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Developmental Biology

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Umane staminali pluripotenti indotte cellule derivate cardiomiociti (hiPSC-CMS) sono diventati una fonte di cellule importante per ovviare alla mancanza di cardiomiociti primari disponibili per applicazioni di ricerca e traslazionale di base. Per differenziare hiPSCs in cardiomiociti, sono stati sviluppati diversi protocolli tra cui corpo embrioide (EB) differenziazione basata e induzione fattore di crescita. Tuttavia, questi protocolli sono inefficienti e altamente variabili nella loro capacità di generare cardiomiociti purificati. Recentemente, una piccola molecola di base protocollo utilizzando la modulazione di Wnt / β-catenina ha mostrato di promuovere la differenziazione cardiaca con alta efficienza. Con questo protocollo, superiore al 50% -60% delle cellule differenziate erano cardiomiociti troponina-positivi cardiaca sono stati costantemente osservati. Per aumentare ulteriormente la purezza dei cardiomiociti, cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia eliminare specificamente non cardiomiociti basato sulla differenza metabolicas tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Usando questa strategia di selezione, abbiamo costantemente ottenuto un aumento superiore al 30% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti in una popolazione di cellule differenziate. Questi cardiomiociti altamente purificati dovrebbero migliorare l'affidabilità dei risultati di umana iPSC-based in studi di modellazione della malattia in vitro e test di screening di stupefacenti.

Introduction

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Cardiomiociti umani primari sono difficili da ottenere a causa della necessità di biopsie cardiache invasive, difficoltà di dissociare di singole cellule, ed a causa della scarsa sopravvivenza cellulare a lungo termine in cultura. Data questa mancanza di cardiomiociti umani primari, umano indotto staminali pluripotenti cardiomiociti derivato dalle cellule specifiche del paziente tecnologia (hiPSC-CM) è stata considerata come una potente fonte cardiomiociti alternativa per la ricerca di base e applicazioni cliniche e traslazionali come la modellazione della malattia e della droga discovery 1. I primi sforzi di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cardiomiociti impiegati protocolli di differenziamento utilizzando corpi embrionali (EBS), ma questo metodo è inefficiente in cardiomiociti producono perché spesso meno del 25% delle cellule in un EB sono battendo cardiomiociti 2,3. Comparativamente, un protocollo di differenziazione basata monostrato-utilizzando le citochine activina A e BMP4 visualizzato un rendimento superiore EBs, maquesto protocollo è ancora relativamente inefficiente, fattori di crescita richiede costosi, e funziona solo in un numero limitato di pluripotenti umana linee di cellule staminali 4. Recentemente, una, con sede a monostrato hiPSC protocollo di differenziazione dei cardiomiociti altamente efficiente è stato sviluppato attraverso la modulazione di segnalazione Wnt / β-catenina 5. Questi hiPSC-CM esprimere e alfa actinina due proteine ​​sarcomeriche che sono marcatori standard di cardiomiociti 6 troponina cardiaca T,. Il protocollo descrivere qui è un adattamento di questo piccolo basato molecola, alimentatore libera cellulare, differenziamento monostrato metodo 5,7. Siamo in grado di ottenere battendo cardiomiociti da hiPSCs dopo 7-10 giorni (Figura 1). Tuttavia, a seguito di una differenziazione cardiomiociti conseguente 50% battendo cellule, immunocolorazione costantemente dimostra l'esistenza di una popolazione di non-cardiomiociti che sono negativi per i marcatori specifici cardiomiociti come alfa-actinina e specifico cardiaco troponina-T. Per further purificare cardiomiociti ed eliminare non cardiomiociti, popolazioni eterogenee di cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia trattandoli con un mezzo estremamente bassa coltura glucosio per più giorni (Figura 2). Questo trattamento elimina selettivamente non cardiomiociti dovuta alla capacità dei cardiomiociti, ma non non-cardiomiociti, a metabolizzare lattato come fonte di energia primaria per sopravvivere in un ambiente a bassa glucosio 8. Dopo questa fase di purificazione, un aumento del 40% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti si osserva, (Figura 3, Figura 4) e queste cellule può essere utilizzato per downstream analisi di espressione genica, modelli di malattia, e saggi di screening di stupefacenti.

