Abstract
Multimodal, la imagen molecular permite la visualización de los procesos biológicos a resoluciones celulares, subcelulares, ya nivel molecular utilizando múltiples técnicas de imagen complementarias. Estos agentes de formación de imágenes facilitan la evaluación en tiempo real de las vías y mecanismos in vivo, que mejoran tanto la eficacia diagnóstica y terapéutica. En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes para su uso en aplicaciones de imágenes multimodales, molecular. Las técnicas de imagen incorporados en el nanopartículas, imágenes de fluorescencia y la resonancia magnética (MRI), tienen características complementarias. Los PN PB poseen un diseño de núcleo-corteza donde gadolinio y iones de manganeso incorporados dentro de los espacios intersticiales de la red PB generan contraste MRI, tanto en T1 y T2 y secuencias. Los PN PB están recubiertas con avidina fluorescente usando electrostática auto comoblea, que permite imágenes de fluorescencia. Las nanopartículas recubiertas con avidina se modifican con ligandos biotinilados que confieren posibilidades de marketing moleculares a las nanopartículas. La estabilidad y la toxicidad de las nanopartículas se miden, así como sus capacidades de relajación de MRI. Las capacidades de imágenes multimodales, moleculares de estas biofuncionalizadas PN PB luego se demostraron utilizándolos para imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular in vitro.
Introduction
La imagen molecular es la visualización no invasiva y precisa de los procesos biológicos a nivel celular, subcelular, y los niveles moleculares 1. La imagen molecular permite un espécimen a permanecer en su microambiente nativo mientras que sus vías y mecanismos endógenos son evaluados en tiempo real. Típicamente, la imagen molecular implica la administración de un agente de imagen exógeno en forma de una pequeña molécula, macromolécula, o nanopartículas para visualizar, objetivo, y trazar procesos fisiológicos pertinentes se está estudiando 2. Las diversas modalidades de imagen que se han explorado en imagen molecular incluyen MRI, CT, PET, SPECT, ultrasonido, photoacoustics, espectroscopia Raman, la bioluminiscencia, la fluorescencia y microscopía intravital 3. Multimodal de imágenes es la combinación de dos o más modalidades de imagen donde la combinación mejora la capacidad de visualizar y caracterizar diversos procesos y eventos 4 biológicos. Multimodal de imágenes explota las ventajas de las técnicas de formación de imágenes individuales, mientras que la compensación de sus limitaciones individuales 3.
En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes de imágenes multimodales, molecular. Los PN PB se utilizan para obtener imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular. PB es un pigmento que consiste de la alternancia de hierro (II) y hierro (III) átomos en una red cúbica centrada en las caras (Figura 1). La celosía PB se compone de ligandos cianuro lineales en una Fe II - CN - vinculación Fe III que incorpora cationes para equilibrar las cargas dentro de su red tridimensional 5. La capacidad de PB incorporar cationes en su celosía se explota mediante la carga por separado gadolinio y iones de manganeso en los PN PB para el contraste de resonancia magnética.
La razón fundamental para la consecución de un diseño de nanopartículas para el contraste RM es debidolas ventajas de este diseño ofrece en relación con los agentes de contraste MRI actuales. La gran mayoría de agentes de contraste MRI aprobados por la FDA de Estados Unidos son quelatos de gadolinio que son paramagnéticos en la naturaleza y proporcionan contraste positivo por el mecanismo de relajación 6,7,8-spin celosía. En comparación con un solo gadolinio-quelato que proporciona baja intensidad de señal por sí mismo, la incorporación de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB de las nanopartículas proporciona una mayor intensidad de la señal (contraste positivo) 3,9. Además, la presencia de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB aumenta la densidad de espín general y la magnitud de paramagnetismo de las nanopartículas, que perturba el campo magnético local en su vecindad, generando de ese modo contraste negativo por el mecanismo de relajación espín-espín. Así, las nanopartículas que contienen gadolinio funcionar tanto como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo) 10,11.
En un subgrupo de pacientes con insuficiencia renal, la administración de agentes de contraste con gadolinio se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observación ha llevado a investigaciones sobre el uso de iones paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por lo tanto, el diseño versátil de las nanopartículas está adaptado para incorporar iones de manganeso dentro de la red PB. Similar a gadolinio quelatos, manganeso quelatos también son paramagnéticos y se utilizan normalmente para proporcionar una intensidad de señal positiva en la RM 7,14. Al igual que con gadolinio PB PN, las PB PN contienen manganeso también funcionan como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo).
Para incorporar capacidades de formación de imágenes de fluorescencia, la nanopartícula "núcleos" se recubren con una cáscara "biofuncional" que consiste en la avidina marcada con fluorescencia-glicoproteína (Figura 1). Avidina no sólo permite imágenes de fluorescencia, sino que también sirve como una plataforma de acoplamiento para ligandos biotinilados que se dirigen a las células y tejidos específicos. La unión de avidina-biotina es una de las más fuertes enlaces conocidos, no covalentes caracterizadas por extremadamente fuerte afinidad de unión entre avidina y biotina 15. La unión de ligandos biotinilados a la avidina-revestido PB PN confiere posibilidades de marketing moleculares a los PN PB.
La motivación para la búsqueda de imágenes de fluorescencia y MR usando PB PN se debe a que estas técnicas de imagen poseen características complementarias. Imágenes de fluorescencia es una de las técnicas de imagen molecular óptica más utilizado, y permite la visualización simultánea de múltiples objetos a altas sensibilidades 1,16,17. Imágenes de fluorescencia es una modalidad segura, no invasiva, pero se asocia con bajas profundidades de penetración y resoluciones espaciales 1,3,16. Por otro lado, MRI genera un alto temporald resolución espacial de forma no invasiva y sin necesidad de radiación ionizante 1,3,16. Sin embargo MRI sufre de baja sensibilidad. Por lo tanto, imágenes de fluorescencia y la RM fueron seleccionadas como las técnicas de imagen molecular, debido a sus características complementarias de penetración de profundidad, sensibilidad y resolución espacial.
En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis y biofuncionalización de los PN PB, PB PN (GdPB), y que contiene gadolinio-PB PN (MnPB) 10,11 que contiene manganeso. Los siguientes métodos se describen: 1) medición del tamaño, la carga y la estabilidad temporal de las nanopartículas, 2) Evaluación de la citotoxicidad de las nanopartículas, 3) de medición de relaxividades MRI, y 4) la utilización de las nanopartículas para la fluorescencia y la RM molecular de una población de células diana in vitro. Estos resultados demuestran el potencial de los NPs para uso como agentes de formación de imágenes multimodales, moleculares in vivo.
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Protocol
1. Síntesis de PB PN, GdPB y MnPB
Síntesis de las nanopartículas (PB PN, GdPB o MnPB) se consigue utilizando un esquema de síntesis en un solo recipiente realizando los pasos que se detallan a continuación:
- Prepare la solución de 'A' que contiene 5 ml de 5 hexacianoferrato de potasio mM (II) en agua desionizada (DI). Dependiendo del tipo de nanopartícula se sintetizaron - PB PN, GdPB o MnPB, prepare una solución "B" de la siguiente manera:
- Para PB NPs: Preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de hierro (III) cloruro en agua DI.
- Para GdPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de gadolinio (III) nitrato y hierro (III) cloruro en agua DI
- Para MnPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de manganeso (II) cloruro y hierro (III) cloruro en agua DI.
- Añadir solución "B" a un matraz de fondo redondo, y revolver el contenido del matraz a temperatura ambiente (RT) y1000 rpm. Añadir solución 'A' gota a gota en el fondo redondo frasco que contiene la solución 'B'. Controlar el caudal de la adición de la solución 'A' a 'B' por una bomba peristáltica establecido para dispensar aproximadamente 10 ml / h.
- Continuar agitación a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 30 minutos después de la adición de solución de 'A' a 'B' se ha completado. Detener la agitación y recoger la mezcla.
- Transferir alícuotas de la mezcla en tubos de microcentrífuga para enjuagar las nanopartículas libre de componentes que no han reaccionado. Añadir NaCl 5 M (0,2 ml de NaCl mezcla de reacción / ml) a cada alícuota para ayudar en la recogida de partículas por centrifugación.
- Centrífuga de cada alícuota de nanopartículas durante al menos 10 minutos a 20.000 x g. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante.
- Resuspender cada pastilla de nanopartículas en agua DI 1 ml a través de ultrasonidos utilizando una micropunta (pulso de ultrasonidos on / off = 1.1 seg, amplitud = 50%, duración =5 seg, potencia de ultrasonidos calificación = 125 W) para romper la pastilla.
- Repetir los pasos 1.4 a 1.6 al menos 3 × para asegurar que las nanopartículas están libres de componentes de los subproductos de reacción y de reacción inicial. Después de la centrifugación final, resuspender las partículas en agua DI 1 ml.
2. Biofuncionalización de PB PN, GdPB y MnPB
Biofuncionalización de las nanopartículas consiste en el revestimiento de las nanopartículas "núcleos" con avidina y la adición de ligandos biotinilados como se describe a continuación:
- Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente
Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente se consigue utilizando auto-ensamblaje electrostática donde cargado positivamente avidina (pI ~ 10.5) está revestida en al cargado negativamente nanopartículas de la siguiente manera 18:- Preparar suspensiones de los PN PB, GdPB o MnPB en agua DI 1 ml. Filtra Alexa Fluor 488-etiquetados avidina (A488; reconstituido en agua DI)a través de un filtro de nylon de microcentrífuga de 0,2 micras, con 14.000 × g durante 10 min. Añadir ≤0.2 mg avidina / mg nanopartículas. Añadir los líquidos filtrados de A488 por separado a las alícuotas de PB PN, GdPB o MnPB.
- Póngase en contacto con las nanopartículas con A488 durante 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
NOTA: Este A488 rendimientos paso recubierto PB PN (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), y MnPB (MnPB-A488).
- La unión de anticuerpos con biotina
La unión de los anticuerpos dirigidos biotina en el nanopartículas recubiertas con avidina se logra mediante interacciones avidina-biotina de la siguiente manera:- Preparar suspensiones de los avidina recubierto las nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, y MnPB-A488 en agua DI 1 ml. Filtra anticuerpo biotinilado (suministrada por el fabricante) a través de un filtro de microcentrífuga de 0,2 micras nylon a 14.000 × g durante 10 min.
NOTA: En este sentido, el presente estudio utiliza biotinylated anti-neurona-glía antígeno 2 (ANG2) que se dirige a NG2 sobreexpresa en las células y tejidos del sistema nervioso central y biotinilado eotaxina-3 anti-humana (Eot3) que se dirige a los receptores sobreexpresados en los eosinófilos o líneas de células eosinófilas. - Añadir cada alícuota filtrada de anticuerpo biotinilado por separado a las alícuotas de las nanopartículas recubiertas con avidina. Añadir ≤0.05 mg nanopartículas de anticuerpos / mg de avidina-revestido biotinilado. Póngase en contacto con las nanopartículas recubiertas con avidina con los anticuerpos con biotina (Ang2 o Eot3) para 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
NOTA: Este anticuerpo rendimientos paso nanopartículas recubiertas (por ejemplo GdPB-A488-Eot3 y MnPB-A488-Ang2).
- Preparar suspensiones de los avidina recubierto las nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, y MnPB-A488 en agua DI 1 ml. Filtra anticuerpo biotinilado (suministrada por el fabricante) a través de un filtro de microcentrífuga de 0,2 micras nylon a 14.000 × g durante 10 min.
3. Dimensionamiento, Potencial Zeta, y Temporal de estabilidad de las nanopartículas
La distribución de tamaño, carga, y la estabilidad de las nanopartículas se miden utilizando dinámicamétodos de dispersión de luz (DLS) como se describe a continuación:
- Dimensionamiento de las nanopartículas
Dimensionamiento de las nanopartículas se consigue utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:- Añadir 10 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 l de agua DI en una cubeta de plástico desechable.
NOTA: Este es el valor representativo para una buena señal de DLS. - Tapar la cubeta y agitar para mezclar bien. Colocar la cubeta en un sistema utilizado para analizar el tamaño de partícula con el fin de medir el tamaño de las nanopartículas. Realizar análisis de tamaño de partícula en un ángulo de medición de 173 °.
- Añadir 10 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 l de agua DI en una cubeta de plástico desechable.
- Potencial Zeta de las nanopartículas
Zeta potencial de las nanopartículas se mide usando el análisis de fase de dispersión de luz como sigue:- Añadir 100 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 900 l de agua DI en una célula capilar de plástico desechable. Este valor es representativo para una buena medición del potencial zeta.
- Coloque el capilary celular en un sistema utilizado para analizar el potencial zeta con el fin de medir el potencial zeta de las nanopartículas utilizando los parámetros por defecto a 25 ° C.
- Estabilidad temporal de las nanopartículas
La estabilidad temporal de las nanopartículas se mide utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:- Evaluar la estabilidad de las nanopartículas mediante la medición de los tamaños de las nanopartículas en agua DI, así como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) como se describe en el apartado 3.1.
- Repetir las mediciones de tamaño en el agua DI y DMEM una vez / día durante un período de 5 días.
4. La citotoxicidad de las nanopartículas
La citotoxicidad de las nanopartículas se mide usando un ensayo de proliferación celular XTT como sigue:
- Semilla 10.000-15.000 células / pocillo de cada tipo de células estudiadas (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, y OE21) en una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen total de células sembradas no EXceed 0,2 ml / pocillo. Incubar las células sembradas toda la noche a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Ponerse en contacto con las nanopartículas con las células:
- Se incuban las células con concentraciones variables de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte la Tabla 1 como una mesa representativa que se describen las cantidades de las nanopartículas (de 50 l) a las células después de la eliminación de 50 l de medio / pocillo.
- Para tener en cuenta cualquier absorbancia interferir de las nanopartículas en el ensayo, agregar un espacio en blanco que consiste en la concentración adecuada de nanopartículas (0-0,5 mg / ml, en equivalencia a los importes añadidos a las células) a medio sin células.
- Se incuban las células con nanopartículas durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2. Aspirar los medios de comunicación de cada bien y enjuague con tampón de tinción compuesto por suero bovino fetal al 5% (FBS) en solución amortiguadora de fosfato (PBS). Añadir 100 l de medio sin rojo de fenol y se incuba a CO 2 37 ° C y 5%de 16 a 18 h.
- Se incuban las células con concentraciones variables de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte la Tabla 1 como una mesa representativa que se describen las cantidades de las nanopartículas (de 50 l) a las células después de la eliminación de 50 l de medio / pocillo.
- Preparar la solución de trabajo Ensayo de proliferación XTT de la célula mediante la mezcla de los componentes del kit de reactivos XTT (XTT y activador) según las especificaciones del fabricante. Aspirar los medios de comunicación de los pocillos y añadir 100 l de RPMI (RPMI w / o fenol 10% de SFB rojos + + 1 × Pen-Strep) o medio apropiado para el tipo de células estudiado. Añadir 50 l de solución de trabajo de XTT a cada pocillo e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2-2,5 h.
- Medir la absorbancia a 490 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm para corregir las huellas o manchas. Calcular la absorbancia corregida para cada pozo (A 490-A 630) y promedio de las lecturas de repeticiones.
- Restar las lecturas en blanco de cada valor bien para calcular los valores de absorbancia corregidos finales. Calcular el porcentaje de supervivencia para cada muestra por la normalización de la absorbancia final corregido a la de las células no tratadas y sin nanopartículas. Terreno Doporcentaje rvival como una función de la concentración de nanopartículas.
