Biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子多式联运分子成像应用
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
多峰的，分子成像允许在使用多个互补的成像技术的蜂窝，亚细胞和分子水平的分辨率的生物过程的可视化。这些显像剂促进途径和机制在体内 ，这对提高诊断和治疗功效的实时评估。本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） – 一类新的药物用于在多峰分子成像应用。在纳米颗粒，荧光成像和磁共振成像（MRI）掺入所述成像模态，具有互补的特性。该PB纳米粒具有一个核-壳的设计，其中钆和锰离子在PB晶格的间隙空间内掺入产生MRI对比，二者T中1和T 2 -加权序列。该PB纳米粒涂覆有荧光抗生物素蛋白使用静电自如sembly，使荧光成像。该抗生物素蛋白涂覆的纳米颗粒修饰赋予分子的定位功能，以纳米颗粒的生物素化配体。纳米粒子的稳定性和毒性测定，以及它们的核磁共振驰豫。这些biofunctionalized PB纳米颗粒的多，分子成像能力，然后利用他们为荧光成像和体外分子MRI表现。
Introduction
分子成像是生物过程在细胞，亚细胞和分子水平1的非侵入性的和有针对性的可视化。分子成像允许样品保持其天然的微环境，而其内源性途径和机制实时进行评估。通常情况下，分子成像涉及小分子，大分子，或纳米粒子可视化，目标，和跟踪有关的生理过程的形式的外源成像剂被研究2的管理。已探索了在分子成像的各种成像方式包括MRI，CT，PET，SPECT，超声，光声学，拉曼光谱，生物发光，荧光和活体显微镜3。多峰成像是两种或多种成像模态，其中所述组合增强可视化和表征的各种生物过程和事件4的能力相结合。 Multimoda升成像利用的各个成像技术的优势，同时补偿其个人的局限性3。
本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） – 一类新的多峰分子成像剂。该PB纳米颗粒被用于荧光成像和分子MRI。 PB是颜料由交替铁（II）和铁（III）中的原子面心立方网络（ 图1）。该PB晶格是由在铁二线性氰化物配体- CN -铁三连杆并入阳离子来平衡其三维网络5内的收费。 PB的掺入阳离子成其晶格的能力是由分别装入钆和锰离子进入该PB纳米粒为MRI造影利用。
对于追求纳米设计的MRI造影的基本原理是因为优点这种设计提供了相对于目前的MRI造影剂。美国FDA批准的MRI造影剂的绝大多数是钆螯合物是顺磁性的性质，并提供正的对比度的自旋-晶格松弛机构6,7,8。相比于单钆螯合物，具有低信号强度在其自己的，纳米颗粒的该PB晶格内的多个钆离子的掺入提供了增强的信号强度（阳性对照）3,9。此外，多个钆离子的PB晶格内的存在增加了整体的自旋密度和纳米颗粒的顺磁性的幅度，这扰乱在其附近的局部磁场，从而产生负反差的自旋 – 自旋松弛机理。因此，含钆纳米粒子两者的作用为T 1（正）和T 2（负）的造影剂10,11。
患者肾功能受损的一个子集，钆造影剂的管理已与肾系统纤维化8,12，13的发展。这一发现促使调查使用替代顺磁离子造影剂的MRI。因此，纳米颗粒的多功能设计适于该PB晶格内掺入锰离子。类似于钆螯合物，锰螯合物也顺磁性，并且通常用来提供正信号强度中的MRI 7,14。作为与含钆PB纳米粒，含锰PB纳米粒也起到为T 1（正）和T 2（负）的造影剂。
掺入 荧光成像能力，所述纳米颗粒“核”涂有“生物功能”外壳组成的荧光标记的糖蛋白抗生物素蛋白（ 图1）。抗生物素蛋白不仅使荧光成像，而且也作为一个对接平台，针对特定的细胞和组织的生物素化的配体。该抗生物素蛋白-生物素键是其特征在于抗生物素蛋白和生物素15之间非常强的结合亲和力最强已知的，非共价键中的一个。生物素化配体与抗生物素蛋白包被的纳米颗粒的PB附着赋予分子的定位功能，在PB纳米颗粒。
动机使用PB纳米粒追求荧光和磁共振成像是因为这些成像模式具有互补的特点。荧光成像是一种最广泛使用的光学分子成像技术之一，并且允许对多个对象中的高灵敏度1,16,17同时可视化。荧光成像是一种安全，无创方式，但与普及率低的深度和空间分辨率1,3,16有关。另一方面，MRI产生高时间的二维空间分辨率非侵入和而不需要电离辐射1,3,16。然而磁共振患有低灵敏度。因此荧光成像和MRI被选定作为分子成像技术由于穿透深度，灵敏度和空间分辨率它们的互补特征。
本文介绍了协议的PB纳米颗粒的合成和biofunctionalization，PB纳米颗粒（GdPB）和含钆PB纳米颗粒（MnPB）10,11含锰。以下方法描述：1）测量的大小，电荷，和纳米颗粒的经时稳定性，纳米颗粒，MRI弛豫3）测定的细胞毒性的2）的评价，和4）利用所述纳米粒子为荧光和分子MR成像的的靶细胞在体外的群体。这些结果表明了纳米颗粒的电势用作体内多峰的，分子成像剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出的方法为一类新的基于biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的多峰分子成像剂的合成。掺入纳米颗粒中的分子成像模式是荧光成像和分子MRI检查，由于它们的互补特征。该biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子具有核 – 壳设计。在这些纳米颗粒的合成中的关键步骤是：1）一釜合成这产生了被包括普鲁士蓝纳米颗粒的核心（PB NPS），含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB），或含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB），2?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- . . Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do’s and don’t’s. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. . Duke Review of MRI Principles. 304, 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
