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Developmental Biology

Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Souches pluripotentes cardiomyocytes dérivés de cellules humaines induites (hiPSC-CMS) sont devenus une source de cellules important de remédier au manque de cardiomyocytes primaires disponibles pour les applications de recherche et de traduction de base. Pour différencier en cardiomyocytes hiPSCs, divers protocoles comprenant corps embryoïdes (EB) à base de la différenciation et de facteur de croissance induction ont été développés. Toutefois, ces protocoles sont inefficaces et très variables dans leur capacité à générer des cardiomyocytes purifiés. Récemment, un petit protocole utilisant la modulation en fonction de molécule-de la signalisation Wnt / β-caténine a été montré pour promouvoir la différenciation cardiaque avec une grande efficacité. Avec ce protocole, supérieure à 50% -60% de cellules différenciées sont des cardiomyocytes de troponine cardiaque positifs ont été observés de façon constante. Pour augmenter encore la pureté des cardiomyocytes, les cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose pour éliminer spécifiquement non cardiomyocytes en fonction de la différence métaboliques entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. En utilisant cette stratégie de sélection, nous avons constamment obtenu une augmentation de plus de 30% dans le rapport de cardiomyocytes à des non-cardiomyocytes dans une population de cellules différenciées. Ces cardiomyocytes hautement purifiés devraient améliorer la fiabilité des résultats de base iPSC humaine in vitro des études de modélisation des maladies et les essais de dépistage de drogue.

Introduction

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Cardiomyocytes humains primaires sont difficiles à obtenir en raison de l'obligation pour les biopsies cardiaques invasifs, de la difficulté à dissocier les cellules simples, et parce que de mauvaise survie des cellules à long terme dans la culture. Compte tenu de ce manque de cardiomyocytes humains primaires, souches pluripotentes humaines induites cardiomyocytes dérivés de cellules spécifiques au patient (hiPSC-CM) la technologie a été considérée comme une source de cardiomyocytes alternative puissante pour la recherche fondamentale ainsi que des applications cliniques et translationnelles telles que la modélisation de la maladie et de drogues une découverte. Les premiers efforts dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes employés protocoles de différenciation en utilisant des corps embryoïdes (EBS), mais cette méthode est inefficace dans les cardiomyocytes produisant parce que souvent moins de 25% des cellules dans une EB battent cardiomyocytes 2,3. Comparativement, un protocole de différenciation en fonction monocouche à l'aide des cytokines activine A et BMP4 affiche un rendement plus élevé que EBS, maisce protocole est encore relativement inefficace, nécessite des facteurs de croissance coûteux, et ne fonctionne que dans un nombre limité de lignées de cellules souches pluripotentes humaines 4. Récemment, un très efficace, le protocole de différenciation des cardiomyocytes base-monocouche hiPSC a été développé par la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine 5. Ces hiPSC-CMS exprimer troponine T cardiaque et l'alpha actinine, deux protéines sarcomériques qui sont des marqueurs standard de 6 cardiomyocytes. Le protocole décrit ici est une adaptation de cette petite base de molécule, chargeur acellulaire, la différenciation monocouche méthode 5,7. Nous sommes en mesure d'obtenir des cardiomyocytes battant hiPSCs après 7-10 jours (figure 1). Cependant, suite à une différenciation des cardiomyocytes résultant dans 50% des cellules battant, immunocoloration constante montre l'existence d'une population de non-cardiomyocytes qui sont négatives pour les marqueurs spécifiques tels que des cardiomyocytes troponine T spécifiquement cardiaque et d'alpha-actinine. Pour fucomplémen cardiomyocytes purifier et d'éliminer les non-cardiomyocytes, des populations hétérogènes de cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose en les traitant avec un milieu de culture de glucose extrêmement faible pendant plusieurs jours (figure 2). Ce traitement élimine sélectivement les non-cardiomyocytes en raison de la capacité des cardiomyocytes, mais pas non cardiomyocytes, à métaboliser le lactate comme source d'énergie primaire pour survivre dans un environnement faible taux de glucose 8. Après cette étape de purification, on observe une augmentation de 40% du rapport des cardiomyocytes de non-cardiomyocytes, (figure 3, figure 4) et ces cellules peuvent être utilisées pour aval analyse de l'expression génique, la modélisation de la maladie, et des essais de criblage de médicaments.

