This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Multimodale, ermöglicht die molekulare Bildgebung die Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulärer und molekularer Ebene mit mehreren Auflösungen, ergänzende bildgebende Verfahren. Diese bildgebenden Mittel erleichtern die Echtzeit-Beurteilung von Wegen und Mechanismen in vivo, die sowohl diagnostische als auch therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) – eine neue Klasse von Mitteln zur Verwendung in multimodale, molekulare Bildgebung Anwendungen. Die bildgebenden Verfahren in der Nanopartikel, Fluoreszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie (MRI) eingebaut ist, komplementäre Funktionen. Die PB-Nanopartikel besitzen eine Kern-Schale-Design, bei dem Gadolinium und Manganionen in den Zwischenräumen des PB Gitter eingebaut erzeugen MRI Kontrast sowohl in T 1 und T 2 -gewichteten Sequenzen. Die PB-Nanopartikel mit fluoreszierenden Avidin beschichtete mit elektrostatische Selbst alsMontage, die Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht. Die Avidin-beschichteten Nanopartikel mit biotinyliertem Liganden, die molekulare Targeting-Fähigkeiten an die Nanopartikel zu verleihen modifiziert. Die Stabilität und Toxizität der Nanopartikel werden gemessen, sowie deren MRI Relaxivitäten. Die multimodale, molekulare Bildgebung Fähigkeiten dieser biofunktionalisierte PB-Nanopartikel werden dann durch sie für Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT in vitro nachgewiesen.
Molekulare Bildgebung ist die nicht-invasive und gezielte Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulären und molekularer Ebene 1. Die molekulare Bildgebung ermöglicht eine Probe in seiner nativen Mikroumgebung zu bleiben, während seine endogene Wege und Mechanismen werden in Echtzeit ausgewertet. Typischerweise beinhaltet die molekulare Bildgebung die Verabreichung eines exogenen Kontrastmittel in der Form eines kleinen Moleküls, Makromolekül, oder Nanopartikel zu visualisieren, Ziel und Spuren relevanten physiologischen Prozesse untersucht 2. Die verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, die in der molekularen Bildgebung untersucht worden sind, umfassen MRI, CT, PET, SPECT, Ultraschall, Photoakustik, Raman-Spektroskopie, Biolumineszenz, Fluoreszenz und Intravitalmikroskopie 3. Multimodal-Bildgebung ist die Kombination von zwei oder mehr bildgebende Verfahren, wo die Kombination erhöht die Fähigkeit, zu visualisieren und zu charakterisieren verschiedenen biologischen Prozessen und Ereignissen 4. Multimodal Bildgebung nutzt die Stärken der einzelnen Abbildungstechniken, unter Kompensation der individuellen Grenzen 3.
Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) – eine neue Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Agenten. Die PB-Nanopartikel sind für die Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT eingesetzt. PB ist ein Pigment, das aus alternierenden Eisen (II) und Eisen (III) -Atome in einer flächenzentrierten kubischen Netzes (Abbildung 1). CN – – Fe III Gestänge, die Kationen enthält, um Ladungen in ihrem dreidimensionalen Netzwerk 5 Ausgleichen der PB Gitter linearer Cyanidliganden in einer Fe II besteht. Die Fähigkeit von PB um Kationen in die Gitter einbauen wird separat Laden Gadolinium und Mangan-Ionen in die PB-Nanopartikel für MRT-Kontrast ausgebeutet.
Der Grund für die Verfolgung einer Nanopartikel-Design für MRT-Kontrast ist wegenDie Vorteile dieser Konstruktion bietet gegenüber aktuellen MRI-Kontrastmittel. Die große Mehrheit der US-FDA-zugelassenen MRI-Kontrastmittel sind Gadoliniumchelaten, die paramagnetischen in der Natur sind und eine positive Kontrast durch die Spin-Gitter-Relaxationszeit Mechanismus 6.7.8. Im Vergleich zu einem einzigen Gadolinium-Chelat, das niedrige Signalintensität bietet auf seine eigene, bietet der Einbau von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter der Nanopartikel verbesserte Signalintensität (positiver Kontrast) 3,9. Weiterhin kann die Anwesenheit von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter erhöht die Gesamtspindichte und das Ausmaß der Paramagnetismus der Nanopartikel, die das lokale Magnetfeld in ihrer Umgebung stört, wodurch Negativkontrast durch die Spin-Spin-Relaxationszeit Mechanismus erzeugt wird. Somit funktionieren die Gadolinium enthaltenden Nanopartikel sowohl als T 1 (positiv) und T 2 (negative) Kontrastmittel 10,11.
