 : Propagación de Cy5 en grupos biofilm (video confocal).
_content "> Movie 3 : Propagación de Cy5 en grupos biofilm (perfiles de concentración de vídeo).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno.
En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para generar un gradiente químico bien definida dentro de la celda de flujo, es importante para mantener la misma velocidad de flujo para ambas entradas. Asegúrese de que la bomba peristáltica está bien ajustado para ambos canales de flujo para entregar el medio de cultivo a la misma velocidad. También asegúrese de que no hay obstrucción en la trayectoria del flujo durante el crecimiento de biopelículas. Observaciones del crecimiento de biofilms de doble de especies en este espectáculo celda de flujo que los gradientes químicos afectados en gran medida el crecimiento de biopelículas y las interacciones entre especies dentro de los biofilms. Los gradientes químicos son comunes enambientes donde crecen las biopelículas, debido a una combinación de limitaciones de transporte, unión química y reacciones, y la captación y el metabolismo microbiano 18-20. Esta celda de flujo de microfluidos permite investigaciones de diversas actividades biofilm bajo un rango definido de condiciones químicas dentro de un único dispositivo. Por ejemplo, esta celda de flujo ha demostrado ser útil para el estudio de la matanza biofilm en virtud de un gradiente de 14 antimicrobiano.
Luego comprobó el uso de velocimetría de seguimiento de partículas para observar el campo de flujo en torno a grupos de biopelícula. Para garantizar un seguimiento preciso de las partículas fluorescentes inyectadas, la velocidad de flujo necesita ser optimizado. Por lo general, bajo caudal permite que el movimiento de las partículas que se capturará en el campo confocal de vista. También la velocidad de fotogramas de escaneo debe ser optimizado para equilibrar la calidad de imagen y resolución de tiempo. Si las partículas se mueven demasiado rápido para capturar el movimiento, utilizar la línea de más baja o media de trama o increvelocidad de exploración ase. Hemos trazado el campo de flujo en tres posiciones verticales sobre un cúmulo de biopelículas, y encontramos que el crecimiento de biopelículas aumentó la heterogeneidad de flujo. La caracterización del campo de flujo alrededor de biofilms permite interacciones clave-biopelícula de flujo para ser explorados. Por ejemplo, esto puede ser usado para evaluar los mecanismos que regulan la fricción del fluido y de cizallamiento sobre el biofilm, y el fracaso biofilm resultante y desprendimiento de las células de la superficie de 1,21. Estos procesos son importantes para la comprensión tanto de los efectos de las biopelículas en sistemas de flujo (por ejemplo, la contaminación biológica) y la regulación de la biopelícula morfología 8. Condiciones de flujo alrededor de biopelículas también controlan el transporte de masa, que es importante para una amplia gama de procesos de biopelículas. Por ejemplo, la velocidad del fluido local en la superficie biofilm influye en el suministro de nutrientes y sustratos a través de biofilms advección 22.
Por último, puso de manifiesto el uso de la inyección de trazadores fluorescentes para analizarlos patrones de transporte de solutos dentro del biofilm. Utilizamos Cy5 aquí como un trazador conservativo, y esto fluor parece comportarse menudo conservadora en biofilms 23. Por lo tanto los resultados deben ser representativos de los patrones de transporte de solutos no reactivos y neutros en biofilms. Los resultados mostraron una disminución pronunciada de la concentración de Cy5 cerca de la superficie biofilm, produciendo una concentración Cy5 en el interior de la biopelícula sólo ~ 50% de la concentración en el flujo a granel. Dichos perfiles de concentración empinadas son consistentes con las mediciones reportadas previamente de oxígeno, nutrientes y antibióticos dentro de los biofilms 2,24. Curvas de penetración Cy5 proporcionan información sobre la difusión de solutos en racimos biofilm. Sin embargo, el método que aquí presentamos se limita a analizar el transporte de solutos 2-D en (XY) planos horizontales en los biofilms. Con la capacidad de formación de imágenes rápida más reciente, por ejemplo girando la microscopía confocal de disco, la penetración de tinte puede también ser visualizado en 3-D dentro de los biofilms, WHIch permitirá una investigación sobre los procesos de transporte vertical. Además, trazador fluorescente y las partículas pueden ser inyectados conjuntamente para obtener información de las condiciones de flujo externo y el transporte de solutos interna al mismo tiempo. Esta información es útil para diferenciar el transporte de solutos advectivo y difusivo entre flujo mayor y biofilms y para evaluar el efecto del flujo externo en el transporte de solutos interna en los biofilms.
En general, se presentan protocolos detallados de la utilización de una novela celda de flujo de microfluidos que proporciona bien definido gradientes químicos para el estudio de las respuestas de biopelícula a señales químicas en el medio ambiente. Para caracterizar mejor la heterogeneidad en los biofilms y su microhábitat rodea, aquí presentamos métodos para caracterizar los patrones, tanto en el campo de flujo que rodea biofilms y transporte de solutos interna dentro de los biofilms. Cada método proporciona información sobre las propiedades del biofilm distintivo y / o las condiciones ambientales. Dado que estos métodosestán integrados, múltiples aspectos de la información se pueden obtener de forma simultánea. Información combinada permite a los investigadores para abordar problemas más complejos. Por ejemplo, mediante el uso de estos métodos, se analizaron con éxito el desarrollo de biopelículas y las interacciones entre especies en biofilms bajo un gradiente de nutrientes. Estos métodos también proporcionan capacidad experimental para aumentar la complejidad en la comunidad microbiana y el ambiente químico, lo que permite investigaciones sobre los procesos de biopelícula en un contexto más realista. Las aplicaciones potenciales de estos métodos abarcan diversos aspectos de la investigación de biopelículas, incluyendo ciclo de vida del biofilm, las biopelículas de múltiples especies, heterogeneidad biofilm, los procesos de transporte en las biopelículas, y la interacción de biopelículas de flujo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Damos las gracias a Matt Parsek en la Universidad de Washington (Seattle, WA) para proporcionar P. aeruginosa y E. cepas de E. coli y Roger Nokes de la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda) para proporcionar acceso a software Arroyos. Este trabajo fue apoyado por el subsidio R01AI081983 de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Confocal de imágenes se realizó en las instalaciones de la Northwestern Imaging Biológica (BIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| Pump Tubing 0.50 mm OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 ml TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters - sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
