Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.
Introduction
Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Herzmuskelzellen verwendet Differenzierungsprotokollen mit Embryoidkörper (EB), aber dieses Verfahren ist nicht effizient bei der Herstellung von Herzmuskelzellen, da oft weniger als 25% der Zellen in einem EB schlagen Kardiomyozyten 2,3. Vergleichsweise, eine Monobasis Differenzierungsprotokoll unter Verwendung der Zytokine Aktivin A und BMP4 angezeigt einen höheren Wirkungsgrad als EBs, aberDieses Protokoll ist immer noch relativ ineffizient und erfordert eine teure Wachstumsfaktoren und funktioniert nur in einer begrenzten Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien 4. Vor kurzem wurde eine hocheffiziente, hiPSC Monolayer-basierte Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll durch Modulation Wnt / β-Catenin-Signalweg 5 entwickelt. Diese hiPSC-CMs auszudrücken Troponin T und Alpha Actinin, zwei sarkomerischen Proteine, die Standard-Marker von Herzmuskelzellen 6. Das Protokoll beschreibt hier ist eine Anpassung dieser niedermolekulare, Feeder zellfreie, Mono Differenzierung Verfahren 5,7. Wir sind in der Lage zu schlagen Kardiomyozyten aus hiPSCs nach 7-10 Tagen (Abbildung 1) zu erhalten. Jedoch nach einer Kardiomyozytendifferenzierung einer 50% schlagen Zellen, Immunfärbung zeigt einheitlich das Vorliegen einer Population von Nicht-Herzmuskelzellen, die negativ für Kardiomyozyten-spezifische Marker wie Herz-spezifisches Troponin T und alpha-Actinin sind. Um fueitere reinigen Kardiomyozyten und die Beseitigung nicht-Kardiomyozyten wurden heterogene differenzierten Zellpopulationen unterzogen, um Hunger, indem sie mit einem extrem niedrigen Glukosekulturmedium für mehrere Tage (Abbildung 2) Glukose. Diese Behandlung selektiv eliminiert nicht Kardiomyozyten aufgrund der Fähigkeit von Kardiomyozyten, aber nicht nicht-Kardiomyozyten, Lactat als Primärenergiequelle, um in einer niedrigen Glucoseumgebung 8 überleben metabolisieren. Nach diesem Reinigungsschritt wird eine 40% ige Zunahme im Verhältnis von Kardiomyozyten nicht Kardiomyozyten beobachtet (Figur 3, Figur 4) und der nachgeschalteten Genexpressionsanalyse, Krankheitsmodelle und Wirkstoff-Screening-Assays können diese Zellen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden 5 unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren 2, um Sandwichverfahren 12 Matrix und schließlich. Der vorstehend …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
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