Abstract
Modlu, moleküler görüntüleme birden, tamamlayıcı görüntüleme teknikleri kullanılarak, hücresel hücre içi ve moleküler seviyede çözünürlüklerde biyolojik süreçlerin görselleştirme sağlar. Bu görüntüleme ajanları, diyagnostik ve terapötik etkinliği arttırmak, in vivo olarak yollar ve mekanizma, gerçek zamanlı bir değerlendirme kolaylaştırır. Multimodal, moleküler görüntüleme uygulamalarında kullanılmak için ajanlar yeni bir sınıfının - Bu madde biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi (PB Nps) 'daki protokole sunulur. nanopartiküller, floresan görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) dahil görüntüleme yöntemleri, tamamlayıcı özelliklere sahip. PB NPler gadolinyum ve manganez iyonlarının T 1 ve T 2 -ağırlıklı sekansları, hem PB kafesinin ara boşluklar içine dahil MRT-kontrast oluşturmak bir çekirdek-kabuk tasarıma sahiptir. PB NPS elektrostatik kullanarak floresan avidin ile kaplanmıştır kendini olarakFloresan görüntülenmesine olanak sağlar onel. Avidin kaplı nanopartiküller nanopartiküller moleküler hedef yetenekleri veren biyotinlenmiş ligandları ile tadil edilmiştir. nanopartiküllerin istikrar ve toksisite kendi MRG relaksivitelerine yanı sıra, ölçülür. Bu biofunctionalized PB NPlerin multimodal, moleküler görüntüleme yetenekleri daha sonra floresan görüntüleme ve in vitro moleküler MR için bunları kullanarak gösterilmiştir.
Introduction
Moleküler görüntüleme hücresel, subsellüler biyolojik süreçler ve moleküler seviyede 1 non-invaziv ve hedeflenen görselleştirme. Moleküler görüntüleme endojen yollar ve mekanizmalar gerçek zamanlı olarak değerlendirilirken doğal mikro-kalmasına bir örnek verir. Tipik olarak, moleküler görüntüleme 2 çalışılan görselleştirmek hedef ve ilgili fizyolojik süreçleri izlemek için küçük bir molekül, makromolekül, veya nanopartikül formunda bir dışsal görüntüleme ajanın verilmesini içerir. moleküler görüntüleme araştırılmıştır olan çeşitli görüntüleme yöntemleri MR, CT, PET, SPECT, ultrason, photoacoustics, Raman spektroskopisi, ışıldaması, floresan ve intravital mikroskopi 3 içerir. Multimodal görüntüleme kombinasyonu görselleştirmek ve çeşitli biyolojik süreçleri ve olayları 4 karakterize yeteneğini geliştirir, iki veya daha fazla görüntüleme yöntemlerinin birleşimidir. Multimodabireysel sınırlamalar 3 telafi ederken l görüntüleme, bireysel görüntüleme tekniklerinin güçlü patlatır.
Multimodal, moleküler görüntüleme maddeleri için yeni bir sınıf - Bu madde biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi (PB Nps) 'daki protokole sunulur. PB NPS floresan görüntüleme ve moleküler MR için kullanılmaktadır. PB yüzey merkezli kübik ağ demir (II) ve demir (III) atomu alternatif oluşan bir pigment (Şekil 1). CN - - üç boyutlu ağın 5 içindeki ücretleri dengelemek için katyonları içerir Fe III bağlantısı PB kafes Fe II lineer siyanür ligandların oluşmaktadır. onun kafes içine katyonları dahil PB yeteneği ayrı ayrı MRG kontrast PB NPlerin içine gadolinyum ve manganez iyonları yüklenerek istismar edilmektedir.
MRG kontrast bir nanoparçacık tasarım peşinde gerekçesi nedeniyle olduğunuavantajları bu tasarım mevcut MR kontrast ajanlar göre sunmaktadır. ABD FDA onaylı MRG kontrast maddelerin büyük çoğunluğu doğada paramanyetik olan ve spin-örgü gevşeme mekanizması 6,7,8 pozitif kontrast sağlayan gadolinyum şelatlarıdır. Kendi başına düşük sinyal yoğunluğu sağlayacak tek gadolinyum şelat ile karşılaştırıldığında, nanopartiküller PB kafes içinde çok sayıda gadolinyum iyonu dahil sinyal yoğunluğu (pozitif kontrast) 3,9 şarlar. Ayrıca, PB kafes içinde birden gadolinyum iyonlarının varlığı dolayısıyla spin-spin gevşeme mekanizması negatif kontrast yaratan, genel sıkma yoğunluğu ve çevresinde yerel manyetik alan bozan nanopartiküllerin paramagnetizmanın büyüklüğünü artırır. Böylece gadolinyum içeren nanopartiküller T (pozitif) 1 ve T 2 (negatif) kontrast maddeler 10,11 hem işlev.
Böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda bir alt grubunda, gadolinyum bazlı kontrast maddelerin uygulanması nefrojenik sistemik fibrozis 8,12, 13 gelişimine bağlı olmuştur. Bu gözlem kontrast ajanlar gibi alternatif paramanyetik iyonların kullanımı için soruşturma açtı MR. Bu nedenle, nanopartiküller yönlü tasarım PB kafes içinde manganez iyonlarını da uyarlanmıştır. Gadolinyum şelatları benzer şekilde, mangan şelatlar, para-manyetik olan ve tipik olarak MR 7,14 pozitif sinyal yoğunluğu sağlamak için kullanılır. Gadolinyum içeren PB NPler gibi manganez içeren PB NPler da (pozitif), T 1 ve T, 2 (negatif) kontrast maddeler olarak işlev görürler.
Flüoresan görüntüleme yetenekleri birleştirmek için, nanopartikül "çekirdekler" floresan etiketli glikoprotein avidin oluşan bir "Biyofonksiyonel" kabuk (Şekil 1 ile kaplanır). Avidin sadece floresan görüntüleme sağlayan, aynı zamanda belirli hücreleri ve doku hedef biyotinli ligandlar için bir yerleştirme platformu olarak hizmet vermektedir. avidin-biyotin bağ avidin ve biotin 15 ile son derece güçlü bir bağlanma afinitesi ile karakterize güçlü bilinen, kovalent olmayan bağlar biridir. avidin kaplı PB NPlerin için biyotinilatlı ligandların eki PB NPlerin moleküler hedefleme yetenekleri verir.
Bu görüntüleme yöntemleri tamamlayıcı özelliklere sahip çünkü PB NPs kullanarak floresan ve MR görüntüleme takip için motivasyondur. Floresan görüntüleme en yaygın kullanılan optik moleküler görüntüleme tekniklerinden biri olan ve yüksek hassasiyetleri 1,16,17 anda birden fazla nesne aynı anda görselleştirme sağlar. Floresan görüntüleme güvenli, non-invaziv bir tedavi yöntemidir ancak düşük penetrasyon derinlikleri ve mekansal çözünürlüklerde 1,3,16 ile ilişkilidir. Öte yandan, MR yüksek zamansal An üretird uzaysal çözünürlüğü non-invaziv ve radyasyon 1,3,16 iyonlaştırıcı bir ihtiyaç olmadan. Ancak MRG düşük hassasiyet muzdarip. Bu nedenle floresan görüntüleme ve MR nedeniyle derinlik penetrasyonu, duyarlılık ve mekansal çözünürlük tamamlayıcı özellikleri moleküler görüntüleme teknikleri olarak seçildi.
Bu makalede, PB NP sentezi ve biofunctionalization için protokol sunulur, gadolinyum içeren PB NP (GdPB) ve manganez içeren PB NP (MnPB) 10,11. Aşağıdaki yöntemler, tarif edilmektedir: 1) boyut, yük ölçümü ve nanopartiküllerin zamansal stabilitesi, MR relaksivitelerine 3) ölçüm nanopartiküllerinin sitotoksisite 2) değerlendirilmesi ve floresans ve moleküler MR için nanopartiküllerin 4) kullanımı in vitro olarak hedef hücre popülasyonunun. Bu sonuçlar, in vivo olarak çok modlu, moleküler görüntüleme maddeleri olarak kullanım için NP potansiyelini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PB NP GdPB ve MnPB 1. sentezi
Nanopartiküller (PB NPler, GdPB veya MnPB) sentezi aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirerek bir tek-kap sentez şeması kullanılarak elde edilir:
- Çözeltisi hazırlayın 'A', deiyonize (Dİ) su içinde 5 mM potasyumkarbonat (II) 5 ml ihtiva etmektedir. Aşağıdaki gibidir: PB NPler, GdPB veya MnPB, çözelti "B" hazırlamak - nanopartikül tipine bağlı olarak sentezlenen
- Için PB NP: DI su içinde 2.5 mM demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak.
- GdPB NPlerin için: 2.5 mM deiyonize suda gadolinyumun biri (III) nitrat, demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak
- MnPB NPlerin için: 2.5 mM DI su içinde manganez biri (II) klorür ve demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak.
- Yuvarlak tabanlı bir şişeye bir çözüm 'B' ekleyin ve oda sıcaklığında şişe içeriği (RT) karıştırıldı ve1.000 rpm. Çözüm 'A' damla damla yuvarlak dipli bir şişeye çözümü içeren 'B' içine ekleyin. Yaklaşık 10 ml / saat olarak dağıtmak için bir peristaltik pompa ile "B" çözelti "A" ilave edilmesi için akış hızını kontrol eder.
- "B" çözelti "A" ilave edildikten sonra ek bir 30 dakika için oda sıcaklığında 1000 rpm'de karıştırma devam ediniz. Karıştırma durdurun ve karışımı toplamak.
- Girmemiş bileşenlerin serbest nanopartiküller durulama mikrosantrifüj tüpler içine karışımın hacimde aktarın. Santrifüj ile parçacık toplama yardımcı olmak için her bir kana 5 M NaCl (0.2 mi NaCl / ml tepkime karışımı) ekleyin.
- Santrifüj 20,000 x g 'de, en az 10 dakika boyunca nanopartiküllerin her bir sıvı bölüntü. Santrifüj işleminden sonra dikkatlice süpernatant kaldırmak.
- Bir mikro uçlu (sonikasyon darbe kullanarak sonikasyon ile 1 ml Dİ su içinde her bir nanopartikül pelletini / kapalı = 1/1 saniye, genlik =% 50, süre =5 sn, sonikatör güç derecesi = 125 W) pelet kırmak için.
- Tekrar nanopartiküller ilk tepki ve reaksiyon yan bileşenleri serbest olmasını sağlamak için 1,4-1,6 en az 3 × adımları. Nihai Santrifüj işleminden sonra, 1 ml Dİ su içinde parçacıklar yeniden süspanse edin.
PB NP GdPB ve MnPB 2. Biofunctionalization
Aşağıda tarif edildiği gibi nanopartiküllerin Biofunctionalization avidin ve biyotinile edilmiş ligandlan ekleyerek nanopartikül "çekirdek" bir kaplama içerir:
- Floresan Avidin'e ile Nanopartiküller Kaplama
Pozitif avidin (pl ~ 10.5) 18 aşağıdaki gibi negatif yüklü nanopartiküller üzerine kaplanır ücret nerede floresan avidin ile nanopartiküllerin Kaplama elektrostatik kendini derleme kullanılarak elde edilir:- 1 ml Dİ su içinde PB NP, GdPB veya MnPB süspansiyonları hazırlanır. Alexa Fluor 488 etiketli avidin Filtre (A488, DI su içinde yeniden)10 dakika için 14,000 x g 'de, 0.2 um'lik bir naylon filtreden geçirilerek mikrosantrifüj. ≤0.2 mg, avidin mg / nano-tanecikleri ekleyin. PB NP GdPB veya MnPB alikolar ayrı A488 her süzüldü kısım ekleyin.
- 4 ° C'de nazik sallayarak veya rotasyon ile 2-4 saat A488 ile nanopartiküller başvurun. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan örnekleri koruyun.
NOT: PB NPs (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), ve MnPB (MnPB-A488) kaplamalı Bu adım verimleri A488.
- Biyotinile Antikorların Ek
Aşağıdaki gibi avidin kaplı nanopartiküller kaplanan biyotinlenmiş hedef antikorların bağlanması, avidin-biyotin etkileşimi kullanılarak elde edilir:- PB-A488, GdPB-A488 ve 1 ml Dİ su içinde MnPB-A488 - Avidin kaplı nanopartiküllerin süspansiyonlar hazırlayın. 10 dakika için 14,000 x g 'de bir 0.2 mikron naylon filtre içinden mikrosantrifüj biyotinlenmiş antikor (üretici tarafından tedarik edilen) filtre.
NOT: Burada, bu çalışmada biotu kullanırinylated anti nöron-glia antijen 2 (Ang2) NG2 hücreleri ve merkezi sinir sistemi dokusu ve içinde aşırı ifade hedef biyotinile anti-insan eotaksini-3 eozinofillerin veya eozinofil hücre çizgileri üzerinde fazla sentezlenmiş reseptörlerin hedef (Eot3). - Avidin kaplı nanopartiküllerin hacimde ayrı biyotinile antikor, süzüldü kısım ekleyin. ≤0.05 mg biyotinile antikor mg / avidin kaplı nano-tanecikleri ekleyin. Yumuşak, 4 ° C'de çalkalayarak veya döndürme ile 2-4 st için biyotinile edilmiş antikorların (Ang2 veya Eot3) ile avidin kaplı nano-tanecikleri başvurun. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan örnekleri koruyun.
Not: Bu adım verimleri antikor kaplı nanopartiküller (örn GdPB-A488-Eot3 ve MnPB-A488-Ang2).
- PB-A488, GdPB-A488 ve 1 ml Dİ su içinde MnPB-A488 - Avidin kaplı nanopartiküllerin süspansiyonlar hazırlayın. 10 dakika için 14,000 x g 'de bir 0.2 mikron naylon filtre içinden mikrosantrifüj biyotinlenmiş antikor (üretici tarafından tedarik edilen) filtre.
Nanopartiküller 3. boyutlandırılması, Zeta Potansiyeli ve Geçici Kararlılık
nanopartiküllerin boyut dağılımı, ücret ve istikrar, dinamik kullanılarak ölçülürışık saçılımı (DLS) yöntemleri, aşağıda tarif edildiği gibidir:
- Nanopartiküller Boyutlandırma
Nanopartiküller boyutlandırılması aşağıdaki gibi dinamik ışık saçılması ile elde edilir:- Tek kullanımlık bir plastik küvet içinde DI su içinde 990 ul nanopartikül örnek (1 mg / ml) 10 ul ekle.
NOT: Bu iyi bir DLS sinyali için temsili değerdir. - Iyice karıştırın küvet ve vorteks Cap. Nanopartiküllerin boyutunu ölçmek için, parçacık büyüklüğü analiz etmek için kullanılan bir sistemde, küvet yerleştirin. 173 ° ölçüm açıyla partikül büyüklüğü analizi yürütmek.
- Tek kullanımlık bir plastik küvet içinde DI su içinde 990 ul nanopartikül örnek (1 mg / ml) 10 ul ekle.
- Nanopartiküller zeta potansiyeli
Aşağıdaki gibi nanopartiküllerin Zeta potansiyeli faz analizi ışık saçılması kullanılarak ölçülür:- Bir tek kullanımlık plastik kılcal hücre DI suyun 900 ul nanopartikül örnek (1 mg / ml) 100 ul ekle. Bu değer iyi bir zeta potansiyeli ölçümü için temsilcisidir.
- Kılcal yerleştirin25 ° C 'de varsayılan parametreler kullanılarak, nanopartiküllerin zeta potansiyelini ölçmek için zeta potansiyelinin analiz etmek için kullanılan bir sistem y hücresi.
- Nanopartiküller Zamansal Kararlılık
Nanopartiküllerin Zamansal istikrar şöyle dinamik ışık saçılması ile ölçülür:- DI su hem de Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde nanopartiküllerin boyutları ölçülerek nanopartiküllerin stabilitesini değerlendirmek.
- 5 günlük bir süre boyunca DI su ve DMEM bir kere / gün boyutu ölçümleri tekrar edin.
Nanopartiküller 4. Sitotoksisite
Aşağıdaki gibi nanopartiküllerin Sitotoksisite bir XTT hücre çoğalması tahlili kullanılarak ölçülmüştür:
- Tohum 10,000-15,000 hücre / göz, her hücre tipi, 96 oyuklu bir plaka (Neuro2a BSG D10 EOL-1 ve OE21) incelenmiştir. Seribaşı hücrelerin toplam hacmi e değil emin olunxceed 0.2 ml / oyuk. Gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile Serpilen hücreleri, inkübe edin.
- Hücrelerle nano-tanecikleri Bağlantı:
- (- 0.5 mg / ml 0.01) nanopartiküllerin değişen konsantrasyonlarda kuluçkaya bırakılır. (50 ul) nanopartiküllerin miktarda tanımlayan bir temsili bir tablo olarak, Tablo 1 'e bakın / Orta ila 50 ul çıkarılmasından sonra hücrelere eklendi.
- Tahlilinde nanopartiküllerin engelleyici emme hesaba katmak için, nanopartiküller, uygun konsantrasyonlarda oluşan bir boş eklemek (0-0.5 mg / ml hücrelere ilave miktarda eşdeğerliğine) hücreler olmaksızın ortama.
- 37 ° C'de gece boyunca nanopartiküller ile kuluçkaya bırakılır ve% 5 CO2. Aspire ortamından her bir ve fosfat tamponlu çözelti (PBS) içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden bir lekeleme tampon maddesi ile durulanır. Fenol kırmızısı olmadan ortam 100 ul ilave edin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübe16-18 saat karıştırıldı.
- (- 0.5 mg / ml 0.01) nanopartiküllerin değişen konsantrasyonlarda kuluçkaya bırakılır. (50 ul) nanopartiküllerin miktarda tanımlayan bir temsili bir tablo olarak, Tablo 1 'e bakın / Orta ila 50 ul çıkarılmasından sonra hücrelere eklendi.
- Üreticinin özelliklerine göre kit bileşenlerini (XTT Reaktif ve XTT Activator) karıştırarak XTT Hücre Çoğalma Deneyi çalışma çözeltisi hazırlayın. Kuyu ortamı aspire ve çalışılan hücre tipi için uygun bir ortamda (/ o fenol kırmızı +% 10 FBS + 1 x Pen-strep w RPMI) RPMI 100 ul ilave edin. Her bir oyuğa, XTT çalışma çözeltisinin 50 ul ilave edin ve 2-2.5 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5.
- Parmak izi veya leke düzeltmek için 630 nm'lik bir referans dalga boyu ile 490 nm'de absorbansı ölçülür. Her iyi için düzeltilmiş absorbansı (A 490-A 630) hesaplayın ve çoğaltır için okumaları ortalamasını.
- Nihai düzeltilmiş absorbans değerlerini hesaplamak için her kuyuya değerinden boş okumalar çıkarın. Nanopartiküller olmadan muamele edilmemiş hücrelerin bu son düzeltilmiş absorbans normalize ederek, her numune için hayatta kalma yüzdesi hesaplanır. Arsa sunanopartikül konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak rvival yüzdesi.
5. MRG PB NPlerin relaksivitelerine, GdPB ve MnPB
MR relaksivitesi T 1 kullanılarak ölçülür - ve T 2, aşağıda tarif edildiği gibi nano-tanecikleri içeren bir 96-çukurlu plaka kullanılarak MRI "hayalet" hazırlanmasıyla -ağırlıklı dizileri
- Phantom Hazırlık
- Uygun konsantrasyonda ihtiva eden her bir göze 100 ul nanopartiküller (PB NPler, GdPB veya MnPB) ile 96 oyuklu plaka hazırlanması. Nanopartikül her türü için 0.4 mM konsantrasyonunda ile başlayarak, seri E ulaşılır 2.4 x 10 -5 arasında bir konsantrasyona kadar distile su ile nano-tanecikleri, 2 × seyreltin (bu 14 dilüsyonları, 15 kuyu gerektirir).
- Her bir kuyunun içine deiyonize suda eritilmiş% 1 agaroz çözeltisi 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Jel 12 saat için 4 ° C'de katılaşmaya izin verin.
NOT: Bu seri dilüsyonlarını içeren bir hayalet verirKatılaşmış agaroz nanopartiküller aldılar. - % 2 agar (150 cm 3) katı bir blok altında yatay 3 T klinik mıknatıs hayalet yerleştirin. 8-kanal HD beyin bobin merkezi içinde agar hayalet ve blok sabitleyin. 96 gözlü plaka 11 orta yükseklikte 0.5 mm kalınlığında koronal kesitler kullanılarak dinlenme süreleri ölçün.
- T 1 - T 2 -ağırlıklı dizileri
Klinik mıknatıs dizileri elde etmek için aşağıdaki temsili ayarları kullanın.
NOT: Bu değerler bu çalışmada kullanılan nanopartiküller için optimize edilmiştir:- T Edinme aşağıdaki sıvı zayıflatılmış inversiyon kurtarma (FLAIR) sekans kullanılarak 1 -ağırlıklı (T1A) MR görüntüleri: tren Echo (ET) = 8, Tekrarlama zamanı (TR) = 2.300 msn, Echo zamanı (TE) = 24.4 msn, Matris boyutu = 512 x 224, Görüş alanı (FOV) 16 x 16 cm 2 =.
- Aşağıdaki hızlı Relaxa kullanarak T 2 -ağırlıklı (T2A) MR görüntüleri Edinmeyon hızlı spin eko (FRFSE) dizisi: ET = 21; TR = 3.500 msn; TE = 104 ms; Matris boyutu = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
- Aşağıdaki inversiyon zamanlarda 127 MHz (3 T) T1A ve T2A MR görüntüleri elde: 50, 177, 432, 942, 1961, 4000 msn.
- MRG relaksivitelerine Ölçme
- Bölüm 5.2 açıklanan dizileri kullanılarak T1A ve T2A görüntüleri aldıktan sonra, daha sonra, bundan böyle ana araç çubuğunda bulunan oval kırpma düğmesini kullanarak her yatırım getirisi seçerek ilgi (ROI) bölge olarak belirlenen her bir kuyunun kullanarak ImageJ için sinyal yoğunluğunu ölçmek > Ölçü analiz seçerek.
NOT: Bir pop-up "Mean" etiketli sütununda her ROI ortalama sinyal yoğunluğunu göstermesi gerekir. - Her ROI için, kendine özgü inversiyon zamana karşı ölçülen sinyal yoğunluğunu arsa. Gerekli invert noktaları arsa başında bir başlangıç "kabarcık" ya da aykırı oluşturmak (okuma) (alt inversiyon isekez).
NOT: MRG yerine 19 düzeltilmiş sorumluydu gereken gerçek (negatif) değeri / daha görüntülerin büyüklüğü veya mutlak değerini ölçen çünkü bu okumalar düşük inversiyon zamanlarda oluşturulur. - Bölüm 5.2 de anlatıldığı gibi inversiyon kat vs ROI (SI) (T I) için sinyal yoğunluğu her arsa için bir üstel uyum hazırlayın. X-ekseni üzerinde Konu T I, y-ekseni SI; ɑ ve Δ regresyon ile belirlenir sabitlerdir, ve T, 1 ya da T 2 çözülecek değişken olup,
nerede t T 1, T 2 =. - Yukarıdaki denklem kullanılarak T 1 veya 2 T için çözün ve her ROI kullanılan nanopartiküllerin konsantrasyonlarına karşı hesaplanan değerler (1 / T 1 ve 1 / T 2) tersini arsa.
- Lineer grafiğin eğimini hesaplamak hangirelaksiviteleri 1 r ve 2 r verir.
NOT: Protokol Aşağıdaki bölüm floresan etiketleme ve hedeflenen hücrelerde üreten MRG kontrast nanopartiküllerin uygulamasını açıklar.
- Bölüm 5.2 açıklanan dizileri kullanılarak T1A ve T2A görüntüleri aldıktan sonra, daha sonra, bundan böyle ana araç çubuğunda bulunan oval kırpma düğmesini kullanarak her yatırım getirisi seçerek ilgi (ROI) bölge olarak belirlenen her bir kuyunun kullanarak ImageJ için sinyal yoğunluğunu ölçmek > Ölçü analiz seçerek.
Konfokal Mikroskopi - Nanopartiküller kullanma Hedefli Hücre 6. Floresan Etiketleme
Not: nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) floresan aşağıdaki gibi (konfokal mikroskopi ile izlenmiştir) hedef hücrelerden oluşan bir popülasyonu etiketlemek için kullanılabilir:
- Floresan Nanopartiküller Sentezi
- Bölüm 1 ve 2'de ayrıntılı olarak adımları hedef hücre popülasyonunun bir floresan etiketlemesi için GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-Ang2 sentez.
- Hücrelerin Hazırlanması Floresans Hedefleme
- Coat hayır. 90 dakika boyunca% 0.002 poli (L-lisin), hidrobromür eden bir çözelti içine daldırılmak suretiyle 1.5 mikro örtücü camlar. Çözelti kapak gözlük çıkarın ve bunları 24 saat kurumasını bekleyin.
- Tohumlar hücreler (örneğin EOL-1 BSG D10, SUDIPG1) bir 6-yuvalı plaka içine yerleştirilmiş ve en az 16 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5 kaplamalı kapak gözlük. 1 x PBS çözeltisi ile hücrelerin durulayın (isteğe bağlı) 15 dakika boyunca nötr tampon çözeltisi içinde% 10 formaldehid ile sabitleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de, PBS içinde 5 uM kırmızı-turuncu hücreye nüfuz edici boya ile Leke hücreleri. Daha sonra, hücreler PBS ile yıkayın.
- > Hedeflenen Hücre Floresan Etiketleme
- % 1 sığır serum albümini (BSA; DI su içinde) hücrelere hücreleri üzerinde spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek ve 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe etmek.
- 1 saat boyunca% 1 BSA içinde nanopartiküller ile hücreleri inkübe edin. EOL-1 için: 0.2 mg / ml GdPB-A488 veya GdPB-A488-Eot3 kuluçkalanması; BSG D10 ve SUDIPG1 için: 0.2 mg / ml MnPB-A488 veya MnPB-A488-Ang2 ile inkübe edilir. Unbou kaldırmak için PBS 3 × hücreleri durulayınnd nanopartiküller.
- Dikkatle içinde sıkışmış hava kabarcıkları vardır sağlanması, bir mikroskop lamı üzerine (hücreleri ve nanopartiküller içeren) cam kapak ters. Dikkatle net oje uygulayarak kapak cam ve mikroskop lamı arasındaki kenar Seal. Görüntü bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak hücreler.
Sitometrisi - Nanopartiküller kullanma Hedefli Hücreleri 7. Floresan Etiketleme
aşağıdaki gibi nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) floresan etiket (akış sitometrisi ile izlenmiştir) hedef hücrelerden oluşan bir popülasyonu kullanılabilir:
- Hücrelerin hazırlayın süspansiyonları PBS hedef alınıyor. Saf kültür çalışmaları için, süspansiyonlar, tek bir hücre tipi (örn BSG D10) oluşur; 100,000 hücre / ml (10 ml toplam) ile PBS içinde BSG İşlem D10 hücreleri ve hücre pelletini. Karışık kültür çalışmaları için, süspansiyonlar en az iki hücre tipleri (örn EOL 1 ve OE oluşur21); (10 ml toplam) 100,000 hücre / ml her biri BSG D10, PBS EOL-1 ve OE21 ve tekrar süspansiyon hücre peletleri benzer.
- EOL-1 arasında değişen oranlarda hazırlayın: OE21 1: 0 (2 mi EOL-1), 3: 1 (1.5 mi EOL-1, 0.5 mi OE21), 1: 1 (1 mi EOL-1 ve OE21 her), 1: 3 (EOL-1 0.5 mi, 1.5 mi OE21), 0: 1 (2 mi OE21).
- Hücreler (saf ve karışık süspansiyonlar) bloke spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için% 5 BSA ve 2 ml Nanopartiküllerin tarafından hedef.
- Hücrelere 1 ml (1 mg / ml) nano-tanecikleri ilave edilir ve 1 saat süre ile inkübe edilir. BSG D10 için, MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (kontrol antikoru), ya da MnPB-A488-Ang2) hücreleri kuluçkaya yatmaktadır. EOL-1 ve OE21 karışımları için, GdPB-A488-Eot3 sabit bir miktarı ile karışımları inkübe edin.
- Bağlanmamış parçacıkları kaldırmak için 5 dakika boyunca 1.000 × g en az 3 × örnekleri aşağı iplik bağlanmamış nanopartiküllerin ücretsiz hücreleri durulayın. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, PBS içinde% 10'luk formaldehid ile yapışması. 10 ug / ml ile inkübe edilerek Leke hücreleri30 dakika boyunca buz üzerinde PBS içerisinde 7-Aminoactinomytcin D. PBS ile durulayın, sonra bir akış sitometrisi kullanılarak her numune 10.000 geçirilen hücreler analiz eder.
Nanopartiküller kullanma Hedeflenen Hücreleri 8. Yaratma MR Kontrast
aşağıdaki gibidir: hedef hücre popülasyonu olarak - nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) (T 2 -ağırlıklı dizileri her iki T 1) MRT-kontrast oluşturmak için kullanılabilir
- Phantom Hazırlık
- % 80 izdiham ~ kadar T75 matara hücreleri (örneğin BSG D10) büyür. Uygun büyüme ortamı ve koşulları kullanın. BSG D10 için, 37 ° C'de DMEM +% 10 FBS + 1 x Pen-strep hücrelerin büyümesi ve% 5 CO2.
- 5 ml PBS ile orta serbest hücreleri durulanır ve spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için 1 saat süre ile, PBS içinde 5 ml% 1 BSA ile bloke hücreleri. Hücrelere 5 ml (0.5 mg / ml), nano-tanecikleri ekleyin. BSG D10 için, MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (kontrol antikoru), ve MNP hücreleri inkübeB-A488-Ang2 1 saat karıştırıldı.
- Ilişkisiz nanopartiküller kaldırmak için hücreler 5 ml PBS ile 3 × durulayın. Fantom hazırlanması için bir şişe bunları ayırmak için 37 ° C ve% 5 CO2 ile 2 ml EDTA,% 0.25 çözeltisi ile 5 dakika boyunca 1 × hücreler inkübe edilerek hücreler tripsinize. Hücrelerin tripsinizasyon söndürmek için DMEM 8 ml ilave edilir.
- 5 dakika boyunca 1.000 × g onları santrifüj hücreleri toplamak; süpernatant dışarı aspire. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri hücrelerin tespit etmek için PBS içinde 1 ml% 10 formaldehit ekleyin. 96 oyuklu bir plaka, ayrı bir oyuğuna her bir numune 100 ul ekle.
- Her bir kuyunun içine deiyonize suda eritilmiş% 1 agaroz çözeltisi 100 ul ilave edin ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Jel 12 saat için 4 ° C'de katılaşmaya izin verin.