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Protocol

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NOTA: le informazioni del fornitore per tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo è quotata nella tabella 1 e Elenco dei materiali. Tutte le soluzioni e le attrezzature che entrano in contatto con le cellule devono essere sterili, e la tecnica asettica devono essere utilizzati di conseguenza. Eseguire tutte le incubazioni cultura in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore se non diversamente specificato. In questo protocollo, tutti differenziazioni sono eseguite in 6 pozzetti, in cui i hiPSCs sono teste di serie. A seguito di differenziazione e di purificazione, le cellule possono essere dissociati e ripiastrate per uso a valle.

1. Media Preparazione

  1. Per il mezzo E8, ottenere una soluzione stock per ogni componente medio (NaHCO3, acido L-ascorbico 2-fosfato, sodio selenite, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e memorizzare le soluzioni a -20 ° C. Aggiungere la quantità appropriata di soluzioni madre alla bottiglia di DMEM / F12 e filtrare per sterilizzare. La Conc soluzionezione e la configurazione di reazione per i componenti di magazzino e E8 medio si trovano nella tabella 1.
  2. Per la soluzione di matrice extracellulare, scongelare la matrice membrana basale (comunemente in dotazione a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel è comunemente utilizzato per la coltura di cellule staminali pluripotenti in quanto le cellule staminali umane pluripotenti possono aderire bene a questo materiale con l'alfa-6-beta-1 integrina 9. Una volta scongelato, fanno 2,25 mg (250 ml) di aliquote sul ghiaccio con ghiaccio puntali freddo e tubi e memorizzare le aliquote a -80 ° C.
    1. Quando precoating piatti con ECMS, scongelare e aliquote della soluzione di matrice extracellulare (ECMS) su ghiaccio. Mescolare il ECMS e medio DMEM / F12 ghiacciata in un rapporto di 1: 200 in ghiaccio. Conservare in luogo fresco per evitare premature ECMS solidificazione.
  3. Per la RPMI / B27 senza prodotto insulina, aggiungere 10 ml di B27 Minus insulina in 500 ml di media RPMI.
  4. Per la RPMI / B27 (con insulina) medio, aggiungere 10 ml di B27 Supplement (con insulin) e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di mezzi RPMI.
  5. Per il medio di glucosio basso, aggiungere 10 ml di B27 supplemento e 5 ml di antibiotico Pen-strep in 500 ml di media RPMI senza glucosio.
  6. Per il medio / crioconservazione congelamento, miscela di siero fetale bovino con dimetilsolfossido (DMSO) in un rapporto di 9: 1. Il mezzo di congelamento può essere conservato fino a 1 mese a 4 ° C.
    NOTA: Tutti i supporti devono essere filtrati e conservati a 4 ° C ed utilizzati entro 2 settimane se non diversamente specificato. Tutti i volumi di reagente / soluzione utilizzata di seguito sono destinati ad un singolo bene in un 6-pozzetti, se non diversamente specificato.

2. Pre-rivestimento 6 pozzetti con ECMS

  1. Effettuare ECMS mescolando matrice della membrana basale (ad esempio, Matrigel) con ghiaccio freddo DMEM / F12 media in un rapporto di 1: 200, quindi applicare 2 ml di fresco ECMS a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Ogni bene in un 6-pozzetti riceveranno circa 90 mg ECMS.
  2. Incubare la ECMS rivestito piastre per 1 ora a 37 ° C. Immediatamente prima placcatura cellule, aspirare DMEM soluzione / F12 da ciascun pozzetto. Le piastre saranno quindi pronto a ricevere cellule.

3. scongelamento le hiPSCs congelati

NOTA: Strettamente seguire questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di hiPSCs in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento.

  1. Scongelare una fiala di hiPSCs per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml con 9 ml di freddo media E8 con inibitore di ROCK (10 micron) per ogni flacone. Inibitore ROCK migliora hiPSCs sopravvivenza dopo crioconservazione 10. Tenere i flaconcini di 37 ° C a bagnomaria scongelare le cellule fino a un cristallo di ghiaccio del diametro di circa 5 mm è lasciato.
  2. Spruzzare l'esterno dei flaconcini con il 70% di etanolo. Pulire le fiale con la carta velina prima di passare alla cappa laminare sterile.
  3. Trasferire le cellule nel tubo conico preparato. Risciacquare tegli fiala una volta con 500 ml di E8 medio e trasferire il mezzo contenente le cellule scongelate allo stesso tubo conico. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g.
  4. Aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare con 2 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Trasferire le cellule risospese ad un pozzetto di un 6-pozzetti pre-rivestito con ECMS.
  5. Sostituire il mezzo con E8 medio senza inibitore ROCK dopo 24 ore di coltura. Le cellule dovrebbero hanno aderito entro tale data.

