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Developmental Biology

从人类诱导多能干细胞使用小分子调制分化和随后的葡萄糖饥饿高度纯化心肌推导

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

诱导的人多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC-CMS)已成为一种重要的细胞源,以解决缺乏可用于基础研究和翻译的应用程序主心肌。分化人iPS细胞为心肌细胞,已经开发了各种协议,包括胚状体(EB)为基础的分化和生长因子诱导。然而,这些协议是低效,并在其产生纯化的心肌细胞的能力高度可变。最近,的Wnt /β-catenin信号的小分子为基础的协议利用调制被证明促进心脏分化效率高。与此协议中,分化的细胞大于50%-60%为心肌肌钙蛋白阳性心肌细胞持续观察。为了进一步增加心肌的纯度,分化的细胞进行葡萄糖饥饿基于代谢差异特异性消除非心肌细胞s心肌细胞和非心肌细胞之间。使用此选择策略,我们一致地得到增加心肌非心肌细胞的比率在分化细胞群一大于30%。这些高度纯化心肌要增强人类iPSC的基于体外疾病模型研究和药物筛选测定法的结果的可靠性。

Introduction

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原代人心肌细胞是因为侵入性心脏活检,难以解离为单细胞的,而且由于差的长期存活的细胞在培养中的要求很难获得。鉴于这种缺乏原代人心肌细胞,针对具体患者的诱导的人多能干细胞衍生的心肌细胞的(hiPSC-CM)的技术已被认为是一个功能强大的替代来源的心肌细胞的基础研究以及临床和翻译的应用,如疾病建模和药物发现1。在分化的多能干细胞分化为心肌细胞的早期努力采用使用胚状体(EB)分化的协议,但这种方法是低效的生产心肌细胞,因为常常少于25%的细胞在使用EB均跳动的心肌细胞2,3。相比较而言,用激活素A和BMP4的细胞因子的单层基分化方案所显示的更高的效率比的EB,但该协议还比较低效率的,需要昂贵的生长因子,并在人多能干细胞系的4有限数量的唯一功能。近日,一个高效,hiPSC单层型心肌细胞分化协议是通过调控Wnt信号/β-catenin信号5开发。这些hiPSC-CM的表达肌钙蛋白T和α辅肌动蛋白,双肌蛋白是心肌6标准的标记。这里的协议描述是这样的小分子为基础,馈线无细胞,单层分化法5,7的适应。我们能够获得后7-10天( 图1),从人iPS细胞跳动的心肌细胞。然而,下面的一个心肌细胞的分化导致50%的跳动细胞,始终如一的免疫染色显示了非心肌细胞是阴性的心肌特异性标记物,如心脏特异性肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白的群体的存在。来福rther纯化心肌细胞,并消除非心肌细胞,异质分化细胞群经受由具有非常低葡萄糖培养基中多天( 图2)处理它们对葡萄糖饥饿。这种处理有选择地消除非心肌细胞由于心肌细胞的能力,但不是非心肌细胞,代谢乳酸作为主要能量来源,以便在一个低葡萄糖环境8生存。在此之后的纯化步骤中,在心肌细胞中,以非心肌细胞的比率增加了40%被观察到的,( 图3,图4),并且这些细胞可以用于下游的基因表达分析,疾病建模和药物筛选试验。

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Protocol

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注:供应商信息,在这个协议中使用的所有试剂已列于表1 材料清单。所有解决方案和设备进入与细胞接触必须是无菌的,并且无菌技术应相应使用。除非另有规定执行所有培养孵育在加湿37℃,5%CO 2的培养箱中培养。在这个协议中,所有的分化在6孔板中进行,其中的人iPS细胞是种子。以下分化和纯化,细胞可被解离和再接种供下游使用。

1.准备中

  1. 为E8介质,使原液的每个介质组分( 碳酸氢钠 ,L-抗坏血酸-2-磷酸,亚硒酸钠,转铁蛋白,胰岛素,FGF2,TGFB1)和存储溶液在-20℃。加入储备溶液适量至瓶子的DMEM / F12,并过滤灭菌。该解决方案精矿ATION和反应设置为库存组分和E8介质可以在表1中找到。
  2. 对于细胞外基质溶液中,解冻基底膜基质(10毫克/毫升通常供应)在4℃CO / N。基质胶是常用的多能性干细胞培养,因为人多能干细胞可以使用的α-6-β-1整联9很好地粘附到该材料。一旦解冻,使使用冰冷的枪头和管冰上2.25毫克(250微升)等分并储存在等分-80℃。
    1. 当ECMS预涂板,解冻和分装冰的细胞外基质溶液(ECMS)。在冰上200:混合ECM和冰冷的DMEM / F12培养基中的比例为1。保持冷静,以防止过早凝固ECMS。
  3. 对于RPMI / B27无胰岛素中,加10减B27胰岛素毫升到500ml RPMI媒体。
  4. 对于RPMI / B27(胰岛素)中,加入10 mL B27补充(带insulin)的和5ml青霉素 - 链霉素抗生素到500ml RPMI培养基中。
  5. 对低葡萄糖培养基中,加入10 mL B27添加剂和5ml的青霉素 - 链霉素抗生素到500ml葡萄糖的RPMI介质。
  6. 用于冷冻/冷冻保存介质中,一起混合胎牛血清用二甲基亚砜(DMSO)以9:1的比例。冷冻介质可以存储长达1个月,在4℃。
    注意:所有媒体应该被过滤并存储在4℃下并且除非另有说明在2周内使用。下面所用的所有试剂/溶液体积是供单个井在一6孔板,除非另有规定。

2.预涂覆的6孔板的ECMS

  1. 使ECMS通过混合基底膜基质( 例如 ,基质胶)用冰冷的DMEM / F12培养基中的比例为1:200,然后应用2毫升新鲜制成ECM的到各孔为一个6孔板中。每个孔在6孔板将获得约90毫克ECMS。
  2. 孵育ECMS上37℃下包被板1小时。之前立即镀细胞每孔,吸出DMEM / F12溶液。那么板块将准备接收细胞。

3.解冻冰封人iPS细胞

注:紧跟此过程,因为它可能导致最佳的培养人iPS细胞和成hiPSC-CMS的以下的冷冻/解冻循环下游分化。

  1. 人iPS细胞解冻一小瓶的6孔板的每个孔中。制备的15毫升锥形管中9ml冷E8介质与ROCK抑制剂(10μM)对每个小瓶。 ROCK抑制剂提高了人iPS细胞的生存以下冷冻保存10。保持在37℃的水浴的小瓶解冻所述细胞直至约5毫米直径的冰晶体在左边。
  2. 喷用70%乙醇小瓶的外部。将它们转移到无菌层流罩之前,先用纸巾小瓶。
  3. 转移细胞进入准备锥形管。冲洗吨他小瓶一次用500μlE8培养基并传送包含该解冻细胞相同的锥形管的平台。离心机在室温下以200×g下4分钟。
  4. 离心后吸出上清液,并轻轻重悬细胞沉淀用2ml E8培养基与ROCK抑制剂(10μM)。转移的悬浮细胞至一个6孔板预先涂覆有ECM的一个阱。
  5. 培养24小时后更换而不ROCK抑制剂与E8介质的介质。细胞应该坚持这个时候。