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Protocol

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REMARQUE: les informations fournisseur pour tous les réactifs utilisés dans ce protocole a été indiqué dans le Tableau 1 et Liste des matériaux. Toutes les solutions et équipements entrant en contact avec les cellules doivent être stériles, et la technique aseptique doit être utilisée en conséquence. Effectuer toutes les incubations de culture dans un humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, sauf indication contraire. Dans ce protocole, tous les différenciations sont réalisées dans des plaques 6 puits, dans lequel les hiPSCs sont ensemencées. Suite à la différenciation et la purification, les cellules peuvent être dissociés et réétalées pour une utilisation en aval.

1. Préparation Matières

  1. Pour le moyen E8, préparer une solution de stock pour chaque composant du milieu (NaHCO 3, l'acide L-ascorbique 2-phosphate, sélénite de sodium, de la transferrine, de l'insuline, FGF2, TGFB1) et stocker les solutions à -20 ° C. Ajouter la quantité appropriée de solutions d'achat d'actions à la bouteille de DMEM / F12 et filtrer à stériliser. La solution concentration et la configuration de réaction pour les composantes du stock et support E8 peuvent être trouvés dans le tableau 1.
  2. Pour la solution de matrice extracellulaire, décongeler la matrice de membrane basale (fournis habituellement à 10 mg / ml) à 4 ° CO / N. Matrigel est couramment utilisé pour la culture de cellules souches pluripotentes parce que les cellules souches pluripotentes humaines peuvent bien adhérer à ce produit en utilisant l'alpha-6-bêta-1 intégrine 9. Une fois décongelé, assurez 2,25 mg (250 pi) échantillons sur la glace à l'aide de glace conseils et des tubes de pipette froid et stocker les aliquotes à -80 ° C.
    1. Lorsque préenduction plaques avec ECMS, décongeler et aliquoter la solution de la matrice extracellulaire (ECMS) sur la glace. Mélanger le CEEM et du milieu DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200 sur de la glace. Gardez au frais pour éviter la solidification prématurée ECMS.
  3. Pour le RPMI / B27 sans produit de l'insuline, ajouter 10 ml de B27 Minus insuline dans 500 ml de milieu RPMI.
  4. Pour le RPMI / B27 (avec l'insuline) moyen, ajoutez 10 ml de supplément de B27 (avec insulin) et 5 ml d'antibiotique Pen-strep dans 500 ml de milieu RPMI.
  5. Pour le moyen faible taux de glucose, ajouter 10 ml de supplément de B27 et 5 ml d'antibiotique Pen-streptocoque dans 500 ml de milieu RPMI sans glucose.
  6. Pour le support / de cryoconservation de congélation, mélanger sérum bovin foetal avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) à un mélange 9: 1 rapport. Le milieu de congélation peut être stocké jusqu'à un mois à 4 ° C.
    REMARQUE: Tous les médias doivent être filtrés et stockés dans 4 ° C et utilisés dans deux semaines, sauf indication contraire. Tous les volumes de réactif / solution utilisée ci-dessous sont destinés à un seul puits dans une plaque à 6 puits, sauf indication contraire.

2. Pré-revêtement 6 puits Plaques avec ECMS

  1. Assurez ECMS en mélangeant sous-sol matrice de membrane (par exemple, Matrigel) avec les médias DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200, puis appliquer 2 ml d'ECMS fraîchement préparé dans chaque puits pour une plaque à 6 puits. Chaque puits dans une plaque à 6 puits recevra environ 90 mg ECMS.
  2. Incuber l'ECMS plaques recouvertes pendant 1 heure à 37 ° C. Immédiatement avant étalement des cellules, aspirer DMEM solution / F12 de chaque puits. Les plaques seront alors prêt à recevoir des cellules.

3. décongélation des surgelés hiPSCs

NOTE: Suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de hiPSCs dans hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel.

  1. Décongelez un flacon de hiPSCs pour chaque puits d'une plaque à 6 puits. Préparer un tube de 15 ml conique avec 9 ml de milieu E8 froid avec inhibiteur de ROCK (10 M) pour chaque flacon. inhibiteur de ROCK améliore hiPSCs survie après cryoconservation 10. Conserver les flacons dans 37 ° C bain d'eau à dégeler les cellules jusqu'à une participation d'environ 5 mm de cristaux de glace de diamètre est à gauche.
  2. Pulvériser l'extérieur des flacons de 70% d'éthanol. Essuyez les flacons avec du papier de soie avant de les déplacer à la hotte laminaire stérile.
  3. Transférer les cellules dans le tube conique préparé. Rincer til flacon une fois avec 500 ul de milieu E8 et transférer le milieu contenant les cellules décongelées dans le même tube conique. Centrifugeuse à température ambiante pendant 4 min à 200 x g.
  4. Aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension doucement le culot de cellules avec 2 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK (10 uM). Transférer les cellules remises en suspension à un puits d'une plaque à 6 puits pré-revêtu d'ECMS.
  5. Remplacez le support avec le milieu E8 sans inhibiteur de ROCK après 24 h de culture. Les cellules doivent ont adhéré à cette époque.

4. Le repiquage du hiPSCs

  1. Typiquement, hiPSCs de passage après avoir atteint 75% -80% de confluence dans une plaque à 6 puits. Aspirer le milieu de culture. Laver rapidement les puits avec 1 ml de solution stérile, RT PBS. Aspirer PBS.
    1. Ajouter 500 pi de EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x (par exemple, Accutase) et incuber pendant 1-7 min à température ambiante. Moment approprié pour EDTA incubation varie avec la ligne hiPSC. Attendez-vous à voir visibles curling or épaississement de colonies sur les bords, comme cela indique que la solution de EDTA ou de détachement cellulaire est prêt à être retiré.
  2. Aspirer la solution d'EDTA ou le détachement de la cellule. Ajouter 1 ml de milieu supplémenté avec E8 inhibiteur de ROCK 10 uM. Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas plusieurs fois et la pulvérisation de colonies avec une pipette P1000. Colonies doivent être divisées en 5-10 amas de cellules après l'achèvement.
  3. Transférer les colonies qui sont en suspension dans 1 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK dans un tube conique de 15 ml.
  4. Perturber les grands amas de cellules en petits bouquets dans le milieu E8. Ajouter un volume approprié de E8 support avec un inhibiteur de la suspension de cellules pour diluer les cellules. Le volume de support de dilution pour ajouter dépend de la densité cellulaire et le nombre de puits à ensemencer. Idéalement, un seul, 80% de confluence et de hiPSCs doit être dilué 1:12.
    1. Ajouter 11 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK aux 1 ml existants de CEll solution dans ladite 15 ml tube conique pour obtenir une dilution 1:12.
  5. En outre triturer les amas de cellules en petits fragments de cellules (environ 50 à 200 cellules dans chaque fragment est le meilleur). Évitez de trop trituration car cela réduit la survie des cellules.
  6. Aspirer ECMS des plaques pré-enduits et ajouter 2 ml de cellules remises en suspension dans chaque puits. Environ 100 000 cellules par puits d'une plaque à 6 puits est idéal. Objectif pour distribuer les cellules uniformément autour du puits afin d'éviter le regroupement des cellules dans le centre du puits.
  7. Après 24 heures de culture, remplacer le milieu avec un milieu E8 sans inhibiteur de ROCK. Changer le milieu de culture toutes les 24 heures jusqu'à ce que les cellules deviennent confluentes à 80%. Ensuite, les cellules sont prêtes à nouveau passage. Cela prend habituellement 3-6 jours entre les passages pour atteindre 80% de confluence.

5. hiPSCs de congélation

REMARQUE: suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de la hancheSC en hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel.

  1. Étiqueter tubes cryogéniques avec le nom de lignée cellulaire, type de cellule, le nombre de passages, et la date de congélation. En règle générale, utiliser un flacon pour chaque puits d'une plaque à 6 puits. Préparer un tube conique de 15 ml remplie de 9 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK (10 M). Préparer le milieu de congélation avec 90% de FBS et 10% de DMSO, et maintenir le milieu à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
  2. Aspirer le milieu de culture, ajouter 500 ul d'EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x et incuber pendant 2-7 min à température ambiante. La durée de l'exposition de la solution d'EDTA ou détachement cellulaire varie de lignée cellulaire de la lignée cellulaire.
  3. Aspirer EDTA ou une solution de détachement cellulaire. Ajouter 1 ml de milieu E8.
  4. Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas et de la pulvérisation hors des colonies avec une pipette P1000. Colonies ne doivent pas être divisés en plus petits que 100 amas de cellules. Transférer les cellules en suspension dans le tube conique préparée contenant E8. Centrifugeuse à RT pendant 4 min à 200 x g.
  5. Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de congélation froid au culot. Reprendre le culot en pipetant une à deux fois. La survie des cellules est améliorée en gardant les cellules en grandes touffes.
  6. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube cryogénique marqué. Déplacer rapidement les flacons dans un récipient contenant de l'isopropanol congélation, ce qui permettra un refroidissement progressif. Conserver le récipient avec des cellules à -80 ° C pendant 24 heures, puis de transférer les cellules à l'azote liquide pour le stockage à long terme.

6. cardiaque Différenciation des iPSC humaines

REMARQUE: Tous les médias devraient être au moins à la température ambiante lorsqu'il est ajouté.

  1. Après dissociation avec une solution d'EDTA ou 1x détachement cellulaire, ensemencer environ 100 000 iPSCs humaines sur CEEM revêtues de plaques de culture à 6 puits de différenciation (mêmes étapes que les procédures de passages des cellules). Lorsque les cellules atteignent 85% de confluence, changer de support de RPMI / B27 sans milieu de l'insuline avec 6inhibiteur de GSK3-bêta uM CHIR99021 (CHIR) et maintenir pendant 48 heures.
  2. Après 48 heures, remplacer le milieu de culture contenant avec CHIR-RPMI / B27 sans milieu de l'insuline et laisser seul pendant 24 heures (jusqu'à ce jour 3).
  3. Au jour 3, modifier le support RPMI / B27 sans insuline avec 5 uM Wnt inhibiteur IWR1 et maintenir pendant 48 heures (jusqu'à ce jour 5).
    REMARQUE: Wnt inhibition peut également être tenté d'utiliser d'autres composés à petites molécules, comme décrit dans des études antérieures 11. IWR1 a été sélectionné par rapport aux autres inhibiteurs de Wnt à petites molécules en raison de la gamme plus large dans laquelle il a été montré pour être efficace dans l'inhibition de la signalisation Wnt 11.
  4. Au jour 5, changer le milieu revenir à RPMI / B27 sans milieu de l'insuline et laisser reposer pendant 48 heures (jusqu'à ce jour 7).
  5. Au jour 7, remplacer le milieu par du milieu RPMI / B27 (à l'insuline) et remplacer milieu tous les 3 jours par la suite avec le même milieu. Battements spontanés des cardiomyocytes doit d'abord être visible à environ 8 jours à jour10.

7. Purification de cardiomyocytes humaines par la famine Glucose

  1. Au jour 10 post-différenciation, changer le milieu dans chaque puits de la plaque de 6 puits à 2 ml de milieu faible taux de glucose et de maintenir les cellules dans ce milieu pendant trois jours (jusqu'à 13 jours).
  2. Au jour 13, retourner cellules milieu RPMI / B27 (avec l'insuline).
  3. Eventuellement, Réensemencement cardiomyocytes avant le second tour de privation de glucose pour aider à déloger les non-cardiomyocytes de la plaque de culture, ce qui facilite la dissociation des non-cardiomyocytes au cours privation de glucose.
    1. Au jour 13, moyen d'aspiration, laver une fois avec du PBS, et dissocier les cellules dans des cellules individuelles en utilisant 500 ul d'enzyme de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Plus précisément, après 5 min de traitement enzymatique, en utilisant une pipette de 1000 ul de dissocier manuellement cardiomyocytes à partir de la plaque à 6 puits en tirant de façon répétée jusqu'à l'enzyme de dissociation cellulaire et la pulvérisation contre la cardiomyocyte monocouche. Jusqu'à 30 répétitions de pipetage peut être nécessaire de dissocier les cardiomyocytes dans des cellules individuelles.
    2. Après que les cellules sont dissociées et se présentent sous forme de cellules isolées, de recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml remplie de 5 ml de milieu RPMI / B27 de l'insuline à diluer à l'enzyme de dissociation des cellules et centrifugation pendant 4 min à 200 x g. Aspirer et jeter le surnageant.
    3. Re-suspendre les cellules avec un milieu RPMI 2 ml / B27 et la plaque sur une nouvelle plaque de 6 puits ECMS revêtu. Typiquement, confluence plus élevé de cardiomyocytes aide à la survie des cellules pendant les plaquant. Viser à Réensemencement 2 millions de cellules par nouveau plat à 6 puits pour la survie optimale pendant les plaquant.
  4. Au jour 14, changer le milieu revenir à 2 ml de milieu à faible glucose pour un deuxième cycle de la privation de glucose. Culture des cellules dans cet état faible taux de glucose pour trois jours de plus. La plupart des non-cardiomyocytes mourront dans cet état de la culture bas-glucose.
  5. Au jour 17, changer de support de 2 ml de RMoyenne PMI / B27 avec l'insuline. Les cellules restantes seront cardiomyocytes hautement purifiés. Ces cardiomyocytes peuvent être utilisés pour l'analyse de l'expression des gènes, le criblage de médicaments, l'analyse métabolique, et d'autres dosages en aval.

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Representative Results

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Les changements morphologiques cours de la différenciation hiPSC.

Le hiPSC cultivées dans des plaques sans cellules nourricières a grandi comme plates colonies, en deux dimensions. Après avoir atteint environ 85% de confluence, hiPSCs ont été traitées avec CHIR 6 pM pour la différenciation (figure 1A). Des quantités substantielles de la mort cellulaire, un phénomène normal et commun, ont été observés après 24 h de traitement CHIR. Après deux jours de traitement CHIR, les hiPSCs ont continué à se différencier vers une destinée mésodermique. En comparaison à des cellules en colonies hiPSC, la taille de cellule pour ces deux cellules jours augmentée. Le nombre de cellules a également augmenté par division cellulaire (figure 1B). Au jour 5, les cellules mésodermiques sont dirigés vers la lignée cardiaque (mésoderme cardiaque). A cette époque, les cellules commencent à coalescence et former des structures caractéristiques, branche-comme (Figure 1C). Au jour 10, les structures de ramifications étaient très prononcées, et les cardiomyocytes étoilesTed battant spontanément (figure 1D). Cardiomyocytes terminale différenciées ne prolifèrent delà de ce point. Une chronologie du protocole de différenciation est représenté sur la Figure 2.

Immunocoloration et cytométrie de flux résultats ont montré cardiomyocytes ont été purifiés avec privation de glucose.

Après 10 jours de différenciation, plus de 50% des zones de cellules battent. Cependant, feuilles de cellules battant parfois sont également mêlés à des non-cardiomyocytes. Pour examiner la pureté des cardiomyocytes, les cellules avec immunomarquage contre marqueur de cardiomyocytes Troponine-T (cTnT) ont été caractérisées pour constater que la plupart des cellules étaient cTnT positive. Toutefois, dans une population de cellules différenciées non purifié, un certain nombre de cellules manquait également de TnTc expression, ce qui suggère la présence de non-cardiomyocytes dans cette population différenciée au jour 13 (figure 3A). Cependant, avec privation de glucose,presque toutes les cellules restantes étaient TnTc positif à jour 13 (figure 3B), ce qui indique une purification couronnée de succès des cardiomyocytes suivant privation de glucose. Ces données ont été corroborées par cytométrie en flux analyse. Une population de cellules différenciées à jour 13 post-différenciation contenait environ 50% TNNT2 + cellules non affamé glucose (figure 4A). Une différence a également été menée en parallèle mais avec une privation de glucose de 3 jours à partir de 10 jours après différenciation. Contrairement à la différenciation unstarved, la privation de glucose conduit à une population purifiée contenant 90% + TNNT2 cellules au jour 13 (figure 4B).

