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Developmental Biology

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

-Tronco pluripotentes derivadas de células cardiomiócitos Humanos induzida (hiPSC-CMS) tornaram-se uma importante fonte de células para suprir a falta de cardiomiócitos primários disponíveis para aplicações de pesquisa básica e translacional. Para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos, vários protocolos, incluindo corpo embryoid (EB) diferenciação baseada e indução do fator de crescimento têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são ineficientes e altamente variáveis ​​na sua capacidade para gerar cardiomiócitos purificadas. Recentemente, uma pequena protocolo utilizando modulação baseada molécula de sinalização Wnt / β-catenina foi mostrado para promover a diferenciação cardíaca com alta eficiência. Com este protocolo, superior a 50% -60% de células diferenciadas foram cardiomiócitos troponina positiva cardíacos foram observados de forma consistente. Para aumentar ainda mais a pureza de cardiomiócitos, as células diferenciadas foram sujeitas a inanição glicose para eliminar especificamente não-cardiomiócitos com base na diferença metabólicas entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Utilizando esta estratégia de selecção, que, consistentemente, obtido um aumento superior a 30% na proporção de cardiomiócitos a não cardiomiócitos em uma população de células diferenciadas. Estes cardiomiócitos altamente purificadas deverão aumentar a confiabilidade dos resultados de humano com base em estudos de modelagem em iPSC doença in vitro e testes de rastreio de drogas.

Introduction

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Cardiomiócitos primários humanos são difíceis de obter devido à exigência de biópsias cardíacas invasivos, dificuldade em se dissociar para células individuais, e por causa da sobrevivência celular a longo prazo pobre em cultura. Devido a esta falta de cardiomiócitos humanos primários, induzida pelo homem-tronco pluripotentes cardiomiócitos derivados de células específicas do paciente tecnologia (hiPSC-CM) tem sido considerado como uma fonte de cardiomiócitos alternativa poderosa para a pesquisa básica, bem como as aplicações clínicas e translacionais como modelagem de doença e drogas descoberta 1. Os esforços iniciais em diferenciação de células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos empregues protocolos de diferenciação, usando corpos embrióides (EBS), mas este método é ineficiente porque em cardiomiócitos que produzem muitas vezes menos do que 25% de células em um EB são batendo cardiomiócitos 2,3. Comparativamente, um protocolo de diferenciação com base em monocamada utilizando as citocinas activina A e BMP4 exibida uma maior eficiência do que as EBs, maseste protocolo ainda é relativamente ineficiente, requer fatores de crescimento caros, e só funciona em um número limitado de pluripotentes humanas linhas de células estaminais 4. Recentemente, um protocolo de diferenciação de cardiomiócitos com base em monocamada hiPSC altamente eficiente foi desenvolvido pela modulação da sinalização de Wnt / β-catenina 5. Estes hiPSC-CMs expressar troponina T cardíaca e alfa actinina, duas proteínas sarcoméricas que são marcadores padrão de cardiomiócitos 6. O protocolo de descrever aqui é uma adaptação deste pequeno-base molécula, alimentador de célula livre, diferenciação monocamada método 5,7. Nós somos capazes de obter bater cardiomiócitos de hiPSCs após 7-10 dias (Figura 1). No entanto, seguindo uma diferenciação de cardiomiócitos resultando em 50% de células batendo, de forma consistente imunomarcação mostra a existência de uma população de cardiomiócitos que não são negativas para os marcadores específicos de cardiomiócitos, tais como a troponina T cardíaca específica e alfa-actinina. Para further purificar cardiomiócitos e eliminar não-cardiomiócitos, populações heterogéneas de células diferenciadas foram submetidos a jejum de glucose, tratando-os com um meio extremamente baixo de glucose para a cultura de vários dias (Figura 2). Este tratamento elimina selectivamente não-cardiomiócitos, devido à capacidade de cardiomiócitos, mas não não-cardiomiócitos, para metabolizar lactato como fonte de energia primária, a fim de sobreviver em um ambiente de baixa glicose 8. Após esta fase de purificação, é observado um aumento de 40% na proporção de cardiomiócitos para não-cardiomiócitos, (Figura 3, Figura 4) e estas células podem ser utilizadas para análise da expressão do gene a jusante, modelagem doença, e ensaios de rastreio de drogas.

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Protocol

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NOTA: As informações fornecedor para todos os reagentes utilizados neste protocolo foi listado na Tabela 1 e Lista de Materiais. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células têm de ser estéreis e técnica asséptica deve ser utilizado em conformidade. Executar todas as incubações de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2, a menos que especificado de outra forma. Neste protocolo, todas as diferenças são realizadas em placas de 6 poços, em que os hiPSCs são semeadas. Seguindo diferenciação e purificação, as células podem ser dissociadas e plaqueadas novamente para uso a jusante.

1. Preparação Médio

  1. Para a forma E8, fazer uma solução estoque de cada componente de suporte (NaHCO3, ácido L-ascórbico 2-fosfato, selenito de sódio, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e armazenar as soluções a -20 ° C. Adicionar uma quantidade adequada de soluções de ações para a garrafa de DMEM / F12 e filtrar para esterilizar. A solução concentrção e configuração de reação para os componentes de ações e médio E8 podem ser encontrados na Tabela 1.
  2. Para a solução de matriz extracelular, descongelar a matriz da membrana basal (geralmente fornecido a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel é vulgarmente utilizado para a cultura de células estaminais pluripotentes porque as células estaminais pluripotentes humanas podem aderir bem a esse material, utilizando a alfa-6-beta-1 integrina 9. Uma vez descongelado, fazer 2,25 mg (250 ul) alíquotas em gelo usando pontas de pipetas de gelo frio e os tubos e armazenar as alíquotas a -80 ° C.
    1. Quando pré-revestimento de placas com ECMS, descongelar e Alíquota da solução matriz extracelular (ECMS) em gelo. Misture a ECMS e meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200 em gelo. Manter a calma para evitar a solidificação prematura ECMS.
  3. Para o RPMI / B27 sem meio de insulina, adicione 10 ml de B27 Minus Insulina em 500 ml de meio RPMI.
  4. Para o RPMI / B27 (com insulina) médio, adicione 10 ml de B27 Supplement (com insulin) e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI.
  5. Para o médio glicose baixa, adicione 10 ml de B27 Supplement e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI livre de glicose.
  6. Para a forma / a criopreservação de congelação, mistura de soro fetal bovino, juntamente com dimetilsulfóxido (DMSO) a uma proporção de 9: 1. O meio de congelação podem ser armazenadas até 1 mês a 4 ° C.
    NOTA: Todos os meios devem ser filtrado e armazenado a 4 ° C e utilizadas dentro de 2 semanas a menos que especificado de outra forma. Todos os volumes de reagente / solução usados ​​abaixo destinam-se a um único poço em uma placa de 6 poços, salvo indicação em contrário.

2. Pré-revestimento de placas de 6 poços com ECMS

  1. Adicione ECMS misturando matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) com meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200, em seguida, aplicam-se 2 ml de ECMS acabado de fazer a cada poço para uma placa de 6 poços. Cada poço de uma placa de 6 poços receberá aproximadamente 90 mg ECMS.
  2. Incubar a ECMS placas revestidas durante 1 hora a 37 ° C. Imediatamente antes do plaqueamento das células, aspirado de solução DMEM / F12 de cada poço. As placas então estará pronta para receber células.

3. o descongelamento das hiPSCs congelados

NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante da hiPSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento.

  1. Descongelar um frasco de hiPSCs para cada poço de uma placa de 6 poços. Prepare um tubo de 15 ml com 9 ml de meio frio E8 com inibidor ROCHA (10 mM) para cada frasco. Inibidor ROCHA melhora hiPSCs sobrevivência após a criopreservação 10. Manter os frascos em 37 ° C banho de água para descongelar as células até um aproximadamente 5 mm de diâmetro de cristais de gelo é deixado.
  2. Pulverizar o exterior dos frascos com etanol a 70%. Limpe os frascos com papel de seda antes de movê-los para a capa laminar estéril.
  3. Transferem-se as células para dentro do tubo cónico preparado. Enxágüe tele frasco uma vez com 500 ul de meio E8 e transferir o meio contendo as células descongeladas para o mesmo tubo cónico. Centrifuga-se a TA, durante 4 minutos a 200 x g.
  4. Aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender cuidadosamente a pelete de células com 2 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Transferem-se as células em suspensão para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestidos com ECMS.
  5. Substitua o meio com meio E8 sem inibidor ROCHA após 24 horas de cultivo. As células devem ter aderido a essa altura.

4. Passaging de hiPSCs

  1. Tipicamente, hiPSCs passagem depois de atingir 75% -80% de confluência numa placa de 6 poços. Aspirar o meio de cultura. Lavar rapidamente poços com 1 ml de solução estéril, RT PBS. Aspirar PBS.
    1. Adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM ou solução 1x separação celular (por exemplo, Accutase) e incubar durante 1-7 minutos à temperatura ambiente. Momento adequado para EDTA de incubação varia de acordo com a linha hiPSC. Esperar para ver o visível ondulaçãor espessamento de colónias em torno das bordas, como isto indicará que a solução de EDTA ou separação celular está pronto para ser removido.
  2. Aspirar o EDTA ou o desprendimento de células solução. Adicionar 1 ml de meio suplementado com 10 E8 uM inibidor ROCHA. Deslocar colônias hiPSC no poço pipetando repetidamente cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias deve ser dividido em 10/05 aglomerados de células após a conclusão.
  3. Transferem-se as colónias que são suspensos em 1 ml de meio com E8 inibidor ROCHA em um tubo de 15 ml.
  4. Disrupt os grandes aglomerados de células em pequenos aglomerados no meio E8. Adicionar um volume adequado de meios E8 com inibidor para a suspensão de células para diluir as células. O volume do meio para adicionar para diluição depende da densidade celular e o número de poços para ser semeada. Idealmente, uma única, 80% confluentes poço de hiPSCs devem ser diluídas 1:12.
    1. Adicionar 11 ml de meio E8 com inibidor de pedra para o 1 ml existentes de cell solução acima mencionado em 15 ml de tubo cónica para obter uma diluição de 1:12.
  5. Além disso triturar os aglomerados de células em fragmentos de células pequenas (cerca de 50-200 células em cada fragmento é melhor). Evite o excesso de trituração, pois isso reduz a sobrevivência da célula.
  6. Aspirar ECMS das placas pré-revestidas e adicionar 2 ml de células ressuspensas em cada poço. Cerca de 100.000 células por poço de uma placa de 6 poços é ideal. Destinam-se a distribuir as células uniformemente em torno do poço para evitar a aglomeração de células no centro do poço.
  7. Após 24 h de cultura, substituir o meio com meio E8 sem inibidor ROCK. Alterar o meio de cultura a cada 24 horas até que as células tornam-se 80% confluentes. Em seguida, as células estão prontas para passagem de novo. Ele normalmente leva 3-6 dias entre as passagens para chegar a 80% de confluência.

5. hiPSCs Congelamento

NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante do quadrilSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento.

  1. Rotular tubos criogênicos com o nome da linha celular, tipo de célula, número de passagens, e data de congelamento. Como orientação geral, utilizar um frasco para cada poço de uma placa de 6 poços. Preparar um tubo de 15 ml cheio com 9 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Prepare meio com FBS a 90% e DMSO a 10% frio, e manter o meio a 4 ° C até estar pronto para usar.
  2. Aspirar o meio de cultura, adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM, solução ou separação celular 1x e incubar durante 2-7 minutos à temperatura ambiente. A duração da exposição à solução de EDTA ou desprendimento de células varia de linha celular para linha celular.
  3. Aspirar solução de EDTA ou separação celular. Adicionar 1 ml de meio E8.
  4. Deslocar colônias hiPSC no bem por pipetagem cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias não deve ser quebrado em menor que 100 aglomerados de células. Transfira as células em suspensão para o tubo cônico preparado contendo E8. Centrifugar a RT durante 4 minutos a 200 x g.
  5. Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 uL de meio de congelação frio ao sedimento. Ressuspender o sedimento por pipetagem de uma a duas vezes. A sobrevivência celular é melhorado mantendo as células em grandes aglomerados.
  6. Transferem-se as células ressuspensas para um tubo criogénico marcado. Mover-se rapidamente os frascos num recipiente de congelamento contendo isopropanol, o que vai permitir o resfriamento gradual. Manter o recipiente com as células a -80 ° C durante 24 hr, em seguida, transferir as células em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.

6. Cardiac Diferenciação de iPSC Humano

NOTA: Todos os meios devem ser, pelo menos em RT quando adicionado.

  1. Depois de dissociação com solução descolamento EDTA ou 1x celular, sementes aproximadamente 100.000 iPSCs humanos na ECMS revestidas placas de cultura de 6 poços de diferenciação (mesmos passos como procedimentos Passaging celular). Quando as células chegar a 85% de confluência, mudar o meio de RPMI / B27 sem meio de insulina com 6? M CHIR99021 inibidor GSK3-beta (CHIR) e manter durante 48 horas.
  2. Após 48 horas, substituir o meio de cultura contendo CHIR- com RPMI / B27 sem meio de insulina e deixar sozinho por 24 horas (até dia 3).
  3. No dia 3, alterar a mídia para RPMI / B27 sem insulina com 5 � Wnt inibidor IWR1 e manter durante 48 horas (até o dia 5).
    NOTA: Wnt inibição também pode ser tentada com outros compostos de moléculas pequenas, tal como descrito em estudos anteriores 11. IWR1 foi seleccionado para outros inibidores de moléculas pequenas de Wnt, devido ao aumento da gama em que se tem demonstrado ser eficaz na inibição da sinalização de Wnt 11.
  4. No dia 5, mudar o meio de volta para RPMI / B27 sem meio de insulina e deixe por 48 horas (até dia 7).
  5. No dia 7, substituir o meio com meio RPMI / B27 (com insulina) e substituir meio a cada 3 dias depois com a mesma forma. Surra espontânea de cardiomiócitos deve ser a primeira visível aproximadamente no dia 8 ao dia10.