4. Passaging di hiPSCs

  1. Tipicamente, hiPSCs passaggio dopo aver raggiunto il 75% -80% di confluenza in un 6-pozzetti. Aspirare il terreno di coltura. Lavare rapidamente i pozzetti con 1 ml di sterile, RT PBS. Aspirare PBS.
    1. Aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x (ad esempio, Accutase) e incubare per 1-7 minuti a temperatura ambiente. Momento opportuno per EDTA incubazione varia con la linea hiPSC. Aspettiamo di vedere visibile il curling or ispessimento delle colonie intorno ai bordi, in modo da indicare che EDTA o distacco cellulare soluzione è pronto per essere rimosso.
  2. Aspirare il EDTA o la soluzione di distacco cellulare. Aggiungere 1 ml di E8 media integrato con inibitore ROCK 10 micron. Spostare colonie hiPSC nel pozzo ripetutamente pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie dovrebbero essere suddivisi in 5-10 grumi di cellule dopo il completamento.
  3. Trasferire le colonie che sono sospesi in 1 ml di terreno con E8 inibitore ROCK in una provetta conica da 15 ml.
  4. Interrompere i grandi grumi di cellule in piccoli grumi nel medio E8. Aggiungere un volume appropriato di E8 media con inibitore alla sospensione cellulare per diluire le cellule. Il volume del supporto da aggiungere per diluizione dipende dalla densità delle cellule e il numero di pozzetti per essere seminati. Idealmente, una sola, l'80% confluenti e dei hiPSCs deve essere diluito 1:12.
    1. Aggiungere 11 ml E8 media con inibitore ROCK agli attuali 1 ml di cell soluzione citata in tubo da 15 ml per ottenere una diluizione 1:12.
  5. Inoltre triturare i grumi di cellule in frammenti a piccole cellule (circa 50-200 cellule in ogni frammento è meglio). Evitare over-triturazione in quanto riduce la sopravvivenza delle cellule.
  6. Aspirare ECMS dalle piastre pre-rivestito e aggiungere 2 ml di cellule risospese in ogni pozzetto. Circa 100.000 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti è l'ideale. Obiettivo per erogare le celle uniformemente intorno bene evitare raggruppamento delle cellule al centro del pozzo.
  7. Dopo 24 ore di coltura, sostituire il supporto con E8 medio senza inibitore ROCK. Modificare il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le cellule diventano 80% confluenti. Poi, le cellule sono ancora pronti per passaggio. Di solito ci vogliono 3-6 giorni tra i passaggi per raggiungere l'80% di confluenza.

5. hiPSCs congelamento

NOTA: seguire da vicino questa procedura in quanto può portare a coltura ottimale e differenziazione a valle di HIPSC in hiPSC-CM seguendo il ciclo di congelamento / scongelamento.

  1. Etichettare tubi criogenici con il nome di linea cellulare, tipo cellulare, il numero di passaggio, e la data di congelamento. Come regola generale, utilizzare un flacone per ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Preparare un tubo da 15 ml riempita con 9 ml di E8 media con inibitore ROCK (10 micron). Preparare congelamento media con 90% FBS e 10% DMSO, e mantenere il mezzo a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Aspirare il terreno di coltura, aggiungere 500 ml di EDTA 0,5 mm o soluzione il distacco delle cellule 1x e incubare per 2-7 minuti a temperatura ambiente. La durata dell'esposizione EDTA o distacco cellulare soluzione varia da linea cellulare di linea cellulare.
  3. Aspirare EDTA o soluzione il distacco delle cellule. Aggiungere 1 ml di mezzo E8.
  4. Spostare colonie hiPSC nel bene pipettando su e giù e spruzzare colonie con una pipetta P1000. Le colonie non dovrebbero essere suddivisi in più piccola di 100 grumi di cellule. Trasferire le cellule in sospensione per il tubo conico preparato contenente E8. Centrifugare a RT per 4 min a 200 x g.
  5. Aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di medio congelamento freddo al pellet. Risospendere il pellet pipettando una o due volte. La sopravvivenza cellulare è migliorata mantenendo le cellule in grandi ciuffi.
  6. Trasferire le cellule risospese in una provetta criogenica etichetta. Spostare rapidamente le fiale in un contenitore congelamento contenente isopropanolo, che consentirà di raffreddamento graduale. Mantenere il contenitore con le cellule a -80 ° C per 24 ore, quindi trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

6. cardiaca Differenziazione delle iPSC umano

NOTA: Tutti i media dovrebbero essere almeno a RT quando aggiunto.