NOT: Bu katılaşmış agaroz bağlı nanopartiküller hücreleri içeren bir hayalet verir. - (Önümüzdeki 2% agar sağlam bir blok yatay 3 T klinik mıknatıs 150 cm hayalet yerleştirin
- T 1 - T 2 -ağırlıklı dizileri
Klinik MRG mıknatıs dizileri elde etmek için aşağıdaki ayarları kullanın:- Aşağıdaki spin eko sekansı kullanarak T1A MR görüntüleri elde: tren Echo (ET) = 1, Tekrarlama zamanı (TR) = 650 msn, Echo zamanı (TE) = 11 msn, Matris boyutu = 320 x 256, Görüş alanı (FOV) = 10 x 10 cm'lik 2.
- Aşağıdaki FRFSE dizisi kullanarak T2A MR görüntüleri elde ET = 28; TR = 3.000 msn; TE = 101 ms; Matris boyutu = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Post-satın alma İşleme
- Gri skala görüntü dönüştürmek için, Görüntü Seç> Yazım> 8-Bit: kolay okuma için, ImageJ kullanarak bir renk skalası görüntü içine orijinal gri tonlu görüntüleri dönüştürebilirsiniz.
- Agaroz çözüm sinyal katkı düşüldükten sonra her bir numune için normalize yoğunluğunu hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek pota sentez şemasını kullanarak, PB NPlerin nanopartiküller (çapı 78.8 nm, dağılırlık indeksi (PDI) = 0,230 anlamına gelir; dinamik ışık saçılması cihaz tarafından hesaplanan), GdPB veya MnPB (çapı 164,2 nm, KAE = 0.102 ortalama) ( çapı DLS ile yapılan ölçümlere göre (tek dağılımlı 122.4 nm PDI = 0.124)) sürekli olarak sentezlenebilir (Şekil 2A) anlamına gelir. sentezlenen nanopartikuller arasında ölçülen, zeta potansiyelleri, yüzey üzerindeki yüklere göre parçacıkların orta kararlılığını gösteren en az -30 mV (Şekil 2B) vardır. bunların tutarlı boyutta (Şekil 2C hidrodinamik çap) ile belirtildiği gibi sentezlenen nanopartiküller 5 günlük bir süre boyunca yeterli bir geçici denge sergilerler.
Hücrelerle birlikte inkübe edildiğinde, nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) belirli bir eşik konsantrasyonlarının altında hücreleri (Şekil 3) ihmal edilebilir bir sitotoksisite arzetmemiştir. Sitotoksisite stu0.67 x 10 6 mg / hücre (Şekil 3A) daha düşük konsantrasyonlarda Neuro2a ile inkübe eş zaman Neuro2a hücreleri PB NPlerin kalıplar önemsiz sitotoksisite göstermektedir. EOL-1 ve OE21 hücreleri ile GdPB ko-inkübasyon tarafından yapılan sitotoksisite çalışmaları 0.25 x 10 6 mg / hücre (Şekil 3B) daha düşük konsantrasyonlarda, her iki hücre tipinde GdPB önemsiz sitotoksisite göstermektedir. 0.25 x 10 6 mg / hücre (Şekil 3C) daha düşük konsantrasyonlarda BSG D10 ile birlikte inkübe benzer şekilde, sitotoksisite çalışmaları MnPB önemsiz sitotoksisite göstermektedir. MnPB ve GdPB ek sitotoksisite nanopartikül çekirdek içinde (GdPB için MnPB ve Gd 3+ Mn + 2) Ek iyonlarının varlığına bağlı olabilir.
MR relaksivitesi çalışmaları PB NP, GdPB ve MnPB değişik konsantrasyonlarda oluşan hayaletleri kullanılarak yapılmıştır. çalışmalar nanopar faydasına işaret ederT1A ve T2 ağırlıklı dizileri (Şekil 4) her iki MRT-kontrast maddeleri olarak ticles. Bu T artmış hiperintensitelerin (pozitif kontrast) 1 -ağırlıklı diziler ve T 2 GdPB (Şekil 4A) ve MnPB (Şekil 4B) hem de artan konsantrasyonları ile -ağırlıklı dizileri artan hypointensities (negatif kontrast) gösterilmiştir. GdPB güçlü bir T 1 maddesi ve bir orta T2 madde (Şekil 4C) ise relaksivitesi ölçümlere dayanarak, MnPB ılımlı T1 madde ve güçlü bir T 2 ajandır. GdPB ve MnPB ölçülen relaksiviteleri klinik onaylı kontrast ajanlar 10, 11 karşılaştırılabilecek düzeyde.
biofunctionalized PB NPler floresan in vitro (Şekil 5) hedef hücrelerden oluşan bir popülasyonu etiket edebiliyoruz. Her iki floresan avidin (A488) ve biyotinile edilmiş anti-insan e biofunctionalized zamanotaxin-3 antikoru (Eot3) GdPB floresan EOL-1 hücrelerinde (Şekil 5B) bir nüfusa hedefleyebilir. GdPB hem fluoresan avidin (A488) ve biyotinile anti-nöronal, glial, antijen-2 (Ang2) ile biofunctionalized zaman Eot3 sergi önemsiz bağlanması (Şekil 5A) olmadan kontrol GdPB nanopartiküller Benzer bir şekilde, nanopartiküller floresan BSG D10 ve SUDIPG1 neurospheres popülasyonları hedefleyebilir (Şekil 5D ve F), hedef antikor olmadan kontrol nanopartiküller floresan hücreleri (Şekil 5C ve E) etiketlemek mümkün iken. Bu nedenle, etkin bir hedefleme ve floresan etiketleme floresan avidin ve biyotinile edilmiş hedefleme ligandına hem de bulunması gerekir.
