Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
Multimodale, moleculaire beeldvorming kan de visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau resoluties met behulp van meerdere, complementaire beeldvormende technieken. Deze beeldvormende middelen vergemakkelijken het real-time evaluatie van trajecten en mechanismen in vivo, waarbij zowel diagnostische en therapeutische werking versterken. Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) – een nieuwe klasse van middelen voor gebruik in multimodale, moleculaire beeldvorming toepassingen. De beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes, fluorescentie beeldvorming en magnetische resonantie imaging (MRI), complementaire functies. De PB NP's beschikken over een kern-schil design waarbij gadolinium en mangaan ionen opgenomen in de interstitiële ruimten van de PB rooster genereren MRI contrast, zowel in T1 en T2-gewogen sequenties. De PB NP zijn gecoat met fluorescerende avidine middels elektrostatische zichzelf alstage, die fluorescentie beeldvorming mogelijk maakt. Het avidine gecoate nanodeeltjes gemodificeerd met gebiotinyleerde liganden die moleculaire gebied en de nanodeeltjes verlenen. De stabiliteit en de toxiciteit van de nanodeeltjes gemeten, evenals hun MRI relaxiviteiten. De multimodale, moleculaire beeldvorming mogelijkheden van deze biofunctionalized PB NP's worden vervolgens aangetoond door ze te gebruiken voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI in vitro.
Introduction
Moleculaire beeldvorming is de niet-invasieve en gerichte visualisatie van biologische processen op cellulair, subcellulaire en moleculaire niveau 1. Moleculaire beeldvorming maakt een model in zijn inheemse micro blijven terwijl de endogene wegen en mechanismen worden beoordeeld in real-time. Typisch moleculaire beeldvorming omvat de toediening van een exogene beeldvormingsmiddel in de vorm van een klein molecuul, macromolecuul, of nanodeeltjes te visualiseren, doel en sporenelementen relevante fysiologische processen bestudeerd 2. De verschillende beeldvormende modaliteiten die zijn onderzocht in de moleculaire beeldvorming onder MRI, CT, PET, SPECT, echografie Fotoakoestiek, Raman spectroscopie, bioluminescentie, fluorescentie, en opklaren 3. Multimodale beeldvorming is de combinatie van twee of meer beeldvormende modaliteiten waarbij de combinatie vergroot het vermogen te visualiseren en karakteriseren verschillende biologische processen en gebeurtenissen 4. Multimodal beeldvorming maakt gebruik van de sterke punten van de individuele beeldvormende technieken, terwijl compenseren hun individuele beperkingen 3.
Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese van biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes (PB NP) – een nieuwe klasse van multimodale, moleculaire beeldvorming agenten. De PB NP worden gebruikt voor fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI. PB is een pigment dat bestaat uit afwisselende ijzer (II) en ijzer (III) atomen in een face-centered cubic netwerk (figuur 1). De PB rooster bestaat uit lineaire cyanide liganden in een Fe II – CN – Fe III verbinding die kationen bevat om belastingen in het driedimensionale netwerk 5 evenwicht. Het vermogen van PB om kationen te integreren in haar rooster wordt uitgebuit door afzonderlijk laden gadolinium en mangaan ionen in de PB NP voor MRI contrast.
De reden voor het nastreven van een nanodeeltje ontwerp voor MRI contrast is vanwegede voordelen van dit ontwerp biedt ten opzichte van de huidige MRI-contrastmiddelen. De overgrote meerderheid van de Amerikaanse FDA goedgekeurde MRI contrastmiddelen gadolinium chelaten die paramagnetisch van aard en geven positieve contrast door de spin-rooster relaxatie mechanisme 6,7,8. In vergelijking met een gadolinium-chelaat dat lage signaalintensiteit verschaft op zichzelf biedt de inbouw van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB van de nanodeeltjes verhoogde signaalintensiteit (positief contrast) 3,9. Verder is de aanwezigheid van meerdere gadolinium-ionen in het rooster PB verhoogt de algehele spindichtheid en de omvang van paramagnetisme van de nanodeeltjes, die het lokale magnetische veld in de nabijheid ervan verstoort, en zo werden negatief contrast door de spin-spin relaxatietijd mechanisme. Dus de gadoliniumbevattende nanodeeltjes functioneren zowel als T 1 (positief) en T 2 (negatief) contrastmiddelen 10,11.