7. Purificação de Cardiomyocytes Humanos por inanição Glucose

  1. No dia 10 pós-diferenciação, alterar o meio em cada poço da placa de 6 poços a 2 ml de meio de baixo teor de glucose e manter as células neste meio durante 3 dias (até ao dia 13).
  2. No dia 13, o retorno células de meio RPMI / B27 (com insulina).
  3. Opcionalmente, replate cardiomiócitos antes da segunda rodada de fome glucose para ajudar a soltar os não-cardiomiócitos da placa de cultura, permitindo a fácil dissociação dos não-cardiomiócitos durante a inanição glucose.
    1. No dia 13, o meio aspirado, lavar uma vez com PBS, e dissociar as células em células individuais utilizando 500 ul da enzima de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Especificamente, após 5 min de tratamento com enzima, utilizar uma pipeta de 1000 ul de dissociar cardiomiócitos manualmente a partir da placa de 6 poços, puxando-se repetidamente a enzima dissociação celular e pulverizando-a contra o cardiomyomonocamada cyte. Até 30 repetições de pipetagem pode ser necessária para dissociar os cardiomiócitos em células individuais.
    2. Depois as células são dissociadas e estão na forma de uma única célula, recolher todas as células num tubo de 15 ml cheia com 5 ml de meio RPMI / B27 com insulina para diluir a enzima dissociação celular e centrifugar durante 4 minutos a 200 x g. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
    3. Re-suspender as células com 2 ml de RPMI / meio B27 e placa para um novo ECMS-revestido placa de 6 poços. Normalmente, maior confluência de cardiomiócitos ajuda com a sobrevivência das células durante repique. Destinam-se a replate 2 milhões de células por nova 6 poços prato para a sobrevivência ideal durante repique.
  4. No dia 14, mudar o meio de volta para 2 ml de meio de baixo teor de glucose para um segundo ciclo de privação de glicose. Cultura as células neste estado glicose baixa para mais de 3 dias. A maioria dos cardiomiócitos não vai morrer nesta condição cultura pobre em glucose.
  5. No dia 17, para alterar a forma de R 2 mlMédio PMI / B27 com insulina. As células remanescentes serão cardiomiócitos altamente purificadas. Estes cardiomiócitos pode ser usado para a análise da expressão do gene, o rastreio de drogas, análise metabólica, e vários outros ensaios a jusante.

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Representative Results

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As alterações morfológicas durante a diferenciação hiPSC.

O hiPSC cultivadas em placas de livre-de alimentação cresceu como planas, colônias bidimensionais. Ao atingir cerca de 85% de confluência, hiPSCs foram tratados com 6 uM CHIR para diferenciação (Figura 1A). Quantidades substanciais de morte celular, um fenômeno normal e comum, foram observados após 24 horas de tratamento CHIR. Depois de dois dias de tratamento com CHIR, os hiPSCs continuaram a diferenciar para um destino da mesoderme. Em comparação com as células em colónias hiPSC, o tamanho das células para essas células aumentou 2 dias. O número de células aumentou também através da divisão celular (Figura 1B). No dia 5, as células mesodérmicas foram direcionados para a linhagem cardíaca (mesoderme cardíaca). Neste momento, as células começam a coalescer e formar, estruturas características ramo semelhante (Figura 1C). No dia 10, as estruturas do ramo-like foram altamente pronunciado, e cardiomiócitos estrelated batendo espontaneamente (Figura 1D). Cardiomiócitos terminalmente diferenciadas não irão proliferar além deste ponto. A linha do tempo do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 2.

Immunostaining e citometria de fluxo resultados mostraram cardiomiócitos foram purificados com fome glucose.

