Abstract
Multimodale, moleculaire beeldvorming kan de visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau resoluties met behulp van meerdere, complementaire beeldvormende technieken. Deze beeldvormende middelen vergemakkelijken het real-time evaluatie van trajecten en mechanismen in vivo, waarbij zowel diagnostische en therapeutische werking versterken. Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) - een nieuwe klasse van middelen voor gebruik in multimodale, moleculaire beeldvorming toepassingen. De beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes, fluorescentie beeldvorming en magnetische resonantie imaging (MRI), complementaire functies. De PB NP's beschikken over een kern-schil design waarbij gadolinium en mangaan ionen opgenomen in de interstitiële ruimten van de PB rooster genereren MRI contrast, zowel in T1 en T2-gewogen sequenties. De PB NP zijn gecoat met fluorescerende avidine middels elektrostatische zichzelf alstage, die fluorescentie beeldvorming mogelijk maakt. Het avidine gecoate nanodeeltjes gemodificeerd met gebiotinyleerde liganden die moleculaire gebied en de nanodeeltjes verlenen. De stabiliteit en de toxiciteit van de nanodeeltjes gemeten, evenals hun MRI relaxiviteiten. De multimodale, moleculaire beeldvorming mogelijkheden van deze biofunctionalized PB NP's worden vervolgens aangetoond door ze te gebruiken voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI in vitro.
Introduction
Moleculaire beeldvorming is de niet-invasieve en gerichte visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau 1. Moleculaire beeldvorming maakt een model in zijn inheemse micro blijven terwijl de endogene wegen en mechanismen worden beoordeeld in real-time. Typisch moleculaire beeldvorming omvat de toediening van een exogene beeldvormingsmiddel in de vorm van een klein molecuul, macromolecuul, of nanodeeltjes te visualiseren, doel en sporenelementen relevante fysiologische processen bestudeerd 2. De verschillende beeldvormende modaliteiten die zijn onderzocht in de moleculaire beeldvorming onder MRI, CT, PET, SPECT, echografie Fotoakoestiek, Raman spectroscopie, bioluminescentie, fluorescentie, en opklaren 3. Multimodale beeldvorming is de combinatie van twee of meer beeldvormende modaliteiten waarbij de combinatie vergroot het vermogen te visualiseren en karakteriseren verschillende biologische processen en gebeurtenissen 4. Multimodal beeldvorming maakt gebruik van de sterke punten van de individuele beeldvormende technieken, terwijl compenseren hun individuele beperkingen 3.
Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) - een nieuwe klasse van multimodale, moleculaire beeldvorming agenten. De PB NP worden gebruikt voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI. PB is een pigment dat bestaat uit afwisselende ijzer (II) en ijzer (III) atomen in een face-centered cubic netwerk (figuur 1). De PB rooster bestaat uit lineaire cyanide liganden in een Fe II - CN - Fe III verbinding die kationen bevat om belastingen in het driedimensionale netwerk 5 evenwicht. Het vermogen van PB om kationen te integreren in haar rooster wordt uitgebuit door afzonderlijk laden gadolinium en mangaan ionen in de PB NP voor MRI contrast.
De reden voor het nastreven van een nanodeeltje ontwerp voor MRI contrast is vanwegede voordelen van dit ontwerp biedt ten opzichte van de huidige MRI-contrastmiddelen. De overgrote meerderheid van de Amerikaanse FDA goedgekeurde MRI contrastmiddelen gadolinium chelaten die paramagnetisch van aard en geven positieve contrast door de spin-rooster relaxatie mechanisme 6,7,8. In vergelijking met een gadolinium-chelaat dat lage signaalintensiteit verschaft op zichzelf biedt de inbouw van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB van de nanodeeltjes verhoogde signaalintensiteit (positief contrast) 3,9. Verder is de aanwezigheid van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB verhoogt de algehele spindichtheid en de omvang van paramagnetisme van de nanodeeltjes, die het lokale magnetische veld in de nabijheid ervan verstoort, en zo werden negatief contrast door de spin-spin relaxatietijd mechanisme. Dus de gadoliniumbevattende nanodeeltjes functioneren zowel als T 1 (positief) en T 2 (negatief) contrastmiddelen 10,11.
In een subgroep van patiënten met een verminderde nierfunctie, is de toediening van gadolinium gebaseerde contrastmiddelen in verband gebracht met de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose 8,12, 13. Deze observatie heeft een onderzoek gevraagd naar het gebruik van alternatieve paramagnetische ionen als contrastmiddelen voor MRI. Daarom wordt de veelzijdige ontwerp van de nanodeeltjes aangepast aan mangaanionen integreren in de PB rooster. Vergelijkbaar met gadoliniumchelaten, mangaan-chelaten ook paramagnetisch en worden typisch gebruikt om positieve signaalintensiteit verstrekken MRI 7,14. Zoals gadoliniumbevattende PB NP, de op mangaan bevattende PB NP tevens fungeren als T1 (positief) en T2 (negatief) contrastmiddelen.
Om fluorescentie beeldvorming capaciteiten omvatten, worden de nanodeeltjes "kernen" bekleed met een "biofunctionele" schil bestaande uit de fluorescentie-gemerkt glycoproteïne avidine (Figuur 1). Avidine niet alleen mogelijk fluorescentie beeldvorming, maar dient ook als een docking platform gebiotinyleerde liganden die specifieke cellen en weefsels richten. Het avidine-biotine binding is een van de sterkste bekende niet-covalente bindingen gekenmerkt door zeer sterke bindingsaffiniteit tussen avidine en biotine 15. De binding van gebiotinyleerde liganden aan de met avidine beklede PB NPs verleent moleculaire gebied en de PB NPs.
De motivatie voor het nastreven van fluorescentie en MR beeldvorming met behulp PB NP is omdat deze beeldvormende modaliteiten beschikken over complementaire functies. Fluorescentie beeldvorming is een van de meest gebruikte optische moleculaire beeldvorming, en voorziet in de gelijktijdige weergave van meerdere objecten hoge gevoeligheden 1,16,17. Fluorescentie beeldvorming is een veilige, niet-invasieve modaliteit, maar gaat gepaard met lage diepte van penetratie en ruimtelijke resoluties 1,3,16. Anderzijds, MRI genereert hoge temporele eend ruimtelijke resolutie niet-invasief en zonder het vereiste van ioniserende straling 1,3,16. Maar MRI kampen met een lage gevoeligheid. Daarom fluorescentiebeeldvorming en MRI werden geselecteerd als moleculaire beeldvormingstechnieken vanwege hun complementariteit van penetratiediepte, gevoeligheid en ruimtelijke resolutie.
Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese en biofunctionalization van de PB NP, gadoliniumbevattende PB NP (GDPB), en mangaanbevattende PB NP (MnPB) 10,11. De volgende werkwijzen zijn: 1) van grootte, lading en temporele stabiliteit van de nanodeeltjes, 2) beoordeling van de cytotoxiciteit van de nanopartikels, 3) het meten van MRI relaxiviteiten, en 4) het gebruik van de nanodeeltjes fluorescentie en moleculaire MR beeldvorming van een populatie van doelcellen in vitro. Deze resultaten tonen het potentieel van de NP voor gebruik als multimodale moleculaire beeldvormende middelen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van PB NP, GDPB en MnPB
Synthese van de nanodeeltjes (PB NP, GDPB, of MnPB) wordt bereikt met behulp van een éénpotssynthese regeling door het uitvoeren van de stappen die hieronder beschreven:
- Bereid oplossing A met 5 ml van 5 mM kaliumhexacyanoferraat (II) in gedeïoniseerd (DI) water. Afhankelijk van het type nanodeeltjes gesynthetiseerd - PB NP, GDPB of MnPB bereiden oplossing 'B' als volgt:
- Voor PB NP: bereid 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM ijzer (III) chloride in DI water.
- Voor GDPB NP: bereiden 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM elk van gadolinium (III) nitraat en ijzer (III) chloride in DI water
- Voor MnPB NP: bereiden 10 ml van een oplossing bevattende 2,5 mM elk van mangaan (II) chloride en ijzer (III) chloride in DI water.
- Voeg oplossing 'B' een rondbodemkolf, en roer de inhoud van de kolf bij kamertemperatuur (RT) en1,000 rpm. Voeg oplossing A druppelsgewijs in de rondbodemkolf bevattende oplossing 'B'. Controleer de stroomsnelheid voor de toevoeging van oplossing "A" tot "B" door een peristaltische pomp op ongeveer 10 ml / uur afgeven.
- Blijf roeren bij 1000 opm bij kamertemperatuur gedurende nog 30 minuten na toevoeging van oplossing "A" tot "B" is voltooid. Stop met roeren en het verzamelen van het mengsel.
- Breng porties van het mengsel in microcentrifugebuizen de nanodeeltjes vrij van ongereageerde componenten spoelen. Voeg 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml reactiemengsel) aan elk aliquot te helpen deeltjes verzameling door centrifugatie.
- Centrifuge elk aliquot van nanodeeltjes gedurende ten minste 10 minuten bij 20.000 x g. Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig het supernatant.
- Resuspendeer elke nanodeeltjes pellet in 1 ml DI water via geluidsgolven met een microtip (sonicatie puls aan / uit = 1/1 sec, amplitude = 50%, duur =5 sec, sonicator vermogen = 125 W) te breken van de pellet.
- Herhaal stap 1,4-1,6 minstens 3 × zodat de nanodeeltjes vrij van componenten van de eerste reactie en reactiebijproducten. Na de laatste centrifugeren, opnieuw in suspensie deeltjes in 1 ml DI water.
2. Biofunctionalization van PB NP, GDPB en MnPB
Biofunctionalization van de nanodeeltjes omvat bekleding van het nanodeeltje "kernen" met avidine en het toevoegen van gebiotinyleerd liganden zoals hieronder beschreven:
- Coating van de Nanodeeltjes met TL Avidine
Coating van de nanodeeltjes met fluorescerende avidine wordt bereikt door elektrostatisch zelfassemblage waarbij positief geladen avidine (pI ~ 10.5) wordt bedekt op de volgende 18 negatief geladen nanodeeltjes:- Bereid schorsingen van de PB NP, GDPB, of MnPB in 1 ml DI water. Filter Alexa Fluor 488-gelabeld avidine (A488; gereconstitueerd in DI-water)door een 0,2 pm nylon filter microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 10 min. Voeg ≤0.2 mg avidine / mg nanodeeltjes. Voeg elke gefilterde hoeveelheid van A488 afzonderlijk aan de fracties van PB NP, GDPB of MnPB.
- Neem contact op met de nanodeeltjes met A488 voor 2-4 uur onder voorzichtig schudden of rotatie bij 4 ° C. Bescherm de monsters van licht met behulp van aluminiumfolie.
OPMERKING: Deze stap levert A488 gecoat PB NP (PB-A488), GDPB (GDPB-A488), en MnPB (MnPB-A488).
- Bevestiging van Gebiotinyleerde Antilichamen
Bevestiging van gebiotinyleerde antilichamen gericht op de met avidine gecoate nanodeeltjes wordt als volgt bereikt middels avidine-biotine interacties:- Bereid schorsingen van de avidine gecoate nanodeeltjes - PB-A488, GDPB-A488, en MnPB-A488 in 1 ml DI water. Filter gebiotinyleerd antilichaam (zoals geleverd door de fabrikant) door een 0,2 pm nylon filter microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 10 min.
OPMERKING: Hier, de huidige studie maakt gebruik van Biotinylated anti-neuron-glia antigen 2 (ANG2) dat gericht NG2 overexpressie gebracht in cellen en weefsels van het centrale zenuwstelsel en gebiotinyleerd anti-humaan eotaxine-3 (Eot3) die receptoren overexpressie van eosinofielen of eosinofiel cellijnen richt. - Voeg elk gefilterde hoeveelheid gebiotinyleerd antilichaam afzonderlijk de hoeveelheden van de met avidine gecoate nanodeeltjes. Voeg ≤0.05 mg gebiotinyleerd antilichaam / mg avidine-gecoate nanodeeltjes. Contact met avidine gecoate nanodeeltjes met gebiotinyleerde antilichamen (ANG2 of Eot3) gedurende 2-4 uur onder zacht schudden of roteren bij 4 ° C. Bescherm de monsters van licht met behulp van aluminiumfolie.
OPMERKING: Deze stap levert antilichaam gecoate nanodeeltjes (bijv GDPB-A488-Eot3 en MnPB-A488-ANG2).
- Bereid schorsingen van de avidine gecoate nanodeeltjes - PB-A488, GDPB-A488, en MnPB-A488 in 1 ml DI water. Filter gebiotinyleerd antilichaam (zoals geleverd door de fabrikant) door een 0,2 pm nylon filter microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 10 min.
3. Sizing, Zeta-Potentiaal, en temporele stabiliteit van de Nanodeeltjes
De grootteverdeling, lading en stabiliteit van de nanodeeltjes gemeten met dynamischelichtverstrooiing (DLS) methode zoals hieronder beschreven:
- Dimensionering van de Nanodeeltjes
Dimensionering van de nanodeeltjes wordt bereikt met behulp van dynamische lichtverstrooiing als volgt:- Voeg 10 ul van het nanodeeltje monster (1 mg / ml) en 990 gl DI water in een plastic wegwerp cuvet.
LET OP: Dit is representatieve waarde voor een goede DLS signaal. - Cap de cuvet en vortex goed te mengen. Plaats de cuvette in een systeem om deeltjesgrootte analyseren om de grootte van de nanodeeltjes te meten. Uit te voeren analyse van de deeltjesgrootte op een meting hoek van 173 °.
- Voeg 10 ul van het nanodeeltje monster (1 mg / ml) en 990 gl DI water in een plastic wegwerp cuvet.
- Zeta Potentieel van de Nanodeeltjes
Zeta potentiaal van de nanodeeltjes wordt als volgt gemeten met fase analyse lichtverstrooiing:- Voeg 100 ul van het nanodeeltje monster (1 mg / ml) aan 900 gl DI water in een wegwerp plastic capillaire cel. Deze waarde is representatief voor een goede zetapotentiaal meting.
- Plaats de capillairey cel in een systeem om zetapotentiaal analyseren om het zeta potentieel van de nanodeeltjes met standaardparameters bij 25 ° C gemeten.
- Temporele stabiliteit van de Nanodeeltjes
Temporele stabiliteit van de nanodeeltjes wordt gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing als volgt:- Beoordeel de stabiliteit van nanodeeltjes door meting van de grootte van de nanodeeltjes in DI water en Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) zoals in paragraaf 3.1 beschreven.
- Herhaal de grootte metingen in DI water en DMEM keer / dag gedurende 5 dagen.
4. De cytotoxiciteit van de Nanodeeltjes
De cytotoxiciteit van de nanodeeltjes wordt als volgt gemeten met een XTT celproliferatie assay:
- Seed 10.000-15.000 cellen / putje van elk celtype onderzocht (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 en OE21) in een 96-well plaat. Zorg ervoor dat de totale omvang van de gezaaide cellen niet eXceed 0,2 ml / putje. Incubeer gezaaide cellen overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
- Contact opnemen met nanodeeltjes met de cellen:
- Incubeer de cellen met variërende concentraties van nanodeeltjes (0,01-0,5 mg / ml). Zie tabel 1, als vertegenwoordiger tabel die de hoeveelheden van de nanodeeltjes beschreven (in 50 ui) toegevoegd aan de cellen na verwijdering van 50 gl medium / putje.
- Om eventuele storende absorptie van de nanodeeltjes in de assay, voeg een blanco, de juiste concentratie van nanodeeltjes (0-0,5 mg / ml, in overeenstemmen met de toegevoegde hoeveelheden aan de cellen) tot medium zonder cellen.
- Incubeer de cellen met nanodeeltjes nacht bij 37 ° C en 5% CO2. Zuig medium uit elk putje en afspoelen met vlekken buffer bestaande uit 5% foetaal runderserum (FBS) in met fosfaat gebufferde oplossing (PBS). Voeg 100 ul van medium zonder fenol rood en incubeer bij 37 ° C en 5% CO216-18 uur.
- Incubeer de cellen met variërende concentraties van nanodeeltjes (0,01-0,5 mg / ml). Zie tabel 1, als vertegenwoordiger tabel die de hoeveelheden van de nanodeeltjes beschreven (in 50 ui) toegevoegd aan de cellen na verwijdering van 50 gl medium / putje.
- Bereid de XTT Cell Proliferation Assay werkoplossing door mengen van de kit componenten (XTT reagens en XTT Activator) volgens de specificaties van de fabrikant. Zuig het medium van de putten en voeg 100 ul RPMI (RPMI w / o fenol rood + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) of een geschikt medium voor het celtype bestudeerd. Voeg 50 pl XTT werkoplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2-2.5 uur.
