Summary

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

Published: March 18, 2015
doi:

Summary

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Abstract

Madre pluripotentes cardiomiocitos derivados de células de origen humano (hiPSC-CM) se han convertido en una fuente de células importantes para abordar la falta de cardiomiocitos primarios disponibles para aplicaciones de investigación básica y traslacional. Para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos, diversos protocolos, incluyendo el cuerpo embrioide (EB) con base en la diferenciación y factor de crecimiento de inducción se han desarrollado. Sin embargo, estos protocolos son ineficientes y muy variable en su capacidad de generar cardiomiocitos purificados. Recientemente, un pequeño protocolo que utiliza la modulación basada en la molécula de la señalización de Wnt / β-catenina se muestra para promover la diferenciación cardiaca con alta eficiencia. Con este protocolo, mayor que 50% -60% de las células diferenciadas se cardiomiocitos de troponina-positivo cardiacas se observaron consistentemente. Para aumentar aún más la pureza de los cardiomiocitos, las células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición para eliminar específicamente no cardiomiocitos basado en la diferencia metabólicas entre los cardiomiocitos y los no cardiomiocitos. Usando esta estrategia de selección, se obtuvieron consistentemente un incremento mayor que 30% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos en una población de células diferenciadas. Estos cardiomiocitos altamente purificadas deben mejorar la fiabilidad de los resultados de humano a base de IPSC en estudios de modelos de la enfermedad in vitro y ensayos de cribado de fármacos.

Introduction

Cardiomiocitos humanos primarios son difíciles de obtener debido a la necesidad de biopsias cardíacas invasivas, dificultad de disociar a las células individuales, y debido a la mala supervivencia celular a largo plazo en la cultura. Dada esta falta de cardiomiocitos humanos primarios, células madre pluripotentes inducidas humanas cardiomiocitos derivados de células específicos para cada paciente tecnología (hiPSC-CM) ha sido considerada como una poderosa fuente de cardiomiocitos alternativa para la investigación básica, así como aplicaciones clínicas y de traducción, tales como el modelado de la enfermedad y la droga descubrimiento 1. Los primeros esfuerzos en la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos emplean protocolos de diferenciación utilizando cuerpos embrioides (EBS), pero este método es ineficiente en cardiomiocitos producen porque a menudo menos de 25% de las células en un EB están latiendo cardiomiocitos 2,3. Comparativamente, un protocolo de diferenciación basada en monocapa utilizando las citoquinas activina A y BMP4 muestra una eficiencia superior a EBS, peroeste protocolo es todavía relativamente ineficiente, requiere factores de crecimiento caro, y sólo funciona en un número limitado de pluripotentes humano líneas de células madre 4. Recientemente, un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente basado monocapa-hiPSC fue desarrollado por la modulación de Wnt / β-catenina señalización 5. Estos hiPSC-CM expresar troponina T cardiaca y actinina alfa, dos proteínas sarcoméricas que son marcadores estándar de cardiomiocitos 6. El protocolo describe aquí es una adaptación de este pequeño basado en la molécula, libre de células de alimentación, la diferenciación monocapa método 5,7. Estamos en condiciones de obtener superando los cardiomiocitos de hiPSCs después de 7-10 días (Figura 1). Sin embargo, tras una diferenciación de los cardiomiocitos que resulta en 50% de células de latir, la inmunotinción consistentemente muestra la existencia de una población de los no cardiomiocitos que son negativos para los marcadores-cardiomiocitos específica como la troponina-T cardíaca específica y alfa-actinina. Para further purificar cardiomiocitos y eliminar los no cardiomiocitos, las poblaciones heterogéneas de células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición tratándolos con un medio de cultivo de glucosa extremadamente bajo para múltiples días (Figura 2). Este tratamiento elimina selectivamente los no cardiomiocitos debido a la capacidad de los cardiomiocitos, pero no los no cardiomiocitos, para metabolizar el lactato como fuente de energía primaria con el fin de sobrevivir en un entorno de baja glucosa 8. Después de esta etapa de purificación, se observa un aumento del 40% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos, (Figura 3, Figura 4) y estas células se puede utilizar para el análisis de la expresión génica aguas abajo, el modelado de la enfermedad, y los ensayos de cribado de fármacos.

Protocol

NOTA: La información de proveedor para todos los reactivos utilizados en este protocolo ha sido incluido en la Tabla 1 y Lista de Materiales. Todas las soluciones y equipos que entren en contacto con las células deben ser estériles, y una técnica aséptica se deben utilizar en consecuencia. Realice todas las incubaciones de cultivo en un humidificado 37 ° C, 5% de CO2 menos que se especifique lo contrario. En este protocolo, todas las diferenciaciones se realizaron en …

Representative Results

Los cambios morfológicos durante hiPSC diferenciación. El hiPSC cultivaron en placas libres de alimentador creció colonias planas, bidimensionales. Al llegar a alrededor de 85% de confluencia, hiPSCs fueron tratados con 6 mM CHIR para la diferenciación (Figura 1A). Se observaron cantidades sustanciales de la muerte celular, un fenómeno normal y común, después de 24 horas de tratamiento CHIR. Después de dos días de tratamiento CHIR, los hiPSCs contin…

Discussion

La obtención de una gran cantidad de cardiomiocitos hiPSC derivado altamente purificada es crítica para la investigación cardiaca básica, así como las aplicaciones clínicas y de la traducción. Protocolos de diferenciación cardíacos han sufrido grandes mejoras en los últimos años, la transición de métodos basados ​​en el cuerpo embrioides que utilizan el crecimiento cardiogénico los factores 2, a la matriz métodos sándwich 12, y finalmente a los métodos basados ​​en pequeña…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

Materials

Name Company Catalog number
Matrigel (9-12 mg/mL) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
  2. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
  3. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  4. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  5. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  6. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
  7. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  8. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
  9. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
  10. Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
  11. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  13. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).

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Cite This Article
Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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