Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMS) har blitt en viktig celle kilde for å løse mangelen på primær kardiomyocytter tilgjengelige for grunnforskning og translasjonsforskning applikasjoner. For å skille hiPSCs inn kardiomyocytter, har ulike protokoller inkludert embryoid kroppen (EB) -basert differensiering og vekstfaktor induksjon blitt utviklet. Disse protokollene er ineffektiv og meget variabel i deres evne til å generere rensede kardiomyocytter. Nylig ble et lite molekyl-basert protokoll benytter modulering av Wnt / β-catenin signale vist seg å fremme differensiering hjerte med høy effektivitet. Med denne protokoll, var større enn 50% -60% av differensierte celler hjerte troponin-positive kardiomyocytter ble konsekvent observert. For ytterligere å øke cardiomyocyte renhet ble de differensierte cellene utsettes for glukose sult for spesifikt å eliminere ikke-kardiomyocytter basert på den metabolske forskjellens mellom cardiomyocytes og ikke-kardiomyocytter. Ved hjelp av dette valget strategi, vi konsekvent fått en større enn 30% økning i forholdet mellom kardiomyocytter til ikke-cardiomyocytes i en populasjon av differensierte celler. Disse høyt rensede kardiomyocytter bør forbedre påliteligheten av resultatene fra menneskelig IPSC-basert in vitro sykdom modelleringsstudier og narkotika screening-analyser.
Primære humane kardiomyocytter er vanskelig å oppnå på grunn av kravet til invasive biopsier, vanskeligheter med å dissosiere til enkeltceller, og på grunn av dårlig langtidscelleoverlevelse i kultur. Gitt denne mangel på primære humane kardiomyocytter, pasient-spesifikke menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknologi har vært ansett som en kraftig alternativ cardiomyocyte kilde for grunnforskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner som sykdom modellering og narkotika oppdagelse en. Tidlig innsats i å differensiere pluripotente stamceller inn kardiomyocytter ansatt differensiering protokoller ved hjelp av embryoid organer (EBS), men denne metoden er ineffektiv i produserende cardiomyocytes fordi ofte mindre enn 25% av cellene i en EB er juling cardiomyocytes 2,3. Relativt, en monolayer basert differensiering protokollen ved hjelp av cytokiner aktivin A og BMP4 vises en høyere virkningsgrad enn EBS, mendenne protokollen er fortsatt relativt ineffektiv, krever dyre vekstfaktorer, og fungerer kun i et begrenset antall menneskelige pluripotente stamcellelinjer 4. Nylig ble en svært effektiv, hiPSC monolayer-basert cardiomyocyte differensiering protokoll utviklet av moduler Wnt / β-catenin signale 5. Disse hiPSC-CMs uttrykke hjerte troponin T og alfa actinin, to sarcomeric proteiner som er standard markører for kardiomyocytter 6. Protokollen beskriver her er en tilpasning av denne lite molekyl-baserte, mater celle-fri, mono differensiering metode 5,7. Vi er i stand til å få juling cardiomyocytes fra hiPSCs etter 7-10 dager (Figur 1). Imidlertid, etter en cardiomyocyte differensiering som resulterer i 50% av stolpene celler, farging konsekvent viser eksistensen av en populasjon av ikke-kardiomyocytter som er negative for cardiomyocyte-spesifikke markører så som hjertespesifikk troponin T og alfa-actinin. Til further rense kardiomyocytter og eliminere ikke-kardiomyocytter, ble heterogene differensierte cellepopulasjoner kastet glukose sult ved å behandle dem med en ekstremt lav glukosekulturmedium for flere dager (figur 2). Denne behandling selektivt eliminerer ikke-kardiomyocytter på grunn av evnen til kardiomyocytter, men ikke ikke-kardiomyocytter, for å forbrenne laktat som den primære energikilde for å overleve i et lavt glukose miljø 8. Etter dette rensetrinnet, er en 40% økning i forholdet av kardiomyocytter til ikke-kardiomyocytter observert (figur 3, figur 4), og disse celler kan brukes til nedstrøms genekspresjonsanalyser, sykdoms modellering og medikamentscreeningsanalyser.
Innhenting av en stor mengde høyt rensede hiPSC-avledet cardiomyocytes er kritisk for grunnleggende hjerte forskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner. Hjerte differensiering protokoller har gjennomgått store forbedringer de siste årene, overgangen fra embryoid body-baserte metoder benytter kardiovekstfaktorer 2, til matrise sandwich-metoder 12, og til slutt til små molekyl-modulert og monolayer-baserte metoder fem. Av de nevnte protokoller, protokollen som er besk…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Name | Company | Catalog number |
Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
DMSO | Sigma | D-2650 |
ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
IWR1 | Sigma | I0161 |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |