Metoder för att karakterisera Co-utveckling Biofilm och Habitat Heterogen
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilmer är utanpå bifogade mikrobiella samhällen som har komplexa strukturer och producerar betydande rumsliga heterogeniteter. Biofilm utveckling är starkt reglerad av omgivande flödet och näringsmiljö. Biofilm tillväxt ökar också heterogenitet den lokala mikromiljön genom att generera komplexa flödesfält och lösta ämnen transportmönster. För att undersöka utvecklingen av heterogenitet i biofilmer och interaktioner mellan biofilmer och deras lokala mikro livsmiljö, växte vi mono-arter biofilmer av Pseudomonas aeruginosa och dual-arter biofilmer av P. aeruginosa och Escherichia coli enligt närings gradienter i ett mikroflödesflödescell. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att skapa närings gradienter inom flödescellen och för att odla och visualisera biofilm utveckling under dessa förhållanden. Vi har även aktuella protokoll för en serie av optiska metoder för att kvantifiera rumsliga mönster i biofilm struktur, flödes distribubutions över biofilmer och masstransport runt och inom biofilm kolonier. Dessa metoder stödjer omfattande undersökningar av gemensam utveckling av biofilm och livsmiljö heterogenitet.
Introduction
Mikroorganismer fäster ytor och bilda biofilmer – cellaggregat inneslutna i en extracellulär-polymermatris 1. Biofilmer beter väldigt annorlunda från enskilda mikrobiella celler, eftersom biofilmer har dramatiska rumslig heterogenitet följd av en kombination av interna begränsningar löst ämne transport- och rumsliga variationer i cellulär metabolism 2,3. Syre och näringskoncentrationer drastiskt minska i gränssnittet mellan biofilm och omgivande vätska och få utarmat ytterligare inom i biofilmen 2. Rumsliga variationer i biofilm andning och proteinsyntes kan också uppstå som en reaktion på lokal syre och näringsämnen tillgänglighet 2.
I akvatiska och markmiljöer, de flesta bakterier bo i biofilmer. Naturliga biofilmer utför viktiga biogeokemiska processer inklusive cykling kol och kväve och minska metaller 4,5. Kliniskt är biofilmbildning responsosynligt för långvarig pulmonell och urininfektioner 6. Biofilmrelaterade infektioner är mycket problematiskt eftersom celler i biofilmer har extremt hög motståndskraft mot antibiotika jämfört med deras plankton motsvarigheter 6. Eftersom biofilmer är viktiga i olika miljöer, har en betydande mängd forskning varit inriktad på att förstå de miljöfaktorer som styr biofilmaktiviteter och den rumsliga heterogenitet i biofilmer och omgivande mikromiljö.
Tidigare studier har visat att biofilm utvecklingen är starkt reglerat av ett antal miljöfaktorer: biofilmer utveckla olika morfologier under olika flödesförhållanden; syre och näringsämnen tillgänglighet inflytande biofilmen morfologi; och hydrodynamiska skjuvspänning påverkar fastsättning av planktonceller till ytor och avskiljandet av celler från biofilmer 7-9. Dessutom påverkar extern flödestillstånd leverans av substrat into och inom biofilmer 10. Tillväxten av biofilmer förändrar också omgivande fysiska och kemiska förhållanden. Till exempel leder biofilmtillväxten till lokal utarmning av syre och näringsämnen 2; biofilmer ackumuleras oorganiska och organiska föreningar från den omgivande miljön 11; och biofilm kluster avleda flöde och ökad friktion 12,13. Eftersom biofilmer samspelar med sin omgivning i mycket komplexa sätt, är det viktigt att samtidigt få information om biofilm egenskaper och miljöförhållanden, och tvärvetenskapliga metoder måste användas för att utförligt karaktärisera interaktioner biofilm-miljö.
Här presenterar vi en rad integrerade metoder för att karakterisera rumsliga mönster i mikrobiell tillväxt inom mono arter och biofilmer dubbla arter under en införde närings lutning, och att notera vilken modifiering av lokala kemiska och vätskemikromiljö. Vi first beskriver användningen av ett nyligen utvecklat dubbelinlopp mikroflödesflödescell för att observera biofilm tillväxt under väl definierade kemiska gradienter. Vi visar sedan användningen av denna mikroflödesflödescell för att observera tillväxt av två arter av bakterier, Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli, i biofilmer under vitt skilda näringsmässiga förhållanden. Vi visar hur in situ visualisering av fluorescerande spårämne förökning i biofilm kolonier kan användas för att kvantitativt bedöma mönster transport av lösta ämnen i biofilmer. Slutligen visar vi hur mikropartikelspårning Velocimetry, utförs under konfokalmikroskopi, kan användas för att få lokal flödesfält runt de växande biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visade en svit av metoder för att karakterisera tre viktiga biofilm-miljö interaktioner: biofilm svar på kemiska gradienter, effekter av biofilm tillväxt på den omgivande flödet mikromiljö, och biofilm heterogenitet följd av interna begränsningar transport.
Vi visade först att använda en ny cell mikroflödesflöde att införa en väldefinierad kemisk gradient för biofilm utveckling. För att generera en väldefinierad kemisk gradient i flödescellen, är det viktigt att bibeh?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Matt Parsek vid University of Washington (Seattle, WA) för att tillhandahålla P. aeruginosa och E. coli-stammar och Roger Nokes vid University of Canterbury (Nya Zeeland) för att ge tillgång till Streams mjukvara. Detta arbete stöddes av bidrag R01AI081983 från National Institutes of Health, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar. Confocal avbildning utfördes vid Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
