Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Souches pluripotentes cardiomyocytes dérivés de cellules humaines induites (hiPSC-CMS) sont devenus une source de cellules important de remédier au manque de cardiomyocytes primaires disponibles pour les applications de recherche et de traduction de base. Pour différencier en cardiomyocytes hiPSCs, divers protocoles comprenant corps embryoïdes (EB) à base de la différenciation et de facteur de croissance induction ont été développés. Toutefois, ces protocoles sont inefficaces et très variables dans leur capacité à générer des cardiomyocytes purifiés. Récemment, un petit protocole utilisant la modulation en fonction de molécule-de la signalisation Wnt / β-caténine a été montré pour promouvoir la différenciation cardiaque avec une grande efficacité. Avec ce protocole, supérieure à 50% -60% de cellules différenciées sont des cardiomyocytes de troponine cardiaque positifs ont été observés de façon constante. Pour augmenter encore la pureté des cardiomyocytes, les cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose pour éliminer spécifiquement non cardiomyocytes en fonction de la différence métaboliques entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. En utilisant cette stratégie de sélection, nous avons constamment obtenu une augmentation de plus de 30% dans le rapport de cardiomyocytes à des non-cardiomyocytes dans une population de cellules différenciées. Ces cardiomyocytes hautement purifiés devraient améliorer la fiabilité des résultats de base iPSC humaine in vitro des études de modélisation des maladies et les essais de dépistage de drogue.
Cardiomyocytes humains primaires sont difficiles à obtenir en raison de l'obligation pour les biopsies cardiaques invasifs, de la difficulté à dissocier les cellules simples, et parce que de mauvaise survie des cellules à long terme dans la culture. Compte tenu de ce manque de cardiomyocytes humains primaires, souches pluripotentes humaines induites cardiomyocytes dérivés de cellules spécifiques au patient (hiPSC-CM) la technologie a été considérée comme une source de cardiomyocytes alternative puissante pour la recherche fondamentale ainsi que des applications cliniques et translationnelles telles que la modélisation de la maladie et de drogues une découverte. Les premiers efforts dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes employés protocoles de différenciation en utilisant des corps embryoïdes (EBS), mais cette méthode est inefficace dans les cardiomyocytes produisant parce que souvent moins de 25% des cellules dans une EB battent cardiomyocytes 2,3. Comparativement, un protocole de différenciation en fonction monocouche à l'aide des cytokines activine A et BMP4 affiche un rendement plus élevé que EBS, maisce protocole est encore relativement inefficace, nécessite des facteurs de croissance coûteux, et ne fonctionne que dans un nombre limité de lignées de cellules souches pluripotentes humaines 4. Récemment, un très efficace, le protocole de différenciation des cardiomyocytes base-monocouche hiPSC a été développé par la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine 5. Ces hiPSC-CMS exprimer troponine T cardiaque et l'alpha actinine, deux protéines sarcomériques qui sont des marqueurs standard de 6 cardiomyocytes. Le protocole décrit ici est une adaptation de cette petite base de molécule, chargeur acellulaire, la différenciation monocouche méthode 5,7. Nous sommes en mesure d'obtenir des cardiomyocytes battant hiPSCs après 7-10 jours (figure 1). Cependant, suite à une différenciation des cardiomyocytes résultant dans 50% des cellules battant, immunocoloration constante montre l'existence d'une population de non-cardiomyocytes qui sont négatives pour les marqueurs spécifiques tels que des cardiomyocytes troponine T spécifiquement cardiaque et d'alpha-actinine. Pour fucomplémen cardiomyocytes purifier et d'éliminer les non-cardiomyocytes, des populations hétérogènes de cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose en les traitant avec un milieu de culture de glucose extrêmement faible pendant plusieurs jours (figure 2). Ce traitement élimine sélectivement les non-cardiomyocytes en raison de la capacité des cardiomyocytes, mais pas non cardiomyocytes, à métaboliser le lactate comme source d'énergie primaire pour survivre dans un environnement faible taux de glucose 8. Après cette étape de purification, on observe une augmentation de 40% du rapport des cardiomyocytes de non-cardiomyocytes, (figure 3, figure 4) et ces cellules peuvent être utilisées pour aval analyse de l'expression génique, la modélisation de la maladie, et des essais de criblage de médicaments.
L'obtention d'une grande quantité de cardiomyocytes dérivés hiPSC hautement purifiée est critique pour la recherche de base cardiaque, ainsi que les applications cliniques et de la traduction. Les protocoles de différenciation cardiaque ont subi des améliorations considérables ces dernières années, les méthodes basées sur la transition de corps embryoïdes-utilisant croissance cardiogénique deux facteurs, à la matrice méthodes sandwich 12, et enfin à des méthodes basées mon…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Name | Company | Catalog number |
Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
DMSO | Sigma | D-2650 |
ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
IWR1 | Sigma | I0161 |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |