Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller som härrör hjärtmuskelceller (hiPSC-CMS) har blivit en viktig cellkälla att åtgärda bristen på primära kardiomyocyter som grundforskning och translationell applikationer. För att skilja hiPSCs till hjärtmuskelceller har olika protokoll inklusive embryoid kropp (EB) -baserad differentiering och tillväxtfaktor induktion utvecklats. Emellertid, dessa protokoll är ineffektiva och mycket varierande i sin förmåga att generera renade kardiomyocyter. Nyligen genomfördes en liten molekyl-baserat protokoll utnyttjar modulering av Wnt / β-catenin signalering visat att främja hjärt differentiering med hög effektivitet. Med detta protokoll, var större än 50% -60% av differentierade celler kardiellt troponin-positiva kardiomyocyter konsekvent observerats. För att ytterligare öka cardiomyocyte renhet, var de differentierade cellerna utsattes för glukos svält för att specifikt eliminera icke-kardiomyocyter baserade på den metaboliska skillnadens mellan kardiomyocyter och icke-hjärtmuskelceller. Med hjälp av denna urvalsstrategi, konsekventa resultat vi en ökning som är större än 30% i förhållandet kardiomyocyter till icke-kardiomyocyter i en population av differentierade celler. Dessa högrenade hjärtmuskelceller bör öka tillförlitligheten av resultaten från human iPSC-baserade in vitro sjukdomsmodelleringsstudier och narkotikascreeninganalyser.
Primära humana kardiomyocyter är svåra att erhålla på grund av kravet på invasiva kardiologiska biopsier, svårighet att dissociera till enstaka celler, och på grund av dålig långtidscellöverlevnad i kultur. Givet denna brist på primära humana hjärtmuskelceller, patientspecifika människa inducerade pluripotenta stamceller som härrör cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknik har betraktats som ett kraftfullt alternativ cardiomyocyte källa för grundforskning samt kliniska och translation applikationer såsom sjukdomsmodellering och narkotika upptäckt en. Tidiga insatser i differentiering pluripotenta stamceller till kardiomyocyter anställd differentieringsprotokoll som använder embryoidkroppar (EBS), men denna metod är ineffektiv i producerande cardiomyocytes eftersom det ofta mindre än 25% av cellerna i en EB är att slå cardiomyocytes 2,3. Jämförelsevis, ett monolager baserad differentiering protokollet använder cytokinerna Activin A och BMP4 visade en högre verkningsgrad än EBS, menDetta protokoll är fortfarande relativt ineffektiv, kräver dyra tillväxtfaktorer, och bara fungerar i ett begränsat antal mänskliga pluripotenta stamcellslinjer 4. Nyligen var en mycket effektiv, hiPSC monobaserad cardiomyocyte differentiering protokoll som utvecklats genom att modulera Wnt / β-catenin signalering 5. Dessa hiPSC-CM uttrycka kardiellt troponin T och alfa actinin, två sarcomeric proteiner som är standard markörer för hjärtmuskelceller 6. Protokollet beskriver här är en anpassning av denna lilla molekyl-baserade, matarcellfritt, monolager differentiering metod 5,7. Vi kan få slå cardiomyocytes från hiPSCs efter 7-10 dagar (Figur 1). Men efter en cardiomyocyte differentiering vilket resulterade i 50% slå celler, immunfärgning konsekvent visar att det finns en population av icke-hjärtmuskelceller som är negativa för cardiomyocyte specifika markörer såsom hjärtspecifika troponin T och alfa-actinin. Till further rena hjärtmuskelceller och eliminera icke-kardiomyocyter var heterogena differentierade cellpopulationer utsatt till glukos svält genom att behandla dem med en extremt låg glukosodlingsmedium för flera dagar (Figur 2). Denna behandling selektivt eliminerar icke-kardiomyocyter grund av möjligheten för hjärtmuskelceller, men inte icke-cardiomyocytes, att metabolisera laktat som primär energikälla för att överleva i en låg glukos miljö 8. Efter detta reningssteg, är en ökning av kvoten mellan kardiomyocyter till icke-hjärtmuskelceller 40% observerats, (figur 3, Figur 4) och dessa celler kan användas för nedströms genuttrycksanalys, sjukdomsmodellering, och drogscreeninganalyser.
Skaffa en stor mängd högrenade hiPSC-derived kardiomyocyter är avgörande för grundläggande hjärtforskning samt kliniska och translationapplikationer. Hjärtdifferentieringsprotokoll har genomgått enorma förbättringar under de senaste åren, övergår från embryoidkroppar kroppsbaserade metoder som utnyttjar kardiogen tillväxtfaktorer 2, till matrissandwichmetoder 12, och slutligen till små molekyl-modulerad och monolager-baserade metoder 5. Av de ovannämnda protokollen, det…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Name | Company | Catalog number |
Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
DMSO | Sigma | D-2650 |
ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
IWR1 | Sigma | I0161 |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |