छोटे अणु संग्राहक भेदभाव और इसके बाद ग्लूकोज भुखमरी का प्रयोग मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उच्च शुद्ध cardiomyocytes की व्युत्पत्ति
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
मानव प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hiPSC-सीएमएस) बुनियादी अनुसंधान और translational अनुप्रयोगों के लिए उपलब्ध प्राथमिक cardiomyocytes की कमी से निपटने के लिए एक महत्वपूर्ण सेल स्रोत बन गए हैं। Cardiomyocytes में hiPSCs अंतर करने के लिए, embryoid शरीर (ईबी) आधारित भेदभाव और विकास के कारक शामिल करने सहित विभिन्न प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। हालांकि, इन प्रोटोकॉल अक्षम और शुद्ध cardiomyocytes उत्पन्न करने की क्षमता में अत्यधिक चर रहे हैं। हाल ही में, Wnt / β-catenin संकेतन का एक छोटा सा अणु आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग मॉडुलन उच्च दक्षता के साथ हृदय भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था। इस प्रोटोकॉल के साथ, विभेदित कोशिकाओं का अधिक से अधिक से अधिक 50% -60% कार्डियक ट्रोपोनिन पॉजिटिव cardiomyocytes लगातार मनाया गया थे। आगे cardiomyocyte शुद्धता बढ़ाने के लिए, विभेदित कोशिकाओं को विशेष रूप से चयापचय अंतर के आधार पर गैर-cardiomyocytes को खत्म करने के लिए भुखमरी ग्लूकोज के अधीन थेcardiomyocytes और गैर cardiomyocytes के बीच है। इस चयन की रणनीति का उपयोग करना, हम लगातार विभेदित कोशिकाओं की आबादी में गैर cardiomyocytes को cardiomyocytes के अनुपात में अधिक से अधिक से अधिक 30% की वृद्धि प्राप्त की। ये अत्यधिक शुद्ध cardiomyocytes विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययन और दवा स्क्रीनिंग assays में मानव IPSC आधारित से परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने चाहिए।
Introduction
प्राथमिक मानव cardiomyocytes क्योंकि इनवेसिव हृदय बायोप्सी, और क्योंकि संस्कृति में गरीब लंबी अवधि के सेल अस्तित्व के एकल कोशिकाओं को अलग कर में कठिनाई के लिए आवश्यकता के प्राप्त करने के लिए कठिन हैं। प्राथमिक मानव cardiomyocytes, रोगी विशेष मानव प्रेरित स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocyte की इस कमी को देखते हुए (hiPSC-मुख्यमंत्री) प्रौद्योगिकी एक बुनियादी अनुसंधान के लिए शक्तिशाली विकल्प cardiomyocyte स्रोत के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के रोग मॉडलिंग और दवा के रूप में नैदानिक और translational अनुप्रयोगों के रूप में माना गया है खोज 1। Cardiomyocytes में स्टेम सेल फर्क में शुरुआती प्रयासों embryoid निकायों (ईबीएस) का उपयोग भेदभाव प्रोटोकॉल कार्यरत हैं, लेकिन एक ईबी में कोशिकाओं की अक्सर कम 25% से अधिक cardiomyocytes 2,3 पिटाई कर रहे हैं क्योंकि इस विधि का उत्पादन cardiomyocytes में अक्षम है। तुलनात्मक रूप से, एक और BMP4 activin साइटोकिन्स का उपयोग कर एक monolayer आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल ईबीएस तुलना में एक उच्च दक्षता प्रदर्शित, लेकिनइस प्रोटोकॉल, अभी भी अपेक्षाकृत अक्षम है मानव स्टेम सेल लाइनों 4 की एक सीमित संख्या में महंगा वृद्धि कारक है, और केवल कार्यों की आवश्यकता है। हाल ही में, एक अत्यंत कुशल, hiPSC monolayer आधारित cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल Wnt / β-catenin 5 संकेत modulating द्वारा विकसित किया गया था। ये hiPSC, सीएमएस कार्डियक ट्रोपोनिन टी और अल्फा actinin, cardiomyocytes 6 की मानक मार्करों हैं कि दो sarcomeric प्रोटीन व्यक्त करते हैं। प्रोटोकॉल यहाँ का वर्णन इस छोटे अणु आधारित, फीडर सेल मुक्त, monolayer भेदभाव विधि 5,7 का रूपांतरण है। हम 7-10 दिन (चित्रा 1) के बाद hiPSCs से cardiomyocytes पिटाई प्राप्त करने में सक्षम हैं। हालांकि, 50% कोशिकाओं की धड़कन में जिसके परिणामस्वरूप एक cardiomyocyte भेदभाव के बाद, लगातार immunostaining इस तरह के हृदय-विशिष्ट ट्रोपोनिन टी और अल्फा-actinin के रूप में cardiomyocyte-विशिष्ट मार्करों के लिए नकारात्मक हैं कि गैर-cardiomyocytes की एक बड़ी आबादी के अस्तित्व को दर्शाता है। फू करने के लिएrther cardiomyocytes शुद्ध और गैर cardiomyocytes को खत्म करने, विषम विभेदित सेल आबादी कई दिनों के लिए एक अत्यंत कम ग्लूकोज मध्यम संस्कृति (चित्रा 2) के साथ उन्हें इलाज से भुखमरी ग्लूकोज के अधीन थे। इस इलाज के चुनिंदा एक कम ग्लूकोज पर्यावरण 8 में जीवित रहने के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत के रूप में लैक्टेट metabolize करने cardiomyocytes की क्षमता की वजह से गैर-cardiomyocytes, लेकिन नहीं गैर cardiomyocytes, समाप्त। इस शुद्धि कदम के बाद, गैर cardiomyocytes को cardiomyocytes के अनुपात में 40% की वृद्धि (चित्रा 3, चित्रा 4), मनाया जाता है और इन कोशिकाओं को नीचे की ओर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च शुद्ध hiPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के बुनियादी हृदय अनुसंधान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक और translational अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। कार्डिएक भेदभाव प्रोटोकॉल छोटे अणु-स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
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