5. MRI capacidades de relajación de los PN PB, GdPB y MnPB
MRI de relajación se mide usando T 1 - y la secuencia T2 y por la preparación de un "fantasma" MRI utilizando una placa de 96 pocillos que contiene nanopartículas como se describe a continuación:
- Preparación Phantom
- Preparar una placa de 96 pocillos conteniendo cada pocillo 100 nanopartículas mu l (PB PN, GdPB o MnPB) a la concentración adecuada. Comenzando con una concentración de 0,4 mM para cada tipo de nanopartícula, en serie diluir las nanopartículas 2 × usando agua DI hasta una concentración de 2,4 × 10 -5 M se alcanza (esto requiere 14 diluciones y 15 pozos).
- Añadir 100 l de solución de agarosa fundida al 1% en agua DI en cada pocillo y mezclar bien. Deje que el gel solidifique a 4 ° C durante 12 h.
NOTA: Esto produce un fantasma que contiene diluciones en serie delas nanopartículas en agarosa solidificada. - Coloque el fantasma en una horizontal 3 T imán clínica bajo un bloque sólido de 2% de agar (150 cm 3). Asegurar el fantasma y el bloque de agar en el centro de una bobina de cerebro HD de 8 canales. Medir los tiempos de relajación utilizando 0,5 mm de espesor cortes coronales en la mitad de la altura de la placa de 96 pocillos 11.
- T 1 - y la secuencia T2
Utilice los siguientes valores representativos para la adquisición de las secuencias en el imán clínica.
NOTA: Estos valores están optimizados para las nanopartículas utilizadas en el presente estudio:- Adquirir T 1 ponderadas imágenes (T1W) MR usando la siguiente recuperación de fluido inversión atenuada (FLAIR) secuencia: Echo de tren (ET) = 8, el tiempo de repetición (TR) = 2300 ms, tiempo de eco (TE) = 24,4 ms, el tamaño de la matriz = 512 x 224, campo de visión (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Adquirir T 2 ponderadas imágenes (T2W) MR usando la siguiente relaxa rápidorápida secuencia de la spin eco (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 ms; TE = 104 mseg; Tamaño de la matriz = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
- Adquirir T1W y T2W MR imágenes a 127 MHz (3 T) en los siguientes horarios de inversión: 50, 177, 432, 942, 1.961 y 4.000 ms.
- Medir las capacidades de relajación MRI
- Después de adquirir T1W y T2W imágenes usando las secuencias descritas en la sección 5.2, medir la intensidad de la señal para cada pozo usando ImageJ, en adelante designada como la región de interés (ROI) mediante la selección de cada ROI usando el botón ovalado cultivo se encuentra en la barra de herramientas principal, a continuación, seleccionando Análisis> Medida.
NOTA: Un pop-up debe mostrar la intensidad de la señal media de cada ROI bajo la columna "Media". - Para cada ROI, trazar la intensidad de la señal medida en contra de su inversión de tiempo específico. Si es necesario, los puntos invertidos (lecturas) que generan una "burbuja" inicial o valores atípicos en el comienzo de la trama (inversión más bajaveces).
NOTA: Estas lecturas se generan a veces bajas de inversión porque MRI mide el valor de magnitud o absoluta de imágenes en lugar de su valor real (negativo), que debe tenerse en cuenta / corregido para 19. - Preparar un ajuste exponencial para cada parcela de intensidad de la señal para el rendimiento de la inversión (SI) vs. tiempos de inversión (T I) como se describe en el apartado 5.2. Parcela T I en el eje x, SI en el eje y; ɑ y Δ son constantes determinadas por regresión, y T 1 o T 2 es la variable que hay que resolver:
donde t = T 1, T 2. - Resuelve para T 1 o T 2 usando la ecuación anterior y trazar la inversa de los valores calculados (1 / T 1 y 1 / T 2) contra las concentraciones de las nanopartículas utilizadas en cada ROI.
- Calcular la pendiente de la gráfica lineal quelos rendimientos de las capacidades de relajación R1 y R2.
NOTA: La siguiente sección del protocolo describe la aplicación de las nanopartículas para el marcaje fluorescente y la generación de contraste de RMN en las células diana.
- Después de adquirir T1W y T2W imágenes usando las secuencias descritas en la sección 5.2, medir la intensidad de la señal para cada pozo usando ImageJ, en adelante designada como la región de interés (ROI) mediante la selección de cada ROI usando el botón ovalado cultivo se encuentra en la barra de herramientas principal, a continuación, seleccionando Análisis> Medida.
6. El etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Microscopía Confocal
NOTA: Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se puede utilizar para etiquetar fluorescentemente una población de células diana (monitorizada por microscopía confocal) como sigue:
- Síntesis de la fluorescente Nanopartículas
- Sintetizar GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 para el marcaje fluorescente de una población de células diana siguiendo los pasos que se detallan en los apartados 1 y 2.
- Preparación de las células para Fluorescencia Orientación
- Escudo no. 1.5 micro cubreobjetos sumergiéndolos en una solución de 0,002% de poli (L-lisina) bromhidrato de 90 min. Retire las cubiertas de vidrio de la solución y dejar que se sequen durante 24 horas.
- Las semillas de las células (por ejemplo EoL-1, D10 BSG, SUDIPG1) en las cubiertas de vidrio recubiertos colocados en una placa de 6 pocillos e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante al menos 16 horas. Enjuagar las células con una solución de 1 × PBS y (opcional) fijar con 10% de formaldehído en solución tampón neutro durante 15 min. Las células se tiñen con tinte rojo-naranja 5 mM de células permeant en PBS a 37 ° C durante 30 minutos. Posteriormente, lavar las células con PBS.