- Meet de absorptie bij 490 nm, met een verwijzing golflengte van 630 nm te corrigeren voor vingerafdrukken of vlekken. Bereken de gecorrigeerde absorptie van elk putje (A -A 490 630) en het gemiddelde van de metingen van duplo's.
- Trek de blanco lezingen uit elk putje waarde voor de uiteindelijke gecorrigeerde absorptiewaarden berekenen. Bereken het percentage overleving voor elk monster door het normaliseren van de uiteindelijke gecorrigeerde absorptie met die van onbehandelde cellen zonder nanodeeltjes. Perceel survival percentage als functie van nanodeeltjes concentratie.
5. MRI relaxiviteiten van de PB NP, GDPB en MnPB
MRI relaxiviteit wordt gemeten met T1 - en T2-gewogen sequenties door bereiden van een MRI "fantoom" met een 96-wells plaat met nanodeeltjes zoals hieronder beschreven:
- Phantom Voorbereiding
- Bereid een 96-wells plaat met elk putje 100 gl nanodeeltjes (PB NP, GDPB of MnPB) met de juiste concentratie. Beginnend met een concentratie van 0,4 mM voor elk type nanodeeltje, serieel verdunnen nanodeeltjes 2 × met DI-water tot een concentratie van 2,4 x 10 -5 M is bereikt (dit vereist 14 verdunningen en 15 wells).
- Voeg 100 ul van gesmolten 1% agarose-oplossing in DI water in elk putje en meng. Laat de gel stollen bij 4 ° C gedurende 12 uur.
LET OP: Dit levert een fantoom met seriële verdunningen vande nanodeeltjes in gestolde agarose. - Plaats de fantoom in een horizontale 3 T klinische magneet onder een massief blok van 2% agar (150 cm3). Zet het fantoom en blokkeren van agar in het centrum van een 8-kanaals HD hersenen spoel. Meet ontspanning keer met behulp van 0,5 mm dikke coronale plakjes op het midden van de hoogte van de 96-well plaat 11.
- T1 - en T2-gewogen sequenties
Gebruik de volgende representatieve instellingen voor het verkrijgen van sequenties in de klinische magneet.
Opmerking: Deze waarden worden geoptimaliseerd voor de nanodeeltjes die in deze studie:- Verwerven T 1 -gewogen (T1W) MR-beelden met behulp van de volgende vloeistof verzwakte inversie recovery (FLAIR) volgorde: Echo trein (ET) = 8, Herhaling tijd (TR) = 2.300 msec, Echo tijd (TE) = 24,4 msec, Matrixgrootte = 512 x 224, Field of view (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Verwerven T2-gewogen (T2W) MR-beelden met behulp van de volgende snelle relaxatie snel spinecho (FRFSE) volgorde: ET = 21; TR = 3500 msec; TE = 104 msec; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
- Verwerven T1W en T2W MR-beelden op 127 MHz (3 T) op de volgende omkering tijden: 50, 177, 432, 942, 1961, en 4000 msec.
- Het meten van de MRI relaxiviteiten
- Na het verwerven van T1W en T2W beelden met behulp van de in paragraaf 5.2 beschreven sequenties, het meten van de intensiteit van het signaal voor elk putje met behulp van ImageJ, voortaan aangewezen als de regio van belang (ROI) door het selecteren van elke ROI met behulp van de ovale gewas knop op de werkbalk, dan selecteren Analyseren> Meet.
OPMERKING: Er verschijnt een pop-up moet de gemiddelde intensiteit van het signaal van elke ROI weer onder de kolom "Mean". - Voor elke ROI, plot de gemeten intensiteit van het signaal tegen haar specifieke inversietijd. Indien nodig, invertsuiker punten (waarden) dat een eerste "bubble" of uitschieters aan het begin van de grafiek te genereren (lager inversiemaal).
Opmerking: Deze metingen ontstaan aan lage inversie keren omdat MRI meet de grootte of absolute waarde van beelden dan de feitelijke (negatieve) waarde, die moet worden opgenomen / gecorrigeerd 19. - Bereid een exponentiële fit voor elk perceel van de intensiteit van het signaal voor de ROI (SI) vs. inversie keer (T I), zoals beschreven in paragraaf 5.2. Plot T I op de x-as, SI op de y-as; ɑ en Δ constanten bepaald door regressie en T1 of T2 de variabele op te lossen:
waarin t = T1, T2. - Isoleer T1 of T2 met de bovenstaande vergelijking en plot de inverse van de berekende waarden (1 / T 1 en 1 / T2) tegen de concentratie van de nanodeeltjes in elk ROI.
- Bereken de helling van de lineaire grafiek dielevert de relaxiviteiten r 1 en r 2.
OPMERKING: De volgende sectie van het protocol beschrijft de toepassing van de nanodeeltjes voor tl-etikettering en het genereren van MRI contrast in gerichte cellen.
- Na het verwerven van T1W en T2W beelden met behulp van de in paragraaf 5.2 beschreven sequenties, het meten van de intensiteit van het signaal voor elk putje met behulp van ImageJ, voortaan aangewezen als de regio van belang (ROI) door het selecteren van elke ROI met behulp van de ovale gewas knop op de werkbalk, dan selecteren Analyseren> Meet.
6. Fluorescerende Labeling van Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes - confocale microscopie
OPMERKING: De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om fluorescent label een populatie van doelcellen (gevolgd door confocale microscopie) als volgt:
- Synthese van de TL-Nanodeeltjes
- Synthetiseren GDPB-A488, GDPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 voor tl-etikettering van een populatie van gerichte cellen door de stappen beschreven in de punten 1 en 2.
- Bereiding van Cellen voor fluorescentie Targeting
- Jas niet. 1.5 micro dekglaasjes door ze onder te dompelen in een oplossing van 0,002% poly (L-lysine) hydrobromide gedurende 90 min. Verwijder het deksel glazen uit de oplossing en laat ze drogen gedurende 24 uur.
- Zaden van de cellen (bijv EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) op de beklede dekglaasjes geplaatst in een 6-well plaat en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 16 uur. Spoel de cellen met een 1 × PBS-oplossing en (optioneel) te repareren met 10% formaldehyde in neutrale bufferoplossing gedurende 15 min. Stain cellen met 5 uM rood-oranje cel permeant kleurstof in PBS bij 37 ° C gedurende 30 min. Vervolgens spoel cellen met PBS.
- > Fluorescerende Labeling van Gerichte Cellen
- Voeg 1% bovine serum albumine (BSA, in DI water) om de cellen om niet-specifieke binding te minimaliseren op de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Incubeer cellen met de nanodeeltjes in 1% BSA gedurende 1 uur. Voor EoL-1: incubeer met 0,2 mg / ml GDPB-A488 of GDPB-A488-Eot3; Voor BSG D10 en SUDIPG1: incubeer met 0,2 mg / ml MnPB-A488 of MnPB-A488-ANG2. Spoel de cellen met PBS 3 × tot unbou verwijderennd nanodeeltjes.
- Omkeren zorgvuldig de dekking van glas (met cellen en nanodeeltjes) op een microscoop dia, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen. Verzegelen de rand tussen het deksel glas en microscoopplaatje door het zorgvuldig aanbrengen van duidelijke nagellak. Afbeelding de cellen met een confocale laser scanning microscoop.
7. Fluorescerende Labeling van Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes - flowcytometrie
De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om fluorescent label een populatie van doelcellen (gecontroleerd door flowcytometrie) als volgt:
- Suspensies bereid van de cellen het doelwit in PBS. Voor zuivere cultuur studies, de schorsingen bestaan uit een enkele cel type (bijv BSG D10); resuspendeer een celpellet van BSG D10 cellen in PBS bij 100.000 cellen / ml (10 ml totaal). Voor mengcultuur studies, de suspensies uit ten minste twee celtypen (bijv EoL-1 en OE21); Soortgelijke BSG D10, resuspendeer celpellets van EoL-1 en OE21 in PBS bij 100.000 cellen / ml elk (totaal 10 ml).
- Bereid variërende verhoudingen van EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml elk van EoL-1 en OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Blokkeer de cellen (zuivere en gemengde suspensies) het doelwit van de nanodeeltjes met 2 ml 5% BSA om niet-specifieke binding te minimaliseren.
- Voeg 1 ml (1 mg / ml) nanodeeltjes aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur. Voor BSG D10, incubeer cellen met MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (controle antilichaam), of MnPB-A488-ANG2). Voor mengsels van EoL-1 en OE21, incubeer de mengsels met een vast bedrag van GDPB-A488-Eot3.
- Spoel de cellen vrij van ongebonden nanodeeltjes door te stoppen met draaien de monsters bij 1000 x g gedurende 5 min minstens 3 × om ongebonden deeltjes te verwijderen. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS en bevestig met 10% formaldehyde in PBS. Stain cellen door incubatie met 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS op ijs gedurende 30 min. Spoelen met PBS, vervolgens analyseren 10.000 gated cellen van elk monster met behulp van een flowcytometer.
8. Het genereren van MRI contrast op Gerichte cellen met behulp van de Nanodeeltjes
: Als volgt in een populatie van doelcellen - De nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) kan worden gebruikt om MRI contrast (en T2-gewogen sequenties in zowel T1) genereren
- Phantom Voorbereiding
- Kweek cellen (bijv BSG D10) in T75 kolven tot -80% confluentie. Gebruik geschikte groeimedium en voorwaarden. Voor BSG D10, groeien de cellen in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep bij 37 ° C en 5% CO2.
- Spoel cellen vrij medium met 5 ml PBS en blokkeren de cellen met 5 ml 1% BSA in PBS gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te minimaliseren. Voeg 5 ml (0,5 mg / ml) nanodeeltjes aan de cellen. Voor BSG D10, incubeer de cellen met MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (controle antilichaam), en MNPB-A488-ANG2 1 uur.
- Spoel cellen 3 x met 5 ml PBS om ongebonden nanodeeltjes te verwijderen. Trypsinize de cellen door de cellen te incuberen met 2 ml trypsine EDTA 0,25% oplossing 1 x gedurende 5 min bij 37 ° C en 5% CO2 om ze los te maken van de kolf voor fantoom bereiding. Voeg 8 ml DMEM de trypsine cellen doven.
- Verzamel de cellen door te centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 min; Zuig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS en voeg 1 ml 10% formaldehyde in PBS aan de cellen vast. Voeg 100 ul van elk monster op een afzonderlijk putje van een 96-wells plaat.
- Voeg 100 ul van gesmolten 1% agarose-oplossing in DI water in elk putje en meng goed door en neer te pipetteren. Laat de gel stollen bij 4 ° C gedurende 12 uur.
LET OP: Dit levert een fantoom bevattende cellen met aangehechte nanodeeltjes in gestolde agarose. - Plaats de fantoom in een horizontale 3 T klinische magneet naast een massief blok van 2% agar (150 cm
- T1 - en T2-gewogen sequenties
Gebruik de volgende instellingen voor het verwerven van de sequenties in de klinische MRI-magneet:- Verwerven T1W MR-beelden met behulp van de volgende spin-echo sequentie: Echo trein (ET) = 1, Herhaling tijd (TR) = 650 msec, Echo tijd (TE) = 11 msec, Matrix size = 320 x 256, Field of view (FOV) = 10 x 10 cm2.