Figure 1
Figure 1. Les changements morphologiques séquentielles cours de la différenciation hiPSC vers la lignée cardiaque. (A) hiPSCs indifférenciéesau jour 0 exposition colonie caractéristique morphologie et atteint environ 85% de confluence. (B) Au jour 2, les cellules après le traitement par CHIR pendant deux jours a atteint 100% de confluence et est entré dans la lignée mésodermique. (C) Au jour 5, les cellules après traitement avec IWR1 pendant 2 jours est entré dans la phase de mésoderme cardiaque. Certaines cellules ont commencé à fusionner et former morphologies de ramifications caractéristiques (indiquées par des flèches). (D) Au jour 7-10, structures de ramifications sont très évidente, et commencent spontanément cardiomyocytes battant. Bar = 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Chronologie de protocole de différenciation hiPSC-CM et le processus ultérieur de glucose de famine. Battre un cardiomyocytes re généralement abord observé à environ 7-10 jours. Deux cycles de privation de glucose se traduira par une population purifiée de cardiomyocytes par jour 17. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. immunofluorescence révèle purification de cardiomyocytes suivante privation de glucose. (A) cellules non purifié après 13 jours de différenciation ont été colorées avec Troponine T (cTnT). La plupart des cellules différenciées en cardiomyocytes ont et étaient cTnT positif, mais un certain nombre de cellules non cardiaque, TnTc négatif sont également présents. (B) En revanche, après une famine glucose de 3 jours à partir de 10 jours, la quasi-totalité des cellules survivantes étaient cTnT positif par jour 13. Barre d'échelle = 200 um.ref = cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Flux révèle cytométrie de purification de cardiomyocytes suivant privation de glucose. (A) Après 13 jours de différenciation cardiaque sans privation de glucose, une population de cellules exposées à peu près 50% TNNT2 + cardiomyocytes. Rouge indique que la population de cellules différenciées et bleu indique hiPSCs indifférenciées comme un contrôle négatif. (B) Après 10 jours de différenciation cardiaque et suivi par trois jours de privation de glucose, a été purifié une population de cellules provenant du même lot de différenciations pour contenir 90% TNNT2 + cardiomyocytes. Se il vous plaît cliquez ici pourvoir une version plus grande de cette figure.

Les compositions pour les moyennes E8
E8 Volume: 1 L Société Numéro de catalogue
DMEM / F12 avec de la glutamine et HEPES 1000 ml Invitrogen 11330-032
NaHCO 3 (7,5%, 75 mg / ml) 7,24 ml Invitrogen 25080-094
L'acide L-ascorbique-2-phosphate (64 mg / ml) 1 ml Sigma A8960
sélénite de sodium (70 pg / ml) 200 ul Sigma S5261
la transferrine (50 mg / ml) 214 pi Sigma T3705
l'insuline (4 mg / ml) 5 ml Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 ng / ul) 500 ul Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 ng / ul) 20 ul Peprotech 100-21
Les solutions d'achat d'actions pour les compositions E8
L'acide L-ascorbique-2-phosphate (64 mg / ml) 3,2 g dans 50 ml d'eau ultra pure, magasin 500 aliquotes à -20 ° C
La transferrine (50 mg / ml) 500 mg dans 10 ml d'eau ultra pure, magasin 107 aliquotes à -20 ° C
sélénite de sodium (70 pg / ml) Sélénite de sodium à 35 mg dans 500 ml d'eau ultra pure, magasin 100 aliquotes à -20 ° C
FGF2 (200 ng / ul) 1 mg dans 5 ml D- froidePBS, magasin 250 aliquotes à -20 ° C
TGFB1 (100 ng / ul) 100 ug dans 1 ml froide d'acide citrique 10 mM, pH 3, de stocker des aliquotes de 10 ul à -20 ° C

Tableau 1. Composition des E8 moyenne.

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Discussion

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L'obtention d'une grande quantité de cardiomyocytes dérivés hiPSC hautement purifiée est critique pour la recherche de base cardiaque, ainsi que les applications cliniques et de la traduction. Les protocoles de différenciation cardiaque ont subi des améliorations considérables ces dernières années, les méthodes basées sur la transition de corps embryoïdes-utilisant croissance cardiogénique deux facteurs, à la matrice méthodes sandwich 12, et enfin à des méthodes basées monocouche petites molécules modulé et 5. Parmi les protocoles mentionnés ci-dessus, le protocole décrit ici apparaît la plus haute efficacité et la plus reproductible de la différenciation cardiaque pour différentes lignées cellulaires de hiPSC en modulant la signalisation Wnt / β-caténine en utilisant des petites molécules CHIR IWR et 5,7. Plus précisément, les hiPSCs indifférenciées ont été amenées à subir une différenciation mésodermique avec le GSK3-bêta inhibiteur CHIR et différenciation cardiaque subséquente avec l'inhibiteur de signalisation Wnt IWR1. Ces étapes séquentielles consistant àModulation de la signalisation Wnt, aidé par l'insuline épuisement pendant la phase cardiaque lignée d'induction, a conduit à la différenciation cardiaque très efficace. CHIR est un inhibiteur molécule GSK3-bêta petite couramment utilisé pour l'induction mésodermique, mais d'autres petites molécules pour l'inhibition de GSK3-bêta ont été testés dans des protocoles de différenciation des cardiomyocytes 11. Plusieurs options sont également utilisés pour la petite molécule inhibiteur de Wnt ultérieure. Par exemple, une publication récente mise au point sur ​​la différenciation chimiquement défini de cellules souches pluripotentes de cardiomyocytes utilise 2 uM Wnt-C59 Wnt efficace pour l'inhibition et le mésoderme cardiaque induction 11.