4.传代人iPS细胞的

  1. 通常情况下,在一个6孔板达到75%-80%汇合后通道人iPS细胞。吸出培养基。用1毫升无菌,RT PBS快速洗井。吸PBS。
    1. 加入500微升0.5毫摩尔EDTA或1x细胞剥离溶液( 的Accutase),并孵育在室温下1-7分钟。适当的时候EDTA孵化随hiPSC线。期待看到明显的卷曲Ø边缘周围的菌落ř增稠,因为这将表明,EDTA或细胞剥离溶液准备好被除去。
  2. 吸出的EDTA或细胞分离溶液。加入1毫升E8培养基补充有10μM的ROCK抑制剂。置换hiPSC菌落在井通过反复上下吹吸,并与一个P1000移液器喷雾菌落关闭。菌落被分成完成后5-10细胞团块。
  3. 传送被在1ml E8介质与ROCK抑制剂的悬浮入15ml锥形管中的菌落。
  4. 破坏大细胞团块成在E8中小团块。与抑制剂添加E8媒体的适当体积的细胞悬浮液稀释细胞。媒体量添加稀释取决于细胞密度,也可以接种井的数量。理想的情况下,人iPS细胞的一个单一的,80%的汇合以及应稀释1:12
    1. 添加11毫升E8介质ROCK抑制剂现有1毫升的CE在上述的15毫升锥形管LL溶液中以获得1:12的稀释。
  5. 进一步磨碎的细胞团块成小的细胞碎片(约50-200细胞在每个片段中是最好的)。避免过度捣碎,因为这减少了细胞的存活。
  6. 吸ECMS来自预包被的板并加2ml悬浮细胞向每个孔中。每一个6孔板的约100,000个细胞是理想的。旨在均匀地分配围绕井的细胞,以避免在井的中心小区的聚类。
  7. 经过培养24小时,更换E8介质中无ROCK抑制剂。改变培养基每24小时,直到细胞成为80%汇合。然后,将细胞准备通道一次。它通常需要段落之间的3-6天达到80%汇合。

5.冻人iPS细胞

注:紧跟这一程序,因为它可能导致最佳的培养和髋部的下游分化雪旺成hiPSC-CMS以下的冷冻/解冻循环。

  1. 标号低温管与所述细胞系的名称,细胞类型,通道号,以及冷冻时间。作为一般准则,用一个小瓶的6孔板的每个孔中。制备的15毫升锥形管中填充用9ml E8介质与ROCK抑制剂(10μM)。制备冷冻培养基用90%FBS和10%DMSO中,并保持该介质在4℃下,直到准备使用。
  2. 吸出培养基,加入500微升0.5毫摩尔EDTA或1x细胞分离液,孵育在室温下2-7分钟。的EDTA或细胞剥离溶液接触的持续时间从细胞系而异的细胞系。
  3. 吸EDTA或细胞分离液。加入1毫升E8介质。
  4. 置换在阱hiPSC菌落通过上下抽吸并用P1000移液器喷雾菌落关闭。菌落不应被破碎成小于100的细胞团块。转移悬浮的细胞,以制备锥形管含有E8。离心机为RT代表在200×g下4分钟。
  5. 吸出上清液,并添加500μl的冷冻介质中的颗粒。吹打的一至两倍重悬沉淀。细胞存活是通过保持细胞大团块改善。
  6. 转移悬浮细胞成标低温管。快速移动的小瓶进入冷冻含有异丙醇的容器中,这将允许为逐步冷却。保持容器与细胞在-80℃下放置24小时,然后将细胞转移到液氮中用于长期贮存。

人类的iPSC 6.心脏分化

注:加入时,所有的媒体应该至少在RT。

  1. 离解用EDTA或1x细胞剥离溶液后,种子就ECMS涂覆的6孔培养板中进行分化大约100,000人类iPSC(相同的步骤,细胞传代过程)。当细胞达到85%汇合,改变介质为RPMI / B27没有与6中胰岛素μMGSK3-β抑制剂CHIR99021(CHIR)并保持48小时。
  2. 48小时后,更换RPMI / B27含CHIR培养基无胰岛素中,独自离开24小时(到3天)。
  3. 在第3天,无胰岛素与5μM的Wnt抑制剂IWR1改变媒体RPMI / B27并保持48小时(直到第5天)。
    注:的Wnt抑制还可以使用其它小分子化合物尝试,如在早先的研究11说明。 IWR1被选择比其它小分子Wnt信号的抑制剂,由于在它已被证明可有效地抑制Wnt信号11的上升范围。
  4. 第5天,改变介质回RPMI / B27无胰岛素中,留下48小时(到7天)。
  5. 在第7天,更换用R​​PMI / B27培养基(胰岛素)培养基中,并以同样的培养基其后每3天更换培养基。心肌细胞的自律搏动首先应该是可见约8日复一日10。

