Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Umane staminali pluripotenti indotte cellule derivate cardiomiociti (hiPSC-CMS) sono diventati una fonte di cellule importante per ovviare alla mancanza di cardiomiociti primari disponibili per applicazioni di ricerca e traslazionale di base. Per differenziare hiPSCs in cardiomiociti, sono stati sviluppati diversi protocolli tra cui corpo embrioide (EB) differenziazione basata e induzione fattore di crescita. Tuttavia, questi protocolli sono inefficienti e altamente variabili nella loro capacità di generare cardiomiociti purificati. Recentemente, una piccola molecola di base protocollo utilizzando la modulazione di Wnt / β-catenina ha mostrato di promuovere la differenziazione cardiaca con alta efficienza. Con questo protocollo, superiore al 50% -60% delle cellule differenziate erano cardiomiociti troponina-positivi cardiaca sono stati costantemente osservati. Per aumentare ulteriormente la purezza dei cardiomiociti, cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia eliminare specificamente non cardiomiociti basato sulla differenza metabolicas tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Usando questa strategia di selezione, abbiamo costantemente ottenuto un aumento superiore al 30% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti in una popolazione di cellule differenziate. Questi cardiomiociti altamente purificati dovrebbero migliorare l'affidabilità dei risultati di umana iPSC-based in studi di modellazione della malattia in vitro e test di screening di stupefacenti.
Cardiomiociti umani primari sono difficili da ottenere a causa della necessità di biopsie cardiache invasive, difficoltà di dissociare di singole cellule, ed a causa della scarsa sopravvivenza cellulare a lungo termine in cultura. Data questa mancanza di cardiomiociti umani primari, umano indotto staminali pluripotenti cardiomiociti derivato dalle cellule specifiche del paziente tecnologia (hiPSC-CM) è stata considerata come una potente fonte cardiomiociti alternativa per la ricerca di base e applicazioni cliniche e traslazionali come la modellazione della malattia e della droga discovery 1. I primi sforzi di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cardiomiociti impiegati protocolli di differenziamento utilizzando corpi embrionali (EBS), ma questo metodo è inefficiente in cardiomiociti producono perché spesso meno del 25% delle cellule in un EB sono battendo cardiomiociti 2,3. Comparativamente, un protocollo di differenziazione basata monostrato-utilizzando le citochine activina A e BMP4 visualizzato un rendimento superiore EBs, maquesto protocollo è ancora relativamente inefficiente, fattori di crescita richiede costosi, e funziona solo in un numero limitato di pluripotenti umana linee di cellule staminali 4. Recentemente, una, con sede a monostrato hiPSC protocollo di differenziazione dei cardiomiociti altamente efficiente è stato sviluppato attraverso la modulazione di segnalazione Wnt / β-catenina 5. Questi hiPSC-CM esprimere e alfa actinina due proteine sarcomeriche che sono marcatori standard di cardiomiociti 6 troponina cardiaca T,. Il protocollo descrivere qui è un adattamento di questo piccolo basato molecola, alimentatore libera cellulare, differenziamento monostrato metodo 5,7. Siamo in grado di ottenere battendo cardiomiociti da hiPSCs dopo 7-10 giorni (Figura 1). Tuttavia, a seguito di una differenziazione cardiomiociti conseguente 50% battendo cellule, immunocolorazione costantemente dimostra l'esistenza di una popolazione di non-cardiomiociti che sono negativi per i marcatori specifici cardiomiociti come alfa-actinina e specifico cardiaco troponina-T. Per further purificare cardiomiociti ed eliminare non cardiomiociti, popolazioni eterogenee di cellule differenziate sono stati sottoposti al glucosio inedia trattandoli con un mezzo estremamente bassa coltura glucosio per più giorni (Figura 2). Questo trattamento elimina selettivamente non cardiomiociti dovuta alla capacità dei cardiomiociti, ma non non-cardiomiociti, a metabolizzare lattato come fonte di energia primaria per sopravvivere in un ambiente a bassa glucosio 8. Dopo questa fase di purificazione, un aumento del 40% del rapporto di cardiomiociti ai non cardiomiociti si osserva, (Figura 3, Figura 4) e queste cellule può essere utilizzato per downstream analisi di espressione genica, modelli di malattia, e saggi di screening di stupefacenti.
Ottenere una grande quantità di cardiomiociti hiPSC derivato altamente purificate è critica per la ricerca cardiaca base e applicazioni cliniche e traslazionali. Protocolli differenziazione cardiaca hanno subito enormi miglioramenti negli ultimi anni, la transizione dai metodi basati corpo embrioidi utilizzano fattori di crescita cardiogeno 2, alla matrice metodi a sandwich 12, e infine a piccole metodi basati monostrato molecola-modulato e 5. Tra i protocolli di cui sopra, il protocol…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Name | Company | Catalog number |
Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
DMSO | Sigma | D-2650 |
ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
IWR1 | Sigma | I0161 |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |