Udledning af højt oprenset Cardiomyocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller Brug lille molekyle-moduleret Differentiering og efterfølgende Glucose Sult

Summary

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Abstract

Menneskelige induceret pluripotente stamceller celleafledte cardiomyocytter (hiPSC-CMS) er blevet en vigtig celle kilde til at afhjælpe manglen på primære cardiomyocytes rådighed for grundforskning og translationelle applikationer. For at differentiere hiPSCs i cardiomyocytter har forskellige protokoller, herunder embryoid legeme (EB) -baseret differentiering og vækstfaktor induktion blevet udviklet. Men disse protokoller er ineffektive og meget varierende i deres evne til at generere oprensede cardiomyocytter. For nylig blev et lille molekyle-baseret protokol under anvendelse modulering af Wnt / β-Catenin signalering vist sig at fremme hjerte- differentiering med høj effektivitet. Med denne protokol, mere end 50% -60% af differentierede celler var kardial troponin-positive cardiomyocytter blev konsekvent overholdes. For yderligere at øge cardiomyocyte renhed blev de differentierede celler udsat for glucose sult specifikt fjerne ikke-cardiomyocytter baseret på den metaboliske forskels mellem cardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter. Brug dette valg strategi, vi konsekvent opnået en stigning på over 30% i forholdet kardiomyocytter til ikke-kardiomyocytter i en population af differentierede celler. Disse meget oprensede cardiomyocytter bør øge pålideligheden af resultaterne fra human iPSC-baserede in vitro sygdom modellering undersøgelser og lægemiddelscreeningsassays.

Introduction

Primære humane cardiomyocytter er vanskeligt at opnå på grund af kravet om invasive hjerte- biopsier, svært ved at dissociere til enkelte celler, og på grund af dårlig langvarig celleoverlevelse i kultur. I betragtning af denne mangel på primære humane cardiomyocytter, patient-specifikke menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledt cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknologi er blevet betragtet som et godt alternativ cardiomyocyte kilde til grundforskning samt kliniske og translationelle applikationer såsom sygdom modellering og narkotika discovery ^1. Tidlige indsats differentiere pluripotente stamceller i kardiomyocytter ansat differentiering protokoller der anvender embryoide organer (EBS), men denne metode er ineffektiv i producerer cardiomyocytter fordi ofte mindre end 25% af cellerne i en EB er at slå cardiomyocytter ^2,3. Forholdsvis, et monolag differentiering protokol ved hjælp af cytokiner Activin A og BMP4 viste en højere effektivitet end EB'er, mendenne protokol er stadig relativt ineffektiv, kræver dyre vækstfaktorer og fungerer kun i et begrænset antal humane pluripotente stamcellelinjer ^4. For nylig blev en yderst effektiv, hiPSC monolag-baserede cardiomyocyte differentiering protokol udviklet ved at modulere Wnt / β-Catenin signalering ^5. Disse hiPSC-CMS udtrykke kardial troponin T og alfa actinin, to sarcomerisk proteiner, som er standard markører for cardiomyocytter ^6. Protokollen beskriver her er en tilpasning af dette lille molekyle-baserede, feeder celle-fri, monolag differentiering metode ^5,7. Vi er i stand til at opnå slå cardiomyocytter fra hiPSCs efter 7-10 dage (Figur 1). Men efter en cardiomyocyte differentiering resulterer i 50% at slå celler, immunfarvning konsekvent viser, at der findes en population af ikke-cardiomyocytter, der er negative for cardiomyocyte-specifikke markører, såsom hjerte–specifikke troponin T og alpha-actinin. Til further oprense cardiomyocytter og fjerne ikke-cardiomyocytter blev heterogene differentierede cellepopulationer underkastet glucose sult ved at behandle dem med en ekstremt lav glucose dyrkningsmedium til flere dage (figur 2). Denne behandling selektivt fjerner ikke-cardiomyocytter skyldes muligheden af cardiomyocytter, men ikke ikke-cardiomyocytter at metabolisere lactat som den primære energikilde for at overleve i en lav glucose miljø ^8. Efter dette rensningstrin, observeres en stigning i forholdet af cardiomyocytter til ikke-cardiomyocytter 40% (figur 3, figur 4), og disse celler kan anvendes til nedstrøms genekspression analyse sygdomsmodeller og lægemiddel-screeningsassays.

Protocol

BEMÆRK: Sælger information for alle reagenser i denne protokol er blevet opført i tabel 1 og Materialer List. Alle løsninger og udstyr, der kommer i kontakt med celler skal være sterile, og aseptisk teknik skal anvendes i overensstemmelse hermed. Udfør alle kultur inkubationer i en befugtet 37 ° C, 5% CO 2-inkubator, medmindre andet er angivet. I denne protokol, er alle differentieringer udført i 6-brønds plader, hvor hiPSCs er seedede. Efter differentiering og ren…

Representative Results

De morfologiske ændringer i hiPSC differentiering. Den hiPSC dyrket i fødefri plader voksede som flade, todimensionelle kolonier. Da de nåede omkring 85% konfluens, blev hiPSCs behandlet med 6 uM CHIR for differentiering (figur 1A). Betydelige mængder af celledød, en normal og almindeligt fænomen, blev observeret efter 24 timer af CHIR behandling. Efter to dages CHIR behandling, de hiPSCs fortsat at differentiere hen imod en mesodermal skæbne. I samme…

Discussion

Erhvervelse af en stor mængde højt oprensede hiPSC-afledte cardiomyocytter er kritisk for grundlæggende hjerte-forskning samt kliniske og translationelle applikationer. Hjertedifferentiering protokoller har undergået enorme forbedringer i de seneste år, der skiftes fra embryoide body-baserede fremgangsmåder, der anvender kardiogent vækstfaktorer ^2, til matrix sandwich metoder ^12, og endelig til små molekyle-moduleret og monolag-baserede metoder ^5. Af de førnævnte protokoller, p…

Materials

Name	Company	Catalog number
Matrigel (9-12 mg/mL)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Glucose free RPMI media	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (w/ insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-strep antibiotic	Invitrogen	15140122
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell lifter	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011