En outre, les cardiomyocytes différenciés avec un procédé de privation de glucose ont été davantage purifié, qui tire parti de la glucose métabolique distinct écoulement existant entre les cardiomyocytes et des non-cardiomyocytes 8. Il est essentiel de noter que l'efficacité de la méthode à la glucose de famine est Densité-dépendant (ce est à dire, des différenciations qui ont donné des pourcentages plus élevés de cardiomyocytes sont plus susceptibles d'atteindre une plus grande survie des cardiomyocytes). Cependant, la transition vers le milieu de glucose faible est également une condition stressante pour les cardiomyocytes. Il est important de changer les cellules revenir à la régulière RPMI / B27 avec le milieu de l'insuline après 3 jours de privation de glucose. Dans ce protocole, un système de croissance sans chargeur-a été utilisé, dans lequel les cellules souches pluripotentes ne ont pas été cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris alimentation (MEF). Cependant, les protocoles de différenciation cardiaques antérieures ont utilisé des systèmes à base de desserte pour produire des cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes 5. De même, les protocoles précédents ont également utilisé moyen mTeSR1 pour l'entretien de cellules souches, mais le système de support et d'une connexion de liaison de E8 utilisé ici est supérieur en raison de sa simplicité et l'absence d'excès composants xénogéniques telles que l'albumine de sérum bovin et des fibroblastes embryonnaires de souris.

Actuellement,la différenciation des cellules souches pluripotentes vers lignées de cardiomyocytes est largement robuste, mais souffre encore de la variabilité hiPSC ligne à ligne en termes d'efficacité. Cela reste un problème majeur dans le domaine de la différenciation cardiaque et nécessitera une étude plus approfondie. L'efficacité de différenciation est améliorée par un bon entretien de lignes hiPSC, et en particulier, la prévention overconfluency lors de l'entretien hiPSC. Variabilité supplémentaire découle de l'ensemencement des cellules pendant le processus de repiquage, en tant que monocouche uniformément ensemencé de hiPSCs a tendance à donner lieu à des différenciations globaux les meilleurs. Ici, un ECMS à base de Matrigel souris dérivés pour l'ensemencement des cellules pendant la culture cellulaire a été utilisé avec succès, mais une transition éventuelle à Xeno-libres substrats est recommandée. En ce qui concerne l'ensemencement des cellules sur ECMS, l'ensemencement inégale se traduit souvent par une répartition inégale des cardiomyocytes dans un bien particulier. Par exemple, si hiPSCs sont ensemencées de façon inégale, les bords d'un puits dans une plaque à six puits peuvent donner lieu à higses numéros de cardiomyocytes que le centre du puits. Ces conditions d'ensemencement inégales peuvent donner lieu à des différenciations à faible rendement et un plus grand nombre de non-cardiomyocytes dérivés mésodermiques comme les fibroblastes et les cellules musculaires lisses. Nous avons également observé que les différenciations faible efficacité (moins de 50%) sont beaucoup plus difficiles à purifier en utilisant le processus de privation de glucose mentionnés ici. Un autre effet secondaire à long terme du glucose famine est une perte potentielle de cardiomyocytes viabilité. Bien que les cardiomyocytes sont capables de métaboliser le lactate en l'absence de glucose, nous constatons que ce commutateur à un environnement à faible glucose est stressant pour les cellules. Les cellules peuvent cesser spontanément battre, et une certaine perte de cellules peuvent être respecté si privation de glucose est prolongée au-delà du temps recommandé. Cette sensibilité accrue à la privation de glucose peut être le reflet de l'immaturité de développement, fonctionnel et électrophysiologique bien établie de la tige cardiomyocy dérivé des cellulestes par rapport à la vraie adultes cardiomyocytes 13.

En résumé, le protocole décrit ici combine le petit hiPSC monocouche méthode de différenciation cardiaque à base de molécule-glucose avec un procédé de purification de la famine cardiomyocytes. Ce protocole permet la génération reproductible de cardiomyocytes hautement purifiée et devrait faciliter divers dosages aval pertinentes à la modélisation des maladies cardiovasculaires et de dépistage de drogue.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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