akış sitometrisi ile nicelleştirilmiştir olarak biofunctionalized nanopartiküllerin kabiliyeti floresan, bir hücre popülasyonu etiket, floresan avidin ve biotin her ikisine olan ihtiyacı teyitEtkili floresan etiketleme (Şekil 6) için ligand açillenmiş hedefleme. BSG D10 hücreleri MnPB A488 ve Ang2 her ikisini de içeren temas (MnPB-A488-Ang2) bileşimleri artmış floresan (Şekil 6A) ve bir kontrol antikoru ile floresan nano-tanecikleri kontrol grubuna kıyasla, flüoresan-işaretli hücrelerin yüzdesi (Şekil 6B) (MnPB-A488 -Abc) ile bir antikor olmadan (MnPB-A488). biofunctionalized nanopartiküller floresan bir hücre karışımı (Şekil 6C) içindeki hücrelerin belirli bir alt-nüfus hedef edebiliyoruz. Bu EOL-1 hedefleme sabit miktarları olarak gösterilmiştir, floresan GdPB (GdPB-A488-Eot3) hedeflenen hücrelerin (EOL-1) ve kontrol hücrelerinin (OE21) ile temas ettirilir. Karışımın içinde, EOL 1 oranlar olarak Floresan artar (Şekil 6C artan Alexa Fluor 488 sinyal yoğunluğunu) artmıştır. Bu ce içindeki hücrelerin bu alt-nüfusu için nanopartiküllerin spesifikliğini gösterirII karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
biofunctionalized PB NPS (Şekil 7) hedeflenen hücre popülasyonunda MRG kontrast artar. BSG D10 hücreleri deneysel (MnPB-A488-Ang2) ve kontrol (MnPB-A488-ABC ve MnPB-A488) nanopartiküllerin eşdeğer konsantrasyonlarda ile temas ettirildiğinde, sergi kontrollere göre MnPB-A488-Ang2 ile temas hücreler için hiperintensitesi artış Fantomları T2 dizileri (Şekil 7A) kontrol grubuna göre MnPB-A488-Ang2 ile temas hücreler için T1W dizileri ve artan hipointensite. Hayali olan İB'nin Görüntü analizi T1W dizilerinde kontrollere göre önemli ölçüde T2 sekanslar (Şekil 7B) kontrollere yoğunluğu görece azalma, deney parçacıklar ile temas hücrelerinin önemli ölçüde yoğunluk artış sergileyen bu eğilimi teyit etmektedir.
Şekil 1: PB NPlerin çekirdek-kabuk tasarımı. CN - - Çekirdek, bir Fe II doğrusal siyanür ligandlann oluşan PB kafes oluşur. Fe III bağlantı Bu bağlantılar PB NPler ücretleri 5 dengeleme aracı olarak, üç-boyutlu bir ağ içinde katyonları dahil sağlar. Prusya mavisi Bu katyon bağlanma yeteneği MR kontrast sağlayan kafes içinde gadolinyum ve manganez iyonlarını yüklemek için kullanılır. Çekirdek molekül hedefleme sağlamak için floresan görüntüleme ve biyotinile edilmiş ligandlan sağlamak için floresan avidin içeren bir Biyofonksiyonel kabuk ile kaplanır.
Şekil 2:. Boyut, yük ve PB NP stabilitesi (A), PB (mavi) boyutu dağılımları, GdPB (kırmızı) ve MnPB (siyah) DLS ile ölçülür nanopartiküller. (B (C), PB (mavi) zamansal kararlılık, GdPB (kırmızı) ve MnPB (siyah) su içinde nanopartiküller, bunların sentezi takip eden beş gün süre ile (katı) ve DMEM (nokta nokta) DLS ile ölçülmüştür.
Şekil 3:. PB NPlerin Sitotoksisite-21 OE hücreleri sırasıyla PB NPler GdPB EOL-1 ve sabit bir miktar ilave Neuro2a hücreleri (B) 'nin, sabit bir sayıda ilave (A)' nın çeşitli konsantrasyonları kullanılarak Sitotoksisite çalışmaları ( C) MnPB BSG İşlem D10 hücreleri ve sabit sayıda ilave edildi. Hücre sağkalım oranı 24 ve 48 saatte hesaplandı. Ref 11 izniyle, telif hakkı 2014 American Chemical Society; Dove Basın Ltd izni ile Ref 10; ve Ref Royal Society of Chemistry izni ile 21.
Şekil 4: T 2 nanopartiküllerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, (A) GdPB ve (B) 'MnPB bölgesinin -ağırlıklı dizileri T 1 -ağırlıklı dizileri ve hipointensite MR görüntüleri ve 3 T. intensite de GdPB ve MnPB bir relaksiviteleri. (C) Ref 11, telif hakkı 2014 American Chemical Society izni ile 3 T. çoğaltılamaz ölçülen PB NPlerin, GdPB ve MnPB ve relaxitivies ve Tablolama.
Şekil 5: biofunctionalized PB NP ile hedef hücrelerin florasanla etiketleme, lazer konfokal tarama mikroskobu ile ölçüldüğü gibi, (A) kontrolü (GdPB-A488) ve (B) Deney (GdPB-A488-Eot3 ile muamele EOL-1 hücrelerinin görüntüler. ) nanopartiküller aldılar.(C) kontrol (MnPB-A488) ve (D) Deneysel (MnPB-A488-Ang2) nanopartiküller ile tedavi BSG neurospheres görüntüleri. (E) kontrol (MnPB-A488) ve (F), deneysel (MnPB-A488-Ang2) nanopartiküller ile tedavi SUDIPG1 neurospheres görüntüler. Ref 11 izniyle, telif hakkı 2014 American Chemical Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: akış sitometresi ile ölçülmüş olarak biofunctionalized PB NP kullanılarak hedef hücreleri, floresan etiketleme (A), (MnPB-A488-Ang2), deney ve kontrol (MnPB-A488-ABC ve MnPB ile muamele BSG İşlem D10 hücreleri ve histogramları Akış sitometrisi. -A488) nanopartiküller aldılar. (B) PeDeneysel (MnPB-A488-Ang2) ile muamele ve kontrol üzerinde (Alexa-Fluor pozitif%) floresan panelinde (A) BSG D10 hücrelerinin rcentage (MnPB-A488-ABC ve MnPB-A488) nanopartiküller, ** p <0.05. (C), nanopartiküller (GdPB-A488-Eot3) hedeflediği EOL-1 (hedef hücreler) ve OE21 (kontrol hücreleri) arasında değişen oranlarda ihtiva eden bir hücre karışımı Dağınık akış sitometrisi lekeleri. Ref 11, telif hakkı 2014 American Chemical Society ve Ref 10 den Dove Basın Ltd. izniyle izni ile çoğaltılmıştır bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 7:. Biofunctionalized PB NP kullanılarak hedef hücrelerde artan MRT-kontrast, (A) T 1 -ağırlıklı T <deneysel (MnPB-A488-Ang2) ve kontrol (MnPB-A488-ABC ve MnPB-A488) nanopartiküller ile tedavi BSG D10 hücreleri sabit sayıda oluşan fantom alt> 2 -ağırlıklı kontrast geliştirme. (B) BSG D10 deneysel (MnPB-A488-Ang2) ile muamele hücreleri ve kontrol (MnPB-A488-ABC ve MnPB-A488) nanopartiküller için Normalize sinyal yoğunluğu, ** p <0.05. Dove Basın Ltd. izniyle Ref 10 çoğaltılamaz
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküller göre çok modelli, moleküler görüntüleme maddeleri için yeni bir sınıfının sentezlenmesi için yöntemler sunmuştur. nanopartiküller dahil moleküler görüntüleme yöntemleri nedeniyle tamamlayıcı özellikleri, floresan görüntüleme ve moleküler MR vardır. biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküller bir çekirdek-kabuk bir tasarıma sahiptir. Bu nanopartiküllerin sentezi önemli adımlar şunlardır: 1) Tek pota Prusya mavisi nanopartiküllerin oluşmaktadır çekirdeklerini (PB NPS), gadolinyum içeren Prusya mavisi nanopartiküller (GdPB), ya da manganez içeren Prusya mavisi verir sentezi nanopartiküller (MnPB) elektrostatik kendini montaj ile floresan avidin kullanılarak nanopartiküller, 2) biofunctionalization ve sağlam avidin-biyotin etkileşimleri kullanarak nanopartiküllere biyotinli ligandların (antikorlar) 3) eki. Floresan avidin ve biyotinlenmiş ligand Hem biof teşkilNanopartiküllerin unctional kabuk içerirler.