- > Marcaje fluorescente de células diana
- Añadir 1% de albúmina de suero bovino (BSA; en agua DI) a las células para minimizar la unión no específica en las células, y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
- Se incuban las células con las nanopartículas en 1% de BSA durante 1 hora. Para EoL-1: incubar con 0,2 mg / ml GdPB-A488 o GdPB-A488-Eot3; Para BSG D10 y SUDIPG1: incubar con 0,2 mg / ml MnPB-A488 o MnPB-A488-ANG2. Enjuague las células con PBS 3 x para eliminar unbounanopartículas nd.
- Invertir con cuidado la cubierta de vidrio (que contiene células y nanopartículas) en un portaobjetos de microscopio, asegurándose de que no haya burbujas de aire atrapadas. Selle el borde entre la cubierta de vidrio y portaobjetos de microscopio aplicando cuidadosamente esmalte de uñas transparente. Imagen de las células utilizando un microscopio láser confocal de barrido.
7. Etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Citometría de Flujo
Las nanopartículas (PB NPs, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para la etiqueta fluorescente una población de células diana (monitorizada por citometría de flujo) como sigue:
- Preparar suspensiones de las células en la mira en PBS. Para estudios de cultivos puros, las suspensiones constan de un solo tipo de células (por ejemplo, BSG D10); resuspender un sedimento celular de las células D10 BSG en PBS a 100.000 células / ml (10 ml en total). Para los estudios de cultivo mixto, las suspensiones constan de al menos dos tipos de células (por ejemplo EoL-1 y OE21); similar a D10 BSG, sedimentos celulares resuspender de EoL-1 y OE21 en PBS a 100.000 células / ml cada una (10 ml en total).
- Preparar relaciones variables de EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml cada uno de EoL-1 y OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Bloquee las células (suspensiones puras y mixtas) en la mira de las nanopartículas con 2 ml de BSA al 5% para minimizar la unión no específica.
- Añadir 1 ml (1 mg / ml) nanopartículas a las células y se incuba durante 1 hr. Para BSG D10, incubar las células con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticuerpo de control), o MnPB-A488-ANG2). Para las mezclas de EoL-1 y OE21, incubar las mezclas con una cantidad fija de GdPB-A488-Eot3.
- Enjuagar las células libres de nanopartículas no unidos desacelerándose las muestras a 1000 × g durante 5 min al menos 3 × para eliminar las partículas no unidas. Resuspender las células en 1 ml de PBS y fijar con 10% de formaldehído en PBS. Células de tinción por incubación con 10 mg / ml7-Aminoactinomytcin D en PBS en hielo durante 30 min. Enjuagar con PBS, a continuación, analizar 10.000 células cerradas de cada muestra utilizando un citómetro de flujo.
8. Generación de resonancia magnética de contraste sobre las células que se hayan empleado las nanopartículas
Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para generar contraste MRI (en ambos T 1 - y la secuencia T2) en una población de células diana de la siguiente manera:
- Preparación Phantom
- Se cultivan las células (por ejemplo BSG D10) en matraces T75 hasta ~ 80% de confluencia. Utilice medio y condiciones de cultivo adecuado. Para BSG D10, crecer las células en DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Enjuague libre de medio de células con 5 ml de PBS y bloquear las células con 5 ml 1% de BSA en PBS durante 1 hr para minimizar la unión no específica. Añadir 5 ml (0,5 mg / ml) nanopartículas a las células. Para BSG D10, incubar las células con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticuerpo de control), y MnPB-A488-ANG2 durante 1 hora.
- Enjuague las células 3 veces con 5 ml de PBS para eliminar las nanopartículas no consolidados. Tripsinizar las células por incubación de las células con 2 ml de tripsina EDTA solución de 0,25% 1 × para 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2 para separarlas del matraz para la preparación fantasma. Añadir 8 ml de DMEM para saciar el tratamiento con tripsina de las células.
- Recoger las células por centrifugación ellos en 1000 × g durante 5 min; Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de PBS y se añade 1 ml de formaldehído al 10% en PBS para fijar las células. Añadir 100 l de cada muestra a un pocillo separado de una placa de 96 pocillos.
- Añadir 100 l de solución de agarosa fundida al 1% en agua DI en cada pocillo y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Deje que el gel solidifique a 4 ° C durante 12 h.
NOTA: Esto produce un fantasma que contiene células con nanopartículas adjuntos en agarosa solidificada. - Coloque el fantasma en una horizontal 3 T imán clínica al lado de un bloque sólido de 2% de agar (150 cm
- T 1 - y la secuencia T2
Utilice los siguientes parámetros para la adquisición de las secuencias en la clínica MRI imán:- Adquirir imágenes T1W MR mediante la siguiente secuencia de eco de espín: Echo de tren (ET) = 1, tiempo de repetición (TR) = 650 ms, tiempo de eco (TE) = 11 ms, el tamaño de la matriz = 320 x 256, Campo de visión (FOV) = 10 x 10 cm 2.
- Adquirir imágenes T2W MR utilizando la siguiente secuencia FRFSE: ET = 28; TR = 3000 ms; TE = 101 mseg; Tamaño de la matriz = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Procesamiento posterior a la adquisición
- Para facilitar la lectura, convertir las imágenes originales de escala de grises de una imagen en escala de color utilizando ImageJ en: Seleccione Imagen> Tipo> 8-Bit, para convertir la imagen a escala de grises.