经过葡萄糖饥饿7.净化人类心肌细胞的

  1. 在第10天的后分化,改变在6孔板至2ml低葡萄糖培养基的每孔中的培养基,并维持细胞在该培养基中3天(直至第13天)。
  2. 在第13天,恢复细胞的RPMI / B27培养基(胰岛素)。
  3. 任选地,replate之前第二轮葡萄糖饥饿,以帮助放松从培养板的非心肌细胞,允许对非心肌细胞中葡萄糖饥饿容易解离的心肌细胞。
    1. 在第13天,吸出培养基,用PBS洗一次,并用500微升的细胞解离的酶进行5分钟,在37℃下解离的细胞分化成单细胞。具体地讲,5分钟酶处理后,可以使用一个1000微升吸管反复拉起细胞离解酶和喷涂它靠在cardiomyo手动解离从6孔板心肌CYTE单层。高达30移液重复可能需要解离的心肌细胞为单细胞。
    2. 后的细胞被离解,并在单细胞形式,收集所有细胞入15ml锥形管中填充用5ml RPMI / B27培养基的胰岛素来稀释出细胞离解酶和离心机在200×g下4分钟。吸并丢弃上清液。
    3. 重新悬浮细胞用2ml的RPMI / B27培养基和板到一个新ECMS被覆6孔板中。通常情况下,心肌更高的融合有助于细胞存活replating期间。旨在replate每个新的6孔盘以获得最佳的生存2000000细胞replating期间。
  4. 在第14天,改变介质回〜2毫升的低血糖中的第二个缺糖周期。培养的细胞在这种低血糖状态持续3天以上。大多数非心肌细胞会死在这种低血糖培养条件。
  5. 在17天,改变R的中型〜2毫升PMI / B27介质胰岛素。剩余的细胞将是高度纯化心肌细胞。这些心肌细胞可用于基因表达分析,药物筛选,代谢分析,以及其他各种下游测定。

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Representative Results

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在hiPSC分化的形态变化。

所述hiPSC在无饲养平板上培养生长为平坦的,二维的菌落。当达到约85%汇合,人iPS细胞分别用6微米的CHIR处理分化( 图1A)。细胞死亡,一个正常的和普遍的现象,显着量的CHIR治疗的24小时后进行观察。后CHIR治疗两天,人iPS细胞持续分化朝向中胚层的命运。相较于细胞的hiPSC克隆,细胞大小,这些天2细胞增多。手机号码也可以通过细胞分裂( 图1B)增加。在第5天,在中胚层细胞,朝向心脏谱系(心脏中胚层)。此时,细胞开始聚结并形成特性,分支状结构( 图1C)。在第10天,分支状的结构进行了高度显着,与心肌星泰德自发跳动( 图1D)。终末分化的心肌细胞不会增殖超出了这一点。该分化方案的时间线示于图2。

免疫染色和流式细胞仪结果发现心肌细胞纯化葡萄糖饥饿。

经过10天的分化,细胞的区域的50%以上都跳动。然而,击败细胞片,有时也夹杂着非心肌细胞。检查心肌纯度,细胞免疫抗心肌标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表征发现,大部分细胞的cTnT阳性。然而,在分化的细胞的未纯化的人口,一些细胞还缺乏cTnT的表达,这表明非心肌细胞在此分化人口在第13天( 图3A)的存在。然而,随着葡萄糖饥饿,几乎所有剩余的细胞的cTnT阳性在第13天( 图3B),表明该心肌细胞的下列葡萄糖饥饿成功纯化。这些数据用流式细胞仪分析进一步证实。分化的细胞,在第13天的后分化的人口含有大约50%的TNNT2 +细胞时不是葡萄糖饥饿( 图4A)。并行的分化也进行,但与3天缺糖分化开始后第10天。与此相反的unstarved分化,葡萄糖剥夺导致含90%TNNT2 +细胞在第13天( 图4B)的纯化的人口。