- Verwerven T2W MR-beelden met behulp van de volgende FRFSE volgorde: ET = 28; TR = 3000 msec; TE = 101 msec; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Na overname Processing
- Voor de overzichtelijkheid, zetten de oorspronkelijke grijstinten kleuren schaal beeld met behulp van ImageJ naar: Kies Afbeelding> type> 8-Bit, om de afbeelding te converteren naar grijstinten.
- Bereken de genormaliseerde intensiteit voor elk monster na aftrek van de bijdrage signaal van de agaroseoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de éénpotssynthese regeling, nanodeeltjes van PB NP (gemiddelde diameter van 78,8 nm, polydispersiteitsindex (PDI) = 0,230; berekend door het dynamische lichtverstrooiing instrument), GDPB (gemiddelde diameter van 164,2 nm, PDI = 0,102), of MnPB ( gemiddelde diameter 122.4 nm, PDI = 0,124) dat monodisperse (zoals gemeten door DLS zijn) kan consistent worden gesynthetiseerd (Figuur 2A). De gemeten zeta potentialen van de gesynthetiseerde nanodeeltjes minder dan -30 mV (Figuur 2B) dat aangeeft matige stabiliteit van de deeltjes op basis van hun oppervlakteladingen. De gesynthetiseerde nanodeeltjes vertonen voldoende temporele stabiliteit gedurende een periode van 5 dagen zoals aangegeven door de consequente grootte (hydrodynamische diameter Figuur 2C).
Wanneer gelijktijdig geïncubeerd met cellen, de nanodeeltjes (PB NP, GDPB en MnPB) vertonen verwaarloosbare cytotoxiciteit voor de cellen onder bepaalde drempel concentratie (Figuur 3). Cytotoxiciteit stumatrijzen van PB NP op Neuro2a cellen geven verwaarloosbare cytotoxiciteit wanneer gecoïncubeerd met Neuro2a bij concentraties lager dan 0,67 × 10 -6 mg / cel (Figuur 3A). Cytotoxiciteit studies uitgevoerd door co-incubatie van GDPB met EoL-1 en OE21 cellen geven verwaarloosbare cytotoxiciteit van GDPB op beide celtypen bij concentraties lager dan 0,25 × 10 -6 mg / cel (Figuur 3B). Vergelijkbare, cytotoxiciteit studies geven een verwaarloosbare cytotoxiciteit van MnPB wanneer gecoïncubeerd met BSG D10 bij concentraties lager dan 0,25 × 10 -6 mg / cel (Figuur 3C). De aanvullende cytotoxiciteit van MnPB en GDPB kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van extra ionen (Mn 2+ voor MnPB en Gd 3+ voor GDPB) binnen het nanodeeltje kern.
MRI relaxatie werden uitgevoerd met fantomen uit verschillende concentraties PB NP, GDPB en MnPB. De studies geven de bruikbaarheid van de nanopartjes als MRI-contrastmiddelen in zowel T1W en T2W sequenties (figuur 4). Dit wordt aangetoond door de verhoogde hyperintensiteiten (positief contrast) in T1-gewogen sequenties en verhoogde hypointensities (negatief contrast) in T2-gewogen sequenties met toenemende concentraties van zowel GDPB (figuur 4A) en MnPB (figuur 4B). Gebaseerd op de relaxatie metingen MnPB is een matige T1 middel en een sterke T 2 agens terwijl GDPB een sterke T1 middel en een gematigd T2 middel (figuur 4C). De gemeten relaxiviteiten van GDPB en MnPB gunstig af bij die van klinisch goedgekeurd contrastmiddelen 10, 11.
De biofunctionalized PB NP kunnen fluorescent label een populatie van doelcellen in vitro (figuur 5). Wanneer biofunctionalized met fluorescentie- avidine (A488) en gebiotinyleerd anti-humaan eotaxin-3 antilichaam (Eot3), kan GDPB fluorescent richten op een bevolking van EoL-1-cellen (Figuur 5B). Controle GDPB nanodeeltjes zonder Eot3 vertonen verwaarloosbare binding (figuur 5A) Ook wanneer GDPB wordt biofunctionalized met zowel fluorescerende avidine (A488) en gebiotinyleerd anti-neuronale gliale antigen-2 (ANG2), de nanodeeltjes kunnen fluorescent doelgroepen van BSG D10 en SUDIPG1 neurosferen (Figuren 5D en F), terwijl controle nanodeeltjes zonder het richtende antilichaam niet fluorescent labelen van de cellen (Figuren 5C en E). Adequate targeting en fluorescentielabelling vereisen de aanwezigheid van fluorescentie- avidine en gebiotinyleerd targeting ligand.
Het vermogen van de biofunctionalized nanodeeltjes om fluorescent label een populatie van cellen, zoals gekwantificeerd door flowcytometrie, bevestigt de noodzaak voor zowel fluorescerend avidine en biotineylated targeting ligand doeltreffende fluorescentielabelling (figuur 6). BSG D10 cellen in contact gebracht met MnPB die zowel A488 en ANG2 (MnPB-A488-ANG2) vertonen verhoogde fluorescentie (figuur 6A) en het percentage van fluorescent gelabelde cellen (Figuur 6B) in vergelijking met fluorescente nanodeeltjes met een controle antilichaam controle (MnPB-A488 -abc) en zonder een antilichaam (MnPB-A488). De biofunctionalized nanodeeltjes kunnen fluorescent richten op een specifieke sub-populatie van cellen in een cel mengsel (figuur 6C). Dit blijkt vastgesteld hoeveelheden EoL-1-targeting, fluorescent GDPB (GDPB-A488-Eot3) in contact met doelcellen (EoL-1) en controlecellen (OE21). Fluorescentie verhoogd als verhoudingen EoL-1 verhoogd (toename Alexa Fluor 488 signaalintensiteit Figuur 6C) in het mengsel. Dit geeft aan de specificiteit van de nanodeeltjes voor deze sub-populatie van cellen in het cell mengsel.
De biofunctionalized PB NP verhogen MRI contrast in een populatie van gerichte cellen (Figuur 7). Bij BSG D10 cellen in contact met equivalente concentraties experimentele (MnPB-A488-ANG2) en controle (MnPB-A488-ABC en MnPB-A488) nanodeeltjes, fantomen vertonen verhoogde hyperintensiteit op cellen in contact gebracht met MnPB-A488-ANG2 vergelijking met controles bij T1W sequenties en verhoogde hypointensity op cellen in contact gebracht met MnPB-A488-ANG2 vergelijking met controles bij T2W sequenties (figuur 7A). Beeldanalyse van de ROI binnen het fantoom Deze tendens waar de cellen in contact gebracht met experimentele deeltjes vertonen significant toegenomen intensiteit in vergelijking met controles T1W sequenties en significant verminderde intensiteit ten opzichte van controles T2W sequenties (figuur 7B).
Figuur 1: De kern-schil design van de PB NP. De kern bestaat uit een PB rooster, dat bestaat uit lineaire cyanide liganden in een Fe II - CN -. Fe III linkage Deze verbindingen stellen PB NP kationen integreren in het driedimensionale netwerk als middel balanceringsheffingen 5. Dit kation-bindend vermogen van Pruisisch blauw wordt gebruikt om gadolinium en mangaan ionen te laden binnen het rooster, die MRI contrast biedt. De kern wordt gecoat met een biofunctionele shell uit fluorescerende avidine fluorescentie beeldvorming en gebiotinyleerde liganden kunnen moleculaire targeting mogelijk.
Figuur 2:. Maat, lading, en de stabiliteit van de PB NP (A) Grootte distributies van PB (blauw), GDPB (rood) en MnPB (zwart) nanodeeltjes gemeten door DLS. (B (C) Temporele stabiliteit van PB (blauw), GDPB (rood) en MnPB (zwart) nanodeeltjes in water (vast) en DMEM (gestippeld) vijf dagen na de synthese gemeten door DLS.
Figuur 3:. De cytotoxiciteit van de PB NPs cytotoxiciteit studies met verschillende concentraties (A) PB NP een vast aantal Neuro2a cellen (B) GDPB een vaste hoeveelheid EoL-1 en toegevoegde toegevoegd OE-21 cellen, respectievelijk ( C) MnPB aan een vast aantal BSG D10 cellen. De celoverleving werd berekend op 24 en 48 uur. Overgenomen met toestemming van Ref 11, auteursrecht 2014 American Chemical Society; Ref 10 met toestemming van Dove Press Ltd; en Ref 21 met toestemming van de Royal Society of Chemistry.
Figuur 4: MR beelden en relaxiviteiten van GDPB en MnPB 3 T. hyperintensiteit in T1-gewogen sequenties en hypointensity in T2-gewogen sequenties van (A) GDPB en (B) MnPB als functie van de concentratie van de nanodeeltjes. (C) Tabulatie van de relaxitivies van PB NP, GDPB en MnPB gemeten op 3 T. Overgenomen met toestemming van Ref 11, auteursrecht 2014 American Chemical Society.
Figuur 5: Fluorescent labeling van doelcellen met de biofunctionalized PB NP, zoals gemeten met laser scanning confocale microscopie afbeeldingen van EoL-1 cellen behandeld met (A) controle (GDPB-A488) en (B) experimenteel (GDPB-A488-Eot3. ) nanodeeltjes.Afbeeldingen van BSG neurosferen behandeld met (C) controle (MnPB-A488) en (D) experimentele (MnPB-A488-ANG2) nanodeeltjes. Afbeeldingen van SUDIPG1 neurosferen behandeld met (E) controle (MnPB-A488) en (F) experimentele (MnPB-A488-ANG2) nanodeeltjes. Overgenomen met toestemming van Ref 11, auteursrecht 2014 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Fluorescent labeling van doelcellen met de biofunctionalized PB NP, zoals gemeten door flow cytometrie (A) Flow cytometrie histogrammen van BSG D10 cellen behandeld met experimentele (MnPB-A488-ANG2) en controle (MnPB-A488-ABC en MnPB. -A488) nanodeeltjes. (B) Percentage van BSG D10 cellen van paneel (A), die fluorescerend zijn (% van de Alexa-Fluor positief) na behandeling met experimentele (MnPB-A488-ANG2) en controle (MnPB-A488-ABC en MnPB-A488) nanodeeltjes, ** p <0.05. (C) Flowcytometrie puntgrafieken van een cel mengsel met wisselende hoeveelheden EoL-1 (gerichte cellen) en OE21 (controle cellen) het doelwit van de nanodeeltjes (GDPB-A488-Eot3). Overgenomen met toestemming van Ref 11, auteursrecht 2014 American Chemical Society en naar Ref 10 met toestemming van Dove Press Ltd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7:. Toenemende MRI contrast in doelcellen met de biofunctionalized PB NP (A) T1-gewogen en T <sub> 2-gewogen contrast enhancement in fantomen uit een vast aantal BSG D10 cellen behandeld met experimentele (MnPB-A488-ANG2) en controle (MnPB-A488-ABC en MnPB-A488) nanodeeltjes. (B) De genormaliseerde intensiteit van het signaal voor BSG D10 cellen behandeld met experimentele (MnPB-A488-ANG2) en controle (MnPB-A488-ABC en MnPB-A488) nanodeeltjes, ** p <0,05. Overgenomen uit Ref 10 met toestemming van Dove Press Ltd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel geeft de werkwijzen voor de synthese van een nieuwe klasse van multimodale moleculaire beeldvormende stoffen gebaseerd op biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes. De moleculaire beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI vanwege hun complementariteit. De biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes een kern-schil design. De belangrijkste stappen in de synthese van deze nanodeeltjes zijn: 1) éénpotssynthese waarin de kernen die bestaan uit Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP), gadoliniumbevattende Pruisisch blauw nanodeeltjes (GDPB) of mangaanbevattende Pruisisch blauw oplevert nanodeeltjes (MnPB), 2) biofunctionalization van de nanodeeltjes met fluorescerende avidine elektrostatische zelfassemblage, en 3) binding van de gebiotinyleerde liganden (antilichamen) aan de nanodeeltjes met robuuste avidine-biotine interacties. Fluorescentie- avidine en de gebiotinyleerde liganden vormen de BIOFunctional shell van de nanodeeltjes.