In een subgroep van patiënten met een verminderde nierfunctie, is de toediening van gadolinium gebaseerde contrastmiddelen in verband gebracht met de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose 8,12, 13. Deze observatie heeft een onderzoek gevraagd naar het gebruik van alternatieve paramagnetische ionen als contrastmiddelen voor MRI. Daarom wordt de veelzijdige ontwerp van de nanodeeltjes aangepast aan mangaanionen integreren in de PB rooster. Vergelijkbaar met gadoliniumchelaten, mangaan-chelaten ook paramagnetisch en worden typisch gebruikt om positieve signaalintensiteit verstrekken MRI 7,14. Zoals gadoliniumbevattende PB NP, de op mangaan bevattende PB NP tevens fungeren als T1 (positief) en T2 (negatief) contrastmiddelen.
Om fluorescentie beeldvorming capaciteiten omvatten, worden de nanodeeltjes "kernen" bekleed met een "biofunctionele" schil bestaande uit de fluorescentie-gemerkt glycoproteïne avidine (Figuur 1). Avidine niet alleen mogelijk fluorescentie beeldvorming, maar dient ook als een docking platform gebiotinyleerde liganden die specifieke cellen en weefsels richten. Het avidine-biotine binding is een van de sterkste bekende niet-covalente bindingen gekenmerkt door zeer sterke bindingsaffiniteit tussen avidine en biotine 15. De binding van gebiotinyleerde liganden aan de met avidine beklede PB NPs verleent moleculaire gebied en de PB NPs.
De motivatie voor het nastreven van fluorescentie en MR beeldvorming met behulp PB NP is omdat deze beeldvormende modaliteiten beschikken over complementaire functies. Fluorescentie beeldvorming is een van de meest gebruikte optische moleculaire beeldvorming, en voorziet in de gelijktijdige weergave van meerdere objecten hoge gevoeligheden 1,16,17. Fluorescentie beeldvorming is een veilige, niet-invasieve modaliteit, maar gaat gepaard met lage diepte van penetratie en ruimtelijke resoluties 1,3,16. Anderzijds, MRI genereert hoge temporele eend ruimtelijke resolutie niet-invasief en zonder het vereiste van ioniserende straling 1,3,16. Maar MRI kampen met een lage gevoeligheid. Daarom fluorescentiebeeldvorming en MRI werden geselecteerd als moleculaire beeldvormingstechnieken vanwege hun complementariteit van penetratiediepte, gevoeligheid en ruimtelijke resolutie.
Dit artikel presenteert het protocol voor de synthese en biofunctionalization van de PB NP, gadoliniumbevattende PB NP (GDPB), en mangaanbevattende PB NP (MnPB) 10,11. De volgende werkwijzen zijn: 1) van grootte, lading en temporele stabiliteit van de nanodeeltjes, 2) beoordeling van de cytotoxiciteit van de nanopartikels, 3) het meten van MRI relaxiviteiten, en 4) het gebruik van de nanodeeltjes fluorescentie en moleculaire MR beeldvorming van een populatie van doelcellen in vitro. Deze resultaten tonen het potentieel van de NP voor gebruik als multimodale moleculaire beeldvormende middelen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel geeft de werkwijzen voor de synthese van een nieuwe klasse van multimodale moleculaire beeldvormende stoffen gebaseerd op biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes. De moleculaire beeldvormende modaliteiten opgenomen in de nanodeeltjes fluorescentie beeldvorming en moleculaire MRI vanwege hun complementariteit. De biofunctionalized Pruisisch blauw nanodeeltjes een kern-schil design. De belangrijkste stappen in de synthese van deze nanodeeltjes zijn: 1) éénpotssynthese waarin de kernen die bestaan ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- . . Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do’s and don’t’s. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. . Duke Review of MRI Principles. 304, 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