- Calcular la intensidad normalizada para cada muestra después de restar la contribución de la señal de la solución de agarosa.
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Representative Results
Usando el esquema de síntesis en un solo recipiente, las nanopartículas de Pb NPs (diámetro medio de 78,8 nm, índice de polidispersidad (PDI) = 0,230; calculada por el instrumento de dispersión de luz dinámica), GdPB, o MnPB (diámetro de 164,2 nm, PDI = 0,102 significa) ( diámetro medio 122,4 nm, PDI = 0,124) que son monodispersas (medido por DLS) se puede sintetizar constantemente (Figura 2A). Los potenciales zeta medidos de las nanopartículas sintetizadas están a menos de -30 mV (Figura 2B), lo que indica la estabilidad moderada de las partículas en función de sus cargas superficiales. Las nanopartículas sintetizadas presentan una estabilidad temporal adecuada durante un período de 5 días como se indica por sus tamaños consistentes (diámetros hidrodinámicos; Figura 2C).
Cuando se co-incubaron con las células, las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) exhiben citotoxicidad insignificante a las células por debajo de ciertas concentraciones umbral (Figura 3). Stu citotoxicidadtroqueles de Pb NPs en las células Neuro2a indican citotoxicidad insignificante cuando-incubadas con co Neuro2a a concentraciones inferiores a 0,67 × 10 -6 mg / célula (Figura 3A). Los estudios de citotoxicidad llevados a cabo por la co-incubación de las células con GdPB EoL-1 y OE21 indican citotoxicidad insignificante de GdPB en ambos tipos de células en concentraciones inferiores a 0,25 × 10 -6 mg / célula (Figura 3B). Similar, estudios de citotoxicidad indican citotoxicidad insignificante de MnPB cuando se co-incubaron con BSG D10 a concentraciones inferiores a 0,25 × 10 -6 mg / célula (Figura 3C). La citotoxicidad adicional de MnPB y GdPB se puede atribuir a la presencia de iones adicionales (Mn 2+ para MnPB y Gd 3+ para GdPB) dentro del núcleo de las nanopartículas.
Se realizaron estudios de resonancia magnética utilizando relaxividad fantasmas formados por diferentes concentraciones de PB PN, GdPB y MnPB. Los estudios indican la utilidad de la nanopartículos como agentes de contraste de resonancia magnética en tanto T1W y secuencias T2W (Figura 4). Esto se demuestra por el aumento de las hiperintensidades (contraste positivo) en T 1-ponderada secuencias y el aumento de hipointensidades (contraste negativo) en la secuencia T2 con concentraciones crecientes de tanto GdPB (Figura 4A) y MnPB (Figura 4B). Basado en las mediciones de capacidad de relajación, MnPB es un moderado T 1 agente y un fuerte agente de T 2, mientras que GdPB es un fuerte T 1 agente y un agente de moderada T 2 (Figura 4C). Los relaxividades medidos de GdPB y MnPB se comparan favorablemente con los de agentes de contraste clínicamente aprobados 10, 11.
Los PN PB biofuncionalizadas son capaces de marcar con fluorescencia una población de células diana in vitro (Figura 5). Cuando biofuncionalizadas tanto con avidina fluorescente (A488) y biotina e antihumanootaxin-3 de anticuerpos (Eot3), GdPB puede apuntar con fluorescencia una población de EoL-1 células (Figura 5B). Nanopartículas de control GdPB sin Eot3 exhiben una unión insignificante (Figura 5A) Del mismo modo, cuando se GdPB biofuncionalizadas tanto con avidina fluorescente (A488) y biotinilado anti-neuronal glial antígeno-2 (ANG2), las nanopartículas pueden dirigirse a poblaciones de fluorescencia BSG D10 y neuroesferas SUDIPG1 (Figuras 5D y F), mientras que las nanopartículas de control sin el anticuerpo dirigido no pueden etiquetar con fluorescencia las células (Figuras 5C y E). Por lo tanto, la selección eficiente y etiquetado fluorescente requieren la presencia tanto de avidina fluorescente y el ligando de direccionamiento biotinilado.
La capacidad de las nanopartículas biofuncionalizadas para etiquetar fluorescentemente una población de células, tal como se cuantifica por citometría de flujo, confirma la necesidad de que tanto la avidina y biotina fluorescenteligando ylated de metas para el marcaje fluorescente efectiva (Figura 6). Células D10 BSG en contacto con MnPB que contiene tanto A488 y ANG2 (MnPB-A488-ANG2) presentan aumento de fluorescencia (Figura 6A) y el porcentaje de células marcadas con fluorescencia (Figura 6B) en comparación con el control de nanopartículas fluorescentes con un anticuerpo de control (MnPB-A488 -abc) y sin un anticuerpo (MnPB-A488). Las nanopartículas biofuncionalizadas son capaces de dirigir de manera fluorescente una sub-población específica de células dentro de una mezcla de células (Figura 6C). Esto se demuestra como cantidades fijas de EoL-1-focalización, GdPB fluorescente (GdPB-A488-Eot3) se ponen en contacto con las células diana (EOL-1) y células de control (OE21). La fluorescencia se incrementa como proporciones de EoL-1 se incrementan (aumento de la intensidad de la señal Alexa Fluor 488; Figura 6C) dentro de la mezcla. Esto indica la especificidad de las nanopartículas para esta subpoblación de células dentro de la cemezcla ll.