  1. Dopo dissociazione con la soluzione di distacco EDTA o 1x cella, circa 100.000 sementi iPSCs umani sulla ECMS rivestiti piastre di coltura 6 pozzetti per la differenziazione (stessa procedura procedure Passaging cellulare). Quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza supporto di insulina con 6mcM inibitore GSK3-beta CHIR99021 (CHIR) e mantenere per 48 ore.
  2. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo di coltura contenente CHIR con RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciano in pace per 24 ore (fino al giorno 3).
  3. Al giorno 3, cambiare il supporto di RPMI / B27 senza insulina con 5 micron Wnt inibitore IWR1 e mantenere per 48 ore (fino al giorno 5).
    NOTA: Wnt inibizione può anche essere condotta usando altri piccoli composti molecola, come descritto in studi precedenti 11. IWR1 stato selezionato sopra altri inibitori piccole molecole Wnt causa della maggiore gamma in cui è stato dimostrato per essere efficace nell'inibire Wnt segnalazione 11.
  4. Al giorno 5, cambiare il supporto posteriore per RPMI / B27 senza supporto di insulina e lasciar riposare per 48 ore (fino al giorno 7).
  5. Al giorno 7, sostituire il mezzo con RPMI / B27 medio (con insulina) e sostituire medio ogni 3 giorni dopo con lo stesso mezzo. Battito spontaneo dei cardiomiociti dovrebbe in primo luogo essere visibile a circa giorno 8 al giorno10.

7. Purificazione di cardiomiociti umani per fame di glucosio

  1. Al giorno 10 post-differenziazione, cambiare il mezzo in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti a 2 ml di mezzo glucosio basso e mantenere le cellule in questo mezzo per 3 giorni (fino al giorno 13).
  2. Al giorno 13, ritorno alle cellule di RPMI / B27 medio (con insulina).
  3. Facoltativamente, replate cardiomiociti prima della seconda tornata di fame di glucosio per contribuire ad allentare i non cardiomiociti dalla piastra di coltura, che facilitano la dissociazione dei non cardiomiociti durante il digiuno del glucosio.
    1. Al giorno 13, media aspirare, lavare una volta con PBS, e dissociare le cellule in cellule singole con 500 ml di dissociazione cellulare dell'enzima per 5 minuti a 37 ° C. In particolare, dopo 5 minuti di trattamento enzimatico, utilizzare una pipetta 1.000 microlitri dissociare manualmente cardiomiociti dal 6 pozzetti ripetutamente tirando l'enzima dissociazione cellulare e spruzzare contro il cardiomyocyte monostrato. Fino a 30 ripetizioni pipettaggio può essere richiesto di dissociare i cardiomiociti in singole cellule.
    2. Dopo che le cellule sono dissociate e sono in forma di singola cellula, raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 ml riempito con 5 ml di RPMI / B27 medio con insulina per diluire l'enzima dissociazione cellulare e centrifugare per 4 min a 200 x g. Aspirare e scartare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule con 2 ml RPMI / B27 media e la piastra su un nuovo ECMS rivestita 6 pozzetti. In genere, maggiore confluenza di cardiomiociti aiuta con la sopravvivenza delle cellule durante replating. Obiettivo di replate 2 milioni di cellule per piatto nuovo 6-bene per la sopravvivenza ottimale durante replating.
  4. Al giorno 14, cambiare il supporto posteriore a 2 ml di terreno di glucosio basso per un secondo ciclo di deprivazione di glucosio. Coltivare le cellule in questo stato di glucosio basso per altri 3 giorni. La maggior parte dei non-cardiomiociti moriranno in questa condizione cultura low-glucosio.
  5. Al giorno 17, cambiare il supporto di 2 ml di RPMI / B27 media con insulina. Le cellule rimanenti saranno cardiomiociti altamente purificati. Questi cardiomiociti possono essere utilizzate per l'analisi di espressione genica, screening di farmaci, analisi metabolica, e vari altri saggi a valle.