图1
图1.在hiPSC对心脏谱系分化的连续形态变化。(A)人iPS细胞未分化在每天0展览典型的菌落形态和周围85%汇合达。 (B)的在第2天,与CHIR处理后的细胞两天达到100%汇合,进入中胚层谱系。 (c)在第5天,将细胞用IWR1处理后2天进入心脏中胚层的阶段。一些细胞开始融合,并形成特性枝状形貌(由箭头表示)。 (d)在7-10天,分支状结构是高度明显,心肌细胞开始自发跳动。酒吧= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.时间轴hiPSC-CM分化协议和随后的葡萄糖饥饿过程。跳动的心肌细胞一重新通常先在大约7-10天的观察。两轮葡萄糖饥饿会导致心肌细胞17天的纯化人口。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.免疫荧光显示心肌下面葡萄糖饥饿的净化。(A)13天后分化沾满心肌肌钙蛋白T(cTnT)的未纯化细胞。大多数细胞已经分化成心肌细胞和人肌钙蛋白阳性,但一些非心脏,肌钙蛋白阴性细胞也存在。 (B)中与此相反,3天的葡萄糖饥饿开始在第10天之后,几乎所有的存活细胞是肌钙蛋白由天13比例尺=200μm的正极。REF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.流式细胞术揭示了心肌细胞的下列葡萄糖饥饿纯化。(A)的 13天后心肌分化无葡萄糖饥饿,细胞群表现出大约50%TNNT2 +心肌细胞。红色表示的分化的细胞群,蓝色表示未分化人iPS细胞作为阴性对照。 (B)经过10天的心脏分化,随后由葡萄糖饥饿3天,来自同批分化的细胞群纯化含有90%TNNT2 +心肌细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

对于E8介质成分
E8 体积:1升 公司 目录编号
的DMEM / F12与谷氨酰胺和HEPES 千毫升英杰 11330-032
的NaHCO 3(7.5%,75毫克/毫升) 7.24毫升英杰 25080-094
L-抗坏血酸-2-磷酸(64毫克/毫升) 1毫升适马 A8960
亚硒酸钠(70微克/毫升) 200微升适马 S5261
转铁蛋白(50毫克/毫升) 214微升适马 T3705
胰岛素(4毫克/毫升) 5毫升英杰 12585-014
FGF2(200毫微克/微升) 500微升 Peprotech公司 100-18B
TGFB1(100毫微克/微升) 20微升 Peprotech公司 100-21
库存解决方案E8组成
L-抗坏血酸-2-磷酸(64毫克/毫升) 3.2克在50ml超纯水中,存储500微升等分在-20℃下
转铁蛋白(50毫克/毫升) 500毫克的10ml超纯水,商店107微升等分在-20℃下
亚硒酸钠(70微克/毫升) 35毫克亚硒酸钠入500ml超纯水中,商店100微升等分在-20℃下
FGF2(200毫微克/微升) 1毫克的5ml冷D-PBS,存储250微升等分在-20℃
TGFB1(100毫微克/微升) 100微克在1ml冷的10 mM柠檬酸,pH为3,保存10微升等分在-20℃下

表1.组成E8培养基。

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Discussion

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得到大量的高纯度的hiPSC衍生的心肌细胞是基本心脏研究以及临床和转化应用的关键。心脏分化协议已经在最近几年发生了巨大的改进,从利用心源性生长胚状体为基础的方法转变因子2,以矩阵夹心方法12,最后以小分子调制和单层为基础的方法5。上述协议,这里描述的方案中显示的最高和最可重复的心脏分化效率不同hiPSC细胞系通过使用小分子CHIR和IWR 5,7调制的Wnt /β-catenin信号。具体地,未分化人iPS细胞诱导接受胚层分化与GSK3-β抑制剂CHIR和随后的心脏分化与Wnt信号传导的抑制剂IWR1。这些顺序步骤Wnt信号调制,在心脏沿袭诱导期得益于胰岛素枯竭,导致了高效的心脏分化。 CHIR是用于中胚层诱导的公共小分子GSK3-β抑制剂,但是其他的小分子,GSK3-β抑制心肌细胞的分化协议11进行了测试。多个选项也使用用于随后的小分子Wnt信号的抑制剂。例如,最近的出版物多能干细胞的化学成分确定的分化聚焦到心肌细胞使用2微米的Wnt-C59进行有效的Wnt抑制和心脏中胚层诱导11。

此外,所述分化心肌与葡萄糖饥饿法进一步纯化,这需要在不同的葡萄糖代谢的优点流动心肌细胞和非心肌细胞8之间存在的。重要的是要注意的是,葡萄糖饥饿方法的有效性是d密度依赖性( 即,微分即产生心肌细胞的更高的百分比更可能实现更高的心肌存活)。但是,过渡到低葡萄糖培养基也是压力条件为心肌细胞。后葡萄糖饥饿3天来改变细胞回常规的RPMI / B27胰岛素介质是重要的。在这个协议中,一个无饲养生长系统被使用,其中,多能干细胞没有生长在馈线小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。然而,现有心脏分化的协议已经利用馈线为基础的系统,以从多能干细胞5产生的心肌细胞。同样地,现有的协议也使用mTeSR1介质为干细胞的维持,但在这里所使用的E8媒体和无饲养系统优于由于其简单和缺乏过量异种成分例如牛血清白蛋白和小鼠胚胎成纤维细胞。

目前,朝向心肌谱系的多能干细胞分化的主要是健壮的,但是从hiPSC线到线变异仍然遭受在效率方面。这仍然是在心脏分化领域的一个重大问题,需要进一步研究。分化效率由适当的维修的hiPSC行改进,并且特别地,防止overconfluency期间hiPSC维护。额外可变性来源于细胞接种在传代过程中,由于人iPS细胞的均匀播种单层趋于产生最佳整体分化。这里,小鼠衍生的,在细胞培养期间基质胶基ECMS用于细胞接种成功利用,但最终过渡到无异物衬底被推荐。在问候细胞接种于ECMS,播种不匀往往导致在特定以及心肌细胞分布不均。例如,如果人iPS细胞不均接种,一井在六孔板的边缘可能会引起HIG她的数字心肌比阱的中心。这些不均匀的播种条件可能会引起低效率分化和非心肌细胞的数量较多,如成纤维细胞和平滑肌细胞中胚层衍生物。我们还观察到,低效率的分化(50%以下),更难以用在这里所提到的葡萄糖剥夺过程纯化。长期葡萄糖饥饿的另一个副作用是在心肌细胞生存能力的潜在损失。虽然心肌能够代谢乳酸在没有葡萄糖的,我们发现,这个开关的低葡萄糖环境是有压力的细胞。细胞可自发地停止跳动,以及如果葡萄糖饥饿延长超过推荐时间可观察到一些细胞损失。葡萄糖剥夺这种增强的敏感性可能是反映干细胞衍生cardiomyocy行之有效的发育,功能和电生理不成熟TES相较于真正的成人心肌13。

总之,这里所描述的协议相结合的小分子基,hiPSC单层心肌分化方法与心肌净化葡萄糖饥饿法。该协议允许重复的代高纯度的心肌细胞,并应促进相关心血管疾病建模和药物筛选各种下游实验。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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从人类诱导多能干细胞使用小分子调制分化和随后的葡萄糖饥饿高度纯化心肌推导
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Cite this Article

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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