Los PN PB biofuncionalizadas aumentar MRI contraste en una población de células diana (Figura 7). Cuando se ponen en contacto células D10 BSG con concentraciones equivalentes de experimental (MnPB-A488-ANG2) y control (MnPB-A488-ABC y MnPB-A488) nanopartículas, fantasmas presentan un aumento de hiperintensidad de células en contacto con MnPB-A488-ANG2 en comparación con los controles en secuencias T1W, y el aumento de hipointensidad para células puestas en contacto con MnPB-A488-ANG2 comparación con los controles en las secuencias de T2W (Figura 7A). Análisis de la imagen de las ROIs dentro del espectro confirman esta tendencia en la que células puestas en contacto con las partículas experimentales presentan una mayor intensidad significativamente en comparación con los controles en las secuencias de T1W y disminuyó significativamente la intensidad relativa a los controles en las secuencias de T2W (Figura 7B).
Figura 1: El diseño de núcleo-corteza de los PN PB. El núcleo consiste en un enrejado de PB, que se compone de ligandos cianuro lineales en una Fe II - CN -. Vinculación Fe III Estos enlaces permiten PB NPs para incorporar cationes dentro de su red tridimensional como un medio de equilibrar cargas 5. Esta capacidad de unión de cationes del azul de Prusia se utiliza para cargar gadolinio y iones de manganeso dentro de la red, que proporciona contraste MRI. El núcleo se recubre con una cáscara biofuncional compuesto de avidina fluorescente para permitir imágenes de fluorescencia y los ligandos biotinilados para permitir la orientación molecular.
Figura 2:. Tamaño, carga, y la estabilidad de los PN PB (A) las distribuciones de tamaño para el PB (azul), GdPB (rojo) y MnPB (negro) Nanopartículas mide por DLS. (B (C) La estabilidad temporal de PB (azul), GdPB nanopartículas en agua (rojo) y MnPB (negro) (sólido) y DMEM (punteada) durante cinco días después de su síntesis, medido por DLS.
Figura 3:. La citotoxicidad de los NPs PB Los estudios de citotoxicidad utilizando diversas concentraciones de (A) PB NPs añade a un número fijo de células Neuro2a (B) GdPB añade a una cantidad fija de EoL-1 y las células OE-21, respectivamente, y ( C) MnPB añade a un número fijo de células D10 BSG. Tasa de supervivencia de la célula se calculó en 24 y 48 hr. Reproducido con permiso de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 con permiso de Dove Press Ltd; Ref 21 y con el permiso de la Royal Society of Chemistry.
Figura 4: Las imágenes de RM y relaxividades de GdPB y MnPB en 3 T. Hiperintensidad en T 1-ponderada secuencias y hipointensidad en T2 y secuencias de (A) GdPB y (B) MnPB como función de la concentración de las nanopartículas. (C) Tabulación de los relaxitivies de PB PN, GdPB y MnPB medidos a 3 T. Reproducido con permiso de la referencia 11, copyright 2014 American Chemical Society.
Figura 5: etiquetado fluorescente de células diana utilizando los NPs PB biofuncionalizadas, medido por microscopía de escaneo láser confocal imágenes de las células por EOL 1 tratados con control (A) (GdPB-A488) y (B) experimental (GdPB-A488-Eot3. nanopartículas).Imágenes de neuroesferas BSG tratados con control (C) (MnPB-A488) y (MnPB-A488-Ang2) nanopartículas experimentales (D). Imágenes de neuroesferas SUDIPG1 tratados con control (E) (MnPB-A488) y (F) experimentales (MnPB-A488-Ang2) nanopartículas. Reproducido con permiso de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: etiquetado fluorescente de células diana utilizando los PN PB biofuncionalizadas, medida por citometría de flujo (A) citometría de histogramas de células D10 BSG tratados con experimental (MnPB-A488-ANG2) y control (MnPB-A488-ABC y MnPB flujo. -A488) nanopartículas. (B) Percentaje de células D10 BSG del panel (A) que son fluorescentes (% de Alexa-Fluor positivo) tras el tratamiento con experimental (MnPB-A488-ANG2) y control (MnPB-A488-ABC y MnPB-A488) nanopartículas, ** p <0,05. (C) La citometría de flujo gráficos de dispersión de una mezcla de células que contiene proporciones variables de (células de control) EoL-1 (células diana) y OE21 mira de las nanopartículas (GdPB-A488-Eot3). Reproducido con permiso de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society y de la referencia 10 con permiso de Dove Press Ltd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. El aumento de contraste de RMN en las células diana utilizando los PN PB biofuncionalizadas (A) T 1-ponderada y T <sub> 2-ponderada realce de contraste en fantasmas formados por un número fijo de células D10 BSG tratados con experimental (MnPB-A488-ANG2) y control (MnPB-A488-ABC y MnPB-A488) nanopartículas. (B) la intensidad de la señal normalizada para las células tratadas con BSG D10 experimental (MnPB-A488-ANG2) y control (MnPB-A488-ABC y MnPB-A488) nanopartículas, ** p <0,05. Reproducido de la referencia 10 con permiso de Dove Press Ltd.
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Discussion
Este artículo ha presentado los métodos para la síntesis de una nueva clase de agentes formadores de imágenes multimodales, moleculares basados en nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas. Las técnicas de imagen molecular incorporados en las nanopartículas son imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular, debido a sus características complementarias. Las nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas tienen un diseño de núcleo-corteza. Los pasos clave en la síntesis de estas nanopartículas son: 1) en un solo recipiente de síntesis que produce los núcleos que están compuestos de nanopartículas azul de Prusia (PB PN), nanopartículas azul de Prusia que contienen gadolinio (GdPB), o el azul de Prusia que contiene manganeso nanopartículas (MnPB), 2) biofuncionalización de las nanopartículas utilizando avidina fluorescente por auto-ensamblaje electrostática, y 3) de fijación de los ligandos biotinilados (anticuerpos) a las nanopartículas utilizando robustas interacciones avidina-biotina. Tanto la avidina fluorescente y los ligandos biotinilados constituyen la bioFshell unctional de las nanopartículas.
La síntesis de un solo recipiente produce PB PN, GdPB o MnPB que funcionan a la vez como T 1 y T 2 agentes de contraste para resonancia magnética. Las cantidades de los iones paramagnéticos (gadolinio o manganeso) cargados en el núcleo de nanopartículas pueden ser alteradas (aumento o disminución) variando las cantidades de las sales que contienen iones paramagnéticos (gadolinio (III) nitrato y manganeso (II)) en el la síntesis de un solo recipiente (Paso 1.2). Esto da como resultado alterado (aumentado o disminuido) intensidades de señal de MRI. Sin embargo, estas modificaciones en el esquema de síntesis puede resultar en inestabilidad, nanopartículas agregadas. Para mitigar las preocupaciones asociadas con la agregación, la síntesis de un solo recipiente puede modificarse para incorporar tamaño agentes de control, tales como citrato de nivelación durante la síntesis 20.
Biofuncionalización de los núcleos de nanopartículas se consigue por auto-ensamblaje electrostático con avidina fluorescente, que enabimágenes de fluorescencia les. Auto-ensamblaje electrostática requiere cargas opuestas en la superficie de las nanopartículas y el polímero de recubrimiento (en este artículo, avidina fluorescente). Para alterar la funcionalidad superficie de las nanopartículas, la avidina puede sustituirse por polímeros cargados positivamente (por ejemplo, polilisina o un grupo amina que contiene polietilenglicol) durante la síntesis. Sin embargo las proporciones relativas de las nanopartículas y polímero de recubrimiento tendrán que ser optimizada para mantener el tamaño de las nanopartículas y la estabilidad y para evitar la agregación.
La adición de los anticuerpos con biotina en el nanopartículas recubiertas con avidina confiere posibilidades de marketing moleculares a las nanopartículas a base de PB. Esta etapa se basa en la interacción sólida entre avidina y biotina (constante de equilibrio de disociación, Kd ~ 10 -15). Como con los pasos anteriores, las proporciones relativas de las nanopartículas recubiertas con avidina y ligandos biotinilados necesitan ser opoptimi- a fin de evitar el ligando biotinilado de la unión simultánea de dos nanopartículas recubiertas con avidina resultantes en la agregación de nanopartículas. Para la orientación molecular, los anticuerpos pueden ser sustituidos por otros ligandos dirigidos tales como fragmentos de anticuerpos (Fab), fragmento variable de cadena sencilla (scFv), péptidos, o aptámeros.
Las principales ventajas de este método para sintetizar nanopartículas biofuncionalizadas como multimodal, agentes de imágenes moleculares son: 1) fácil de un solo recipiente (1 paso) la síntesis de los núcleos de nanopartículas, y 2) etapas de contacto secuencial (autoensamblaje electrostático y avidina interacciones biotina) para recubrir el núcleo de nanopartículas con una cáscara biofuncional. Otras ventajas de las nanopartículas incluyen el hecho de que el azul de Prusia (vendido como Radiogardase) ya está aprobado por la FDA para uso humano y que las nanopartículas que resulta de la esquema de síntesis de un solo recipiente se puede utilizar como un agente de contraste MRI tanto en T 1 ( positivo) y T 2 </ Sub> secuencias ponderadas (negativos), que no se consigue fácilmente utilizando otros medios de contraste o plataformas de nanopartículas sin esquemas de síntesis complicados o productos químicos especializados para la síntesis de los agentes de contraste. Una limitación de esta técnica es que la síntesis puede conducir a nanopartículas polidispersos con agregados si las proporciones relativas de los reactivos en las etapas tanto de síntesis de nanopartículas de núcleo y revestimiento de cáscara biofuncional no son rigurosamente optimizados para los reactivos utilizados en los pasos particulares. Por ejemplo, las proporciones relativas para el recubrimiento de los núcleos de nanopartículas con avidina no se pueden extender para el revestimiento de las nanopartículas con polilisina sin estudios de optimización previos.
Después de dominar la técnica para sintetizar nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas descritos aquí, este diseño versátil se puede modificar para los estudios de imagen molecular in vivo. Esto requerirá PEGilación de las nanopartículas de menor immunogenicity y tiempos de circulación más largos en vivo. Similar al diseño descrito aquí, los NPs PB puede biofuncionalizadas con anticuerpos anteriores a la administración in vivo. Otros estudios incluyen el uso de los NPs biofuncionalizadas PB para aplicaciones in vivo teranóstico (diagnóstico terapia simultánea +). Los estudios que investigan el uso de nanopartículas azul de Prusia para la terapia fototérmica (en base a sus características de absorción a longitudes de onda del infrarrojo cercano) Actualmente en marcha 21.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
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