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Representative Results

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I cambiamenti morfologici durante hiPSC differenziazione.

Il hiPSC coltivate in lastre senza alimentatore è cresciuto come piatti, colonie bidimensionali. Dopo aver raggiunto circa l'85% di confluenza, hiPSCs sono stati trattati con 6 micron CHIR per la differenziazione (Figura 1A). Notevoli quantità di morte cellulare, un fenomeno normale e comune, sono stati osservati dopo 24 ore di trattamento CHIR. Dopo due giorni di trattamento CHIR, i hiPSCs continuato a differenziarsi verso un destino mesoderma. In confronto alle cellule in colonie hiPSC, dimensioni della cella per questi 2 celle al giorno è aumentato. Numero delle cellule è aumentato anche attraverso la divisione cellulare (Figura 1B). Al giorno 5, le cellule mesodermiche erano diretti verso il lignaggio cardiaca (mesoderma cardiaca). In questo momento, le cellule iniziano a coalescenza e formando caratteristici strutture ramificate (Figura 1C). Al giorno 10, le strutture ramificate erano molto pronunciati, e cardiomiociti stellated spontaneamente battendo (Figura 1D). Cardiomiociti Terminally dissociati non proliferano oltre questo punto. Una cronologia del protocollo differenziazione è mostrato in Figura 2.

Immunostaining e citometria a flusso risultati hanno mostrato cardiomiociti sono stati purificati con fame di glucosio.

Dopo 10 giorni di differenziazione, oltre il 50% delle aree cellulari stanno battendo. Tuttavia, battendo i fogli di cellule a volte sono anche mescolati con i non-cardiomiociti. Per esaminare cardiomiociti purezza, le cellule con immunostaining contro pennarello cardiomiociti cardiaca Troponina-T (cTnT) sono stati caratterizzati per scoprire che la maggior parte delle cellule erano cTnT positive. Tuttavia, in una popolazione di cellule differenziate non purificata, un numero di cellule mancava anche espressione di cTnT, suggerendo la presenza di non cardiomiociti in questa popolazione differenziata al giorno 13 (Figura 3A). Tuttavia, con la fame di glucosio,quasi tutte le cellule rimanenti erano cTnT positiva per giorno 13 (figura 3B), che indica il successo purificazione dei cardiomiociti seguenti fame di glucosio. Questi dati sono stati ulteriormente confermati mediante citometria a flusso. Una popolazione di cellule differenziate a giorno 13 post-differenziazione conteneva circa 50% TNNT2 + cellule quando non glucosio fame (Figura 4A). Una differenziazione Parallelamente è stato condotto anche, ma con una privazione di glucosio tre giorni con inizio alle 10 giorno dopo la differenziazione. In contrasto con la differenziazione unstarved, deprivazione di glucosio ha portato ad una popolazione purificata contenente TNNT2 + cellule 90% al giorno 13 (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1. Le sequenziali cambiamenti morfologici durante hiPSC differenziamento verso la linea cardiaca. (A) hiPSCs indifferenziatial giorno 0 mostra tipica morfologia delle colonie e ha raggiunto circa l'85% di confluenza. (B) al giorno 2, le cellule dopo il trattamento con CHIR per due giorni ha raggiunto il 100% di confluenza ed è entrato il lignaggio mesodermico. (C) Al giorno 5, le cellule dopo trattamento con IWR1 per 2 giorni è entrato nella fase mesoderma cardiaco. Alcune cellule hanno cominciato a fondersi e formare caratteristiche morfologie ramo simile (indicati dalle frecce). (D) Al giorno 7-10, strutture ramificate sono altamente evidenti, e cardiomiociti start spontaneamente battere. Bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Timeline di protocollo differenziazione hiPSC-CM e successivo processo di fame di glucosio. Battere cardiomiociti a ri tipicamente prima osservato in circa 7-10 giorni. Due giri di fame di glucosio si tradurrà in una popolazione purificata di cardiomiociti di giorno 17. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. immunofluorescenza rivela la purificazione dei cardiomiociti dopo fame di glucosio. (A), le cellule non depurato dopo 13 giorni di differenziazione sono state colorate con Troponina T (cTnT). La maggior parte delle cellule sono differenziate in cardiomiociti e sono stati cTnT positivo, ma un certo numero di cellule non-cardiaca, cTnT-negativo sono anche presenti. (B) Al contrario, dopo un inedia glucosio 3 giorni iniziando il giorno 10, quasi tutte le cellule sopravvissute erano cTnT positive per giorno 13. Scale bar = 200 micron.ref = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Flusso rivela citometria depurazione dei cardiomiociti dopo fame di glucosio. (A) Dopo 13 giorni di differenziazione cardiaca senza fame di glucosio, una popolazione di cellule esposte circa il 50% TNNT2 + cardiomiociti. Il rosso indica la popolazione di cellule differenziate e blu indica hiPSCs indifferenziate come controllo negativo. (B) Dopo 10 giorni di differenziazione cardiaca e seguito da 3 giorni di digiuno del glucosio, una popolazione di cellule dello stesso lotto di differenziazioni è stato purificato per contenere il 90% TNNT2 + cardiomiociti. Clicca qui pervedere una versione più grande di questa figura.

Le composizioni per E8 medio
E8 Volume: 1 L Azienda Numero di catalogo
DMEM / F12 con glutammina e HEPES 1.000 ml Invitrogen 11330-032
NaHCO 3 (7,5%, 75 mg / ml) 7.24 ml Invitrogen 25080-094
L'acido L-ascorbico 2-fosfato (64 mg / ml) 1 ml Sigma A8960
selenito di sodio (70 mg / ml) 200 ml Sigma S5261
transferrina (50 mg / ml) 214 ml Sigma T3705
insulina (4 mg / ml) 5 ml Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 ng / ml) 500 microlitri Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 ng / ml) 20 l Peprotech 100-21
Le soluzioni di riserva per composizioni E8
L-ascorbico acido-2-fosfato (64 mg / ml) 3,2 g in 50 ml di acqua ultrapura, negozio di 500 aliquote microlitri a -20 ° C
Transferrina (50 mg / ml) 500 mg in 10 ml di acqua ultrapura, negozio di 107 aliquote microlitri a -20 ° C
Selenito di sodio (70 mg / ml) 35 mg di sodio selenite in 500 ml di acqua ultrapura, negozio di aliquote di 100 microlitri a -20 ° C
FGF2 (200 ng / ml) 1 mg in 5 ml D- freddoPBS, negozio di 250 aliquote microlitri a -20 ° C
TGFB1 (100 ng / ml) 100 mg in 1 ml fredda di acido citrico 10 mM, pH 3, magazzini 10 aliquote microlitri a -20 ° C

Tabella 1. Composizione del E8 Medium.

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Discussion

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Ottenere una grande quantità di cardiomiociti hiPSC derivato altamente purificate è critica per la ricerca cardiaca base e applicazioni cliniche e traslazionali. Protocolli differenziazione cardiaca hanno subito enormi miglioramenti negli ultimi anni, la transizione dai metodi basati corpo embrioidi utilizzano fattori di crescita cardiogeno 2, alla matrice metodi a sandwich 12, e infine a piccole metodi basati monostrato molecola-modulato e 5. Tra i protocolli di cui sopra, il protocollo qui descritto visualizzata la più alta e la più riproducibili efficienza differenziazione cardiaca per diverse linee cellulari hiPSC modulando Wnt segnalazione / β-catenina con le piccole molecole Chir e IWR 5,7. In particolare, i hiPSCs indifferenziati sono stati indotti a sottoporsi differenziazione mesoderma con l'inibitore CHIR GSK3-beta e successiva differenziazione cardiaca con l'inibitore Wnt segnalazione IWR1. Questi passaggi sequenziali diModulazione di segnalazione Wnt, aiutato da insulina esaurimento durante la fase di induzione stirpe cardiaco, provocato altamente efficiente differenziamento cardiaco. CHIR è un inibitore comune molecola di GSK3-beta piccola utilizzata per l'induzione del mesoderma, ma altre piccole molecole per GSK3-beta inibizione sono stati testati in protocolli di differenziazione dei cardiomiociti 11. Opzioni multiple sono utilizzate anche per la piccola molecola inibitore Wnt successiva. Ad esempio, una recente pubblicazione incentrata sulla differenziazione chimicamente definita di cellule staminali pluripotenti da cardiomiociti utilizza 2 micron Wnt-C59 per l'inibizione Wnt efficace e mesoderma cardiaco induzione 11.

Inoltre, i cardiomiociti differenziati con un metodo inedia glucosio erano ulteriormente purificati, che sfrutta il metabolismo del glucosio distinta flusso esistente tra cardiomiociti e non cardiomiociti 8. È essenziale notare che l'efficacia del metodo inedia glucosio è Densità-dipendente (cioè, differenziazioni che hanno prodotto le percentuali più elevate di cardiomiociti hanno più probabilità di ottenere una maggiore sopravvivenza dei cardiomiociti). Tuttavia, la transizione al mezzo di glucosio basso è anche una condizione stressante per i cardiomiociti. E 'importante cambiare le cellule di nuovo al normale RPMI / B27 con media di insulina dopo 3 giorni di digiuno del glucosio. In questo protocollo, un sistema di crescita senza alimentatore è stato utilizzato, in cui le cellule staminali pluripotenti non sono state coltivate su fibroblasti embrionali di topo alimentatore (MEF). Tuttavia, i protocolli di differenziazione cardiaci precedenti hanno utilizzato sistemi basati alimentazione a produrre cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti 5. Analogamente, protocolli precedenti hanno utilizzato anche mTeSR1 mezzo per la manutenzione di cellule staminali, ma il sistema di supporto e senza alimentatore E8 utilizzato qui è superiore a causa della sua semplicità e mancanza di componenti xenogeniche eccesso come albumina di siero bovino e fibroblasti embrionali di topo.

Attualmente,pluripotenti differenziazione delle cellule staminali verso lignaggi cardiomiociti è in gran parte resistente, ma soffre ancora di hiPSC variabilità linea-per-linea in termini di efficienza. Questo rimane un problema importante nel settore differenziamento cardiaco e richiederà ulteriori studi. L'efficienza differenziazione è migliorata da una corretta manutenzione delle linee hiPSC, in particolare, impedendo overconfluency durante la manutenzione hiPSC. Ulteriori variabilità deriva dalla semina cellulare durante il processo passaging, come monostrato uniformemente seminato di hiPSCs tende a provocare le migliori differenziazioni complessivi. Qui, un mouse-derivati, ECMS basati Matrigel per la semina delle cellule durante la coltura cellulare è stato utilizzato con successo, ma un eventuale passaggio alla Xeno-liberi substrati è raccomandato. Per quanto riguarda la semina delle cellule su ECMS, semina irregolare si traduce spesso in distribuzione irregolare dei cardiomiociti all'interno di un particolare bene. Ad esempio, se hiPSCs vengono seminate in modo non uniforme, i bordi di un pozzo in un piatto di sei pozzetti possono dar luogo a higil suo numero di cardiomiociti rispetto al centro del pozzo. Queste condizioni di semina irregolari possono dar luogo a differenziazioni a bassa efficienza e un maggior numero di non-cardiomiociti, derivati ​​mesodermiche come i fibroblasti e cellule muscolari lisce. Abbiamo anche osservato che le differenziazioni a bassa efficienza (inferiori al 50%) sono molto più difficili per purificare con il processo di deprivazione di glucosio menzionato qui. Un altro effetto collaterale di fame di glucosio a lungo termine è una potenziale perdita di redditività dei cardiomiociti. Sebbene i cardiomiociti sono in grado di metabolizzare lattato in assenza di glucosio, troviamo che questo interruttore ad un ambiente a basso glucosio è stressante per le cellule. Le cellule possono smettere di battere spontaneamente, e una certa perdita di cellule possono essere rispettato se la fame di glucosio si prolunga oltre il tempo consigliato. Questa maggiore sensibilità alla deprivazione di glucosio può essere riflettente della immaturità di sviluppo, funzionale, e elettrofisiologico consolidata di staminali cardiomyocy cellule derivateTES in confronto al vero adulto cardiomiociti 13.

In sintesi, il protocollo qui descritto combina il piccolo, hiPSC monostrato metodo differenziazione cardiaca basato molecola con un metodo di fame di glucosio cardiomiociti-purificante. Questo protocollo consente la generazione di cardiomiociti riproducibile altamente purificati e dovrebbe facilitare vari saggi a valle pertinenti alla modellazione malattie cardiovascolari e screening di farmaci.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, (6), 150 (2013).
  2. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, (3), 407-414 (2001).
  3. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104, (4), e30-e41 (2009).
  4. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  5. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
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  7. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (1), 162-175 (2013).
  8. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, (12), 127-137 (2013).
  9. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28, (6), 611-615 (2010).
  10. Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17, (6), 1079-1085 (2008).
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Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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