Avledning av Highly Purified kardiomyocytter fra menneskeskapte Pluripotent stamceller ved hjelp av små Molecule-modulert Differensiering og Følgende Glucose Sult

Summary

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Abstract

Menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMS) har blitt en viktig celle kilde for å løse mangelen på primær kardiomyocytter tilgjengelige for grunnforskning og translasjonsforskning applikasjoner. For å skille hiPSCs inn kardiomyocytter, har ulike protokoller inkludert embryoid kroppen (EB) -basert differensiering og vekstfaktor induksjon blitt utviklet. Disse protokollene er ineffektiv og meget variabel i deres evne til å generere rensede kardiomyocytter. Nylig ble et lite molekyl-basert protokoll benytter modulering av Wnt / β-catenin signale vist seg å fremme differensiering hjerte med høy effektivitet. Med denne protokoll, var større enn 50% -60% av differensierte celler hjerte troponin-positive kardiomyocytter ble konsekvent observert. For ytterligere å øke cardiomyocyte renhet ble de differensierte cellene utsettes for glukose sult for spesifikt å eliminere ikke-kardiomyocytter basert på den metabolske forskjellens mellom cardiomyocytes og ikke-kardiomyocytter. Ved hjelp av dette valget strategi, vi konsekvent fått en større enn 30% økning i forholdet mellom kardiomyocytter til ikke-cardiomyocytes i en populasjon av differensierte celler. Disse høyt rensede kardiomyocytter bør forbedre påliteligheten av resultatene fra menneskelig IPSC-basert in vitro sykdom modelleringsstudier og narkotika screening-analyser.

Introduction

Primære humane kardiomyocytter er vanskelig å oppnå på grunn av kravet til invasive biopsier, vanskeligheter med å dissosiere til enkeltceller, og på grunn av dårlig langtidscelleoverlevelse i kultur. Gitt denne mangel på primære humane kardiomyocytter, pasient-spesifikke menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknologi har vært ansett som en kraftig alternativ cardiomyocyte kilde for grunnforskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner som sykdom modellering og narkotika oppdagelse ^en. Tidlig innsats i å differensiere pluripotente stamceller inn kardiomyocytter ansatt differensiering protokoller ved hjelp av embryoid organer (EBS), men denne metoden er ineffektiv i produserende cardiomyocytes fordi ofte mindre enn 25% av cellene i en EB er juling cardiomyocytes ^2,3. Relativt, en monolayer basert differensiering protokollen ved hjelp av cytokiner aktivin A og BMP4 vises en høyere virkningsgrad enn EBS, mendenne protokollen er fortsatt relativt ineffektiv, krever dyre vekstfaktorer, og fungerer kun i et begrenset antall menneskelige pluripotente stamcellelinjer ^4. Nylig ble en svært effektiv, hiPSC monolayer-basert cardiomyocyte differensiering protokoll utviklet av moduler Wnt / β-catenin signale ^5. Disse hiPSC-CMs uttrykke hjerte troponin T og alfa actinin, to sarcomeric proteiner som er standard markører for kardiomyocytter ^6. Protokollen beskriver her er en tilpasning av denne lite molekyl-baserte, mater celle-fri, mono differensiering metode ^5,7. Vi er i stand til å få juling cardiomyocytes fra hiPSCs etter 7-10 dager (Figur 1). Imidlertid, etter en cardiomyocyte differensiering som resulterer i 50% av stolpene celler, farging konsekvent viser eksistensen av en populasjon av ikke-kardiomyocytter som er negative for cardiomyocyte-spesifikke markører så som hjertespesifikk troponin T og alfa-actinin. Til further rense kardiomyocytter og eliminere ikke-kardiomyocytter, ble heterogene differensierte cellepopulasjoner kastet glukose sult ved å behandle dem med en ekstremt lav glukosekulturmedium for flere dager (figur 2). Denne behandling selektivt eliminerer ikke-kardiomyocytter på grunn av evnen til kardiomyocytter, men ikke ikke-kardiomyocytter, for å forbrenne laktat som den primære energikilde for å overleve i et lavt glukose miljø ^8. Etter dette rensetrinnet, er en 40% økning i forholdet av kardiomyocytter til ikke-kardiomyocytter observert (figur 3, figur 4), og disse celler kan brukes til nedstrøms genekspresjonsanalyser, sykdoms modellering og medikamentscreeningsanalyser.

Protocol

MERK: Vendor informasjon for alle reagenser som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1 og Materialer List. Alle løsninger og utstyr som kommer i kontakt med cellene må være sterilt og aseptisk teknikk brukes tilsvarende. Utføre alle kultur inkubasjonene i en fuktet 37 ° C, 5% CO 2 inkubator med mindre annet er spesifisert. I denne protokollen, er alle differensiering utført i 6-brønners plater, hvor hiPSCs sås. Etter differensiering og rensing, kan cellen…

Representative Results

De morfologiske endringer under hiPSC differensiering. Den hiPSC dyrket i mater frie plater vokste som flate, todimensjonale kolonier. Ved å nå rundt 85% confluency, ble hiPSCs behandlet med 6 mikrometer tsjir for differensiering (figur 1A). Betydelige mengder av celledød, et normalt og vanlig fenomen ble observert etter 24 timers behandling av Chir. Etter to dager med Chir behandling, hiPSCs fortsatte å skille mot en mesodermal skjebne. I forhold til ce…

Discussion

Innhenting av en stor mengde høyt rensede hiPSC-avledet cardiomyocytes er kritisk for grunnleggende hjerte forskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner. Hjerte differensiering protokoller har gjennomgått store forbedringer de siste årene, overgangen fra embryoid body-baserte metoder benytter kardiovekstfaktorer ^2, til matrise sandwich-metoder ^12, og til slutt til små molekyl-modulert og monolayer-baserte metoder ^fem. Av de nevnte protokoller, protokollen som er besk…

Materials

Name	Company	Catalog number
Matrigel (9-12 mg/mL)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Glucose free RPMI media	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (w/ insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-strep antibiotic	Invitrogen	15140122
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell lifter	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011