tek-kap sentezi T 1 ve T MRI 2 kontrast maddeler olarak işlev PB NP, GdPB veya MnPB verir. nanopartikül çekirdek içine yüklenen paramanyetik iyonlar (gadolinyum ve manganez) miktarları (artmış veya azalmış) değiştirilmiş paramanyetik iyonu içeren tuzların miktarlarının değiştirilmesiyle edilebilir (gadolinyum (III) nitrat ve manganez (II) klorür) içinde tek-kap sentezi (adım 1.2). Bu değişmiş sonuçlanır MRG sinyal yoğunlukları (artmış veya azalmış). Bununla birlikte, sentez şemasına bu değişikliklerin stabil, toplanmış nanopartiküller neden olabilir. Agregasyonu ile ilgili endişeleri azaltmak için, tek kap sentezini sentezi 20 boyunca sitrat gibi maddeler kapatma boyutu kontrol dahil etmek üzere modifiye edilebilir.
Nanoparçacık çekirdeklerinin Biofunctionalization floresan avidin, İAB ile elektrostatik kendini montaj yoluyla elde edilirles floresan görüntüleme. Elektrostatik kendinden montaj nanopartiküllerin yüzey ve (bu makalede, floresan avidin) kaplama polimer üzerinde ters ücretleri gerektirmektedir. Nanopartiküllerin yüzeyinin işlevselliğinin değiştirilmemesi için, avidin pozitif yüklü polimerlerin (örneğin, polilisin ya da polietilen glikol içeren bir amin grubu) sentez sırasında değiştirilebilir. Bununla birlikte, nanopartiküller ve kaplama polimerinin nispi oranları nanopartikül boyut ve stabilitesinin muhafaza edilmesi için ve birarada toplanmasını önlemek için optimize edilmiş olması gerekir.
Avidin kaplı nanopartiküller üzerine biyotinlenmiş antikorlar ilave PB-bazlı nano-tanecikleri, moleküler hedef özelliği verir. Bu adım avidin ve biotin arasındaki sağlam etkileşime dayalı (denge sabiti ayrışma, K ~ 10 -15 d). Önceki adımda olduğu gibi, avidin kaplı nanopartiküller ve biyotinlenmiş ligandlara nispi oranları op olması gerekireş zamanlı olarak nanoparçacık agregasyonu ile sonuçlanan iki Avidin kaplı nano-tanecikleri bağlanmasını biyotinlenmiş ligand önlemek için timized. Moleküler hedeflenmesi, antikorlar, diğer hedefleme antikor parçacıkları gibi ligandlar (Fab), tek-zincirli değişken parçasıdır (scFv), peptidler, ya da aptamerler ile ikame edilebilir.
modlu gibi biofunctionalized nanopartiküllerin sentezi için bu yöntemin en önemli avantajı, moleküler görüntüleme ajanları şunlardır: nanopartikül çekirdeklerinin 1) kolay bir kap (1-aşama) sentezi, ve 2) sıralı temas adım (elektrostatik kendinden montaj ve Avidin- Bir Biyofonksiyonel kabuk ile nanopartikül çekirdeği kaplamak için biyotin etkileşimi). Nanopartiküllerin diğer avantajları (Radiogardase olarak satılmaktadır) Prusya mavisi önceden beşeri FDA onaylı olduğunu ve tek kab sentezi Şema sonucu nanopartiküller (bir MRT-kontrast maddesi olarak, her iki T 1 kullanılacak olması yer almaktadır pozitif) ve T 2 </ Sub> kolayca kontrast maddelerin sentezi için karmaşık sentez şemaları veya özel kimyasallar olmadan kontrast ajanlar veya nanoparçacık platformları diğer kullanılarak elde değil (negatif) -ağırlıklı dizileri. Tekniğin bir sınırlaması nanoparçacık çekirdek sentezi ve Biyofonksiyonel kabuk kaplama iki aşamada da reaksiyona giren maddelerin görece oranları titizlikle bu belirli aşamasında kullanılan reaktifler için optimize takdirde sentez agrega ile polidispers nanopartiküller yol olabilir. Örneğin, avidin ile nanopartiküller çekirdeklerin kaplanması için nispi oranları önceki optimizasyon çalışmaları olmayan polilisin ile nano-tanecikleri kaplamak için uzatılamaz.
Burada tarif edilen biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi için teknik hakim sonra, çok yönlü tasarım in vivo moleküler görüntüleme çalışmaları için modifiye edilebilir. Bu, daha az Immun için nanopartiküllerin PEGilasyon gerektirirogenicity ve in vivo olarak daha uzun sirkülasyon süreleri. Burada tarif edilen tasarımına benzer şekilde, PB NPler, in vivo uygulama öncesinde antikorlar ile biofunctionalized edilebilir. Diğer çalışmalar theranostic (aynı anda tedavi + diyagnostik) in vivo uygulamalar için biofunctionalized PB NP kullanımını içerir. Fototermal tedavisi için Prusya mavisi nanopartiküllerin kullanımını araştıran çalışmalar (yakın kızılötesi dalga boylarında absorbans özelliklerine göre) şu anda 21 devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A.
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J.
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