De éénpotssynthese levert PB NP, GDPB, of MnPB dat zowel functioneren als T 1 en T 2 contrastmiddelen voor MRI. De bedragen van de paramagnetische ionen (gadolinium of mangaan) in het nanodeeltje kern geladen kan worden gewijzigd (verhoogd of verlaagd) door het variëren van de bedragen van de paramagnetische-ion bevatten zouten (gadolinium (III) nitraat en mangaan (II) chloride) in de éénpotssynthese (stap 1.2). Dit resulteert in veranderde (verhoogd of verlaagd) MRI signaal intensiteiten. Echter, kunnen deze aanpassingen aan de synthese regeling leiden tot onstabiele, geaggregeerde nanodeeltjes. Om aan de bezwaren in verband met de samenvoeging te beperken, kan de éénpotssynthese worden aangepast aan de grootte-controlerende nemen kapmiddelen zoals citraat tijdens de synthese 20.
Biofunctionalization van de nanodeeltjes kernen wordt bereikt door elektrostatische zelf-assemblage met fluorescerende avidine, die inschakles fluorescentie beeldvorming. Elektrostatische zelfassemblage vereist tegengestelde ladingen op het oppervlak van de nanodeeltjes en de coating polymeer (in dit artikel, fluorescente avidine). Om het oppervlak functionaliteit van de nanodeeltjes wijzigen kan avidine worden vervangen door positief geladen polymeren (bijvoorbeeld polylysine of een amine-bevattende polyethyleenglycol) tijdens de synthese. Echter de relatieve hoeveelheden van de nanodeeltjes en bekleding polymeer zal moeten worden geoptimaliseerd om nanodeeltjes grootte en stabiliteit en om aggregatie te voorkomen.
Toevoeging van de gebiotinyleerde antilichamen op de avidine gecoate nanodeeltjes verleent moleculaire gebied en de PB-gebaseerde nanopartikels. Deze stap is gebaseerd op de sterke interactie tussen avidine en biotine (evenwicht dissociatieconstante, Kd ~ 10 -15). Zoals bij vorige stappen, de relatieve verhoudingen van de met avidine gecoate nanodeeltjes en gebiotinyleerde liganden moeten op zijnseerd om te voorkomen dat de gebiotinyleerde ligand uit gelijktijdig binden twee avidine gecoate nanodeeltjes gevolg nanodeeltjes aggregatie. Voor moleculaire targeting, kunnen de antilichamen worden vervangen door andere targeting liganden zoals antilichaamfragmenten (Fab), enkele keten variabel fragment (scFv), peptiden, of aptameren.
De belangrijkste voordelen van deze werkwijze voor het synthetiseren biofunctionalized nanodeeltjes multimodale moleculaire beeldvormende middelen zijn: 1) facile one-pot (1-staps) synthese van de nanodeeltjes kernen, en 2) opeenvolgende contact- stappen (elektrostatische zelfassemblage en avidine biotine interacties) voor het bekleden van het nanodeeltje kern met een biofunctionele shell. Andere voordelen van de nanodeeltjes omvatten dat Pruisisch blauw (verkocht Radiogardase) al FDA goedgekeurd voor menselijk gebruik en dat de nanodeeltjes die voortvloeit uit de éénpotssynthese regeling kan worden toegepast als een MRI-contrastmiddel zowel T1 ( positief) en T 2 </ Sub> (negatieve) -gewogen sequenties, die niet gemakkelijk wordt bereikt met behulp van andere contrastmiddelen of nanodeeltjes platforms zonder ingewikkelde synthese regelingen of gespecialiseerde chemische producten voor de synthese van de contrastmiddelen. Een beperking van de techniek is dat de synthese kan leiden tot polydisperse nanodeeltjes met aggregaten indien de relatieve verhoudingen van de reactanten in beide stappen nanodeeltjes kern synthese biofunctionele shell coating niet strikt geoptimaliseerd voor de reagentia gebruikt in deze bijzondere stappen. Bijvoorbeeld kan de relatieve verhoudingen van bekleden van de nanodeeltjes kernen met avidine niet worden uitgebreid tot het bekleden van de nanodeeltjes met polylysine zonder voorafgaande optimalisatieonderzoeken.
Na het beheersen van de techniek voor het synthetiseren biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes hier beschreven, kan dit veelzijdige ontwerp worden aangepast voor moleculaire beeldvorming studies in vivo. Dit zal PEGylering van de nanodeeltjes nodig heeft voor een lagere immunogenicity en langere circulatietijden in vivo. Vergelijkbaar met de hier beschreven ontwerp kan de PB NPs worden biofunctionalized met antilichamen voor in vivo toediening. Andere studies omvatten het gebruik van de biofunctionalized PB NP voor theranostische (gelijktijdige therapie + diagnostische) toepassingen in vivo. Studies die het gebruik van Pruisisch blauw nanodeeltjes voor fotothermisch therapie (op basis van hun absorptie eigenschappen bij in de buurt van infrarode golflengten) zijn momenteel aan de gang 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A.
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J.
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