In einer Untergruppe von Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion ist die Verwaltung der Gadolinium-Kontrastmitteln für die Entwicklung von nephrogener systemischer Fibrose 8,12, 13 in Verbindung gebracht. Diese Beobachtung hat Untersuchungen zum Einsatz alternativer paramagnetische Ionen als Kontrastmittel für aufgefordert MRI. Daher wird die vielseitige Konstruktion der Nanopartikel ausgelegt ist, Manganionen in dem PB Gitter einbauen. Ähnlich wie Gadolinium-Chelaten sind Mangan-Chelate auch paramagnetisch und werden typischerweise verwendet, um positive Signalintensität bei MRI 7,14 bereitzustellen. Wie bei gadoliniumhaltigen PB NPs, die Mangan enthaltende PB NPs auch als T 1 (positiv) und T 2 (negative) Kontrastmitteln.
Um Fluoreszenz-Imaging-Funktionen zu integrieren, werden die Nanopartikel "Kerne" mit einem "biofunktionellen" Schale, bestehend aus dem fluoreszenzmarkierten Glykoprotein Avidin (Abbildung 1 beschichtet). Avidin ermöglicht nicht nur die Fluoreszenz-Bildgebung, sondern dient auch als eine Dockingplattform biotinylierten Liganden, die bestimmte Zellen und Gewebe zielen. Die Avidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten, nicht-kovalente Bindungen, gekennzeichnet durch extrem starke Affinität zwischen Avidin und Biotin 15. Die Befestigung des biotinylierten Liganden an das Avidin-beschichtete PB NPs verleiht molekulare Targeting-Fähigkeiten für die PB-Nanopartikeln.
Die Motivation für die Verfolgung Fluoreszenz- und MR-Bildgebung mit PB-Nanopartikel ist, weil diese bildgebenden Verfahren besitzen komplementäre Funktionen. Fluoreszenzabbildung ist eine der am häufigsten verwendeten optischen molekularen Bildgebung, und ermöglicht die gleichzeitige Darstellung mehrerer Objekte mit hohen Empfindlichkeiten 1,16,17. Fluoreszenz-Imaging ist eine sichere, nicht-invasive Modalität ist jedoch mit geringen Eindringtiefen und räumlichen Auflösungen 1,3,16 verbunden. Andererseits erzeugt MRI hoher zeitlicher eind räumliche Auflösung nicht-invasiv und ohne eine Notwendigkeit für ionisierende Strahlung 1,3,16. Allerdings MRI leidet unter geringer Empfindlichkeit. Daher Fluoreszenz-Bildgebung und MRT wurden als die molekularen Bildgebung aufgrund ihrer komplementären Merkmale der Eindringtiefe, Empfindlichkeit und Ortsauflösung gewählt.
Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese und Biofunktionalisierung der PB-Nanopartikel, gadoliniumhaltigen PB-Nanopartikel (GdPB) und manganhaltigen Nanopartikeln PB (MnPB) 10,11. Die folgenden Methoden werden beschrieben: 1) Messung der Größe, Ladung und zeitliche Stabilität der Nanopartikel, 2) die Bewertung der Zytotoxizität der Nanopartikel, 3) Messung der MRI Relaxivitäten und 4) Nutzung der Nanopartikel für Fluoreszenz- und molekulare MR-Bildgebung einer Population von Zielzellen in vitro. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der nationalen Parlamente für die Verwendung als multimodale, molekulare Kontrastmittel in vivo.
Dieser Artikel wurde die Methoden für die Synthese einer neuen Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Mittel auf Basis von biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel vorgestellt. Die molekularen Bildgebungsmodalitäten in die Nanopartikel aufgenommen sind Fluoreszenzabbildung und molekularen MRI aufgrund ihrer komplementären Funktionen. Die biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel eine Kern-Schale-Design. Die wichtigsten Schritte bei der Synthese dieser Nanopartikel sind: 1) Eintopfsynthese, die di…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
Sonicator | QSonica | Q125 | |
Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
Tube holders | VWR | 82024-342 | |
Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
100 mL round-bottom flask |