Após 10 dias de diferenciação, mais de 50% de áreas de células são de bater. No entanto, folhas de células que batem às vezes também são misturados com os não-cardiomiócitos. Para examinar cardiomyocyte pureza, as células com immunostaining contra cardiomyocyte marcador troponina-T (TnT) foram caracterizados ao descobrir que a maioria das células foram TnT positiva. No entanto, numa população de células diferenciadas não purificada, de um número de células também não tinham expressão de TnT, sugerindo a presença de não-cardiomiócitos nesta população diferenciada no dia 13 (Figura 3A). No entanto, com inanição de glucose,quase todas as células restantes eram TnT positiva no dia 13 (Figura 3B), indicando purificação bem sucedida dos cardiomiócitos seguinte inanição glicose. Estes dados foram ainda confirmada utilizando análise de citometria de fluxo. Uma população de células diferenciadas no dia 13 pós-diferenciação continha, aproximadamente, 50% TNNT2 + células quando não esfomeados glucose (Figura 4A). A diferenciação paralela também foi realizada, mas com uma privação de glicose três dias começando no dia 10 após a diferenciação. Em contraste com a diferenciação unstarved, privação de glucose conduziu a uma população purificada de células contendo 90% TNNT2 + no dia 13 (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1. As alterações morfológicas sequenciais durante hiPSC diferenciação para a linhagem cardíaca. (A) hiPSCs indiferenciadasno dia 0 exposição colônia típica morfologia e atingiu cerca de 85% de confluência. (B) No dia 2, as células após o tratamento com CHIR durante dois dias atingiu 100% de confluência e entrou na linhagem mesodérmica. (C) No dia 5, as células após o tratamento com IWR1 durante 2 dias entrou na fase mesoderme cardíaca. Algumas células começaram a se fundir e formar morfologias ramo-como características (indicadas pelas setas). (D) No dia 10/07, as estruturas do ramo-like são altamente evidente, e cardiomiócitos começar a bater espontaneamente. Bar = 200 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Timeline do protocolo de diferenciação hiPSC-CM e subsequente processo de inanição glucose. Batendo um cardiomiócitos re normalmente observado pela primeira vez em cerca de 7-10 dias. Duas rodadas de fome glucose irá resultar em uma população purificada de cardiomiócitos por dia 17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. imunofluorescência revela purificação de cardiomiócitos seguinte fome glucose. (A) células não purificados depois de 13 dias de diferenciação foram coradas com Cardiac troponina T (TnT). A maioria das células se diferenciaram em cardiomiócitos e foram TnT positiva, mas um número de células não cardíaca, TnT-negativo também estão presentes. (B) Em contraste, após um jejum de glucose 3 dias começando no dia 10, quase todas as células sobreviventes foram TnT positiva por dia 13. Barra de escala = 200 pm.ref = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Fluxo revela citometria de purificação de cardiomiócitos seguinte inanição glicose. (A) Depois de 13 dias de diferenciação cardíaca sem jejum de glucose, uma população de células exibiram cerca de 50% TNNT2 + cardiomiócitos. O vermelho indica que a população de células diferenciadas e azul indica hiPSCs indiferenciadas como um controlo negativo. (B) Depois de 10 dias de diferenciação cardíaca e seguido de 3 dias de jejum, a glicose, uma população de células a partir do mesmo lote de diferenciações foi purificado para conter 90% TNNT2 + cardiomiócitos. Por favor clique aqui paravisualizar uma versão maior desta figura.

As composições para forma E8
E8 Volume: 1 L Companhia Número de catálogo
DMEM / F12 com glutamina e HEPES 1000 ml Invitrogen 11330-032
NaHCO3 (7,5%, 75 mg / ml) 7,24 ml Invitrogen 25080-094
Ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg / ml) 1 mL Sigma A8960
selenito de sódio (70 ug / ml) 200 ul Sigma S5261
transferrina (50 mg / ml) 214 ul Sigma T3705
insulina (4 mg / ml) 5 ml Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 ng / ul) 500 ul Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 ng / ul) 20 ul Peprotech 100-21
As soluções estoque para composições E8
L-ácido ascórbico-2-fosfato (64 mg / ml) 3,2 g em 50 ml de água ultrapura, armazenamento de alíquotas de 500 uL a -20 ° C
Transferrina (50 mg / ml) 500 mg em 10 ml de água ultrapura, armazenamento de 107 mL alíquotas a -20 ° C
Selenito de sódio (70 ug / ml) Selenito de sódio 35 mg em 500 ml de água ultrapura, armazenamento de alíquotas de 100 uL a -20 ° C
FGF2 (200 ng / ul) 1 mg em 5 ml D- frioPBS, loja 250 mL alíquotas a -20 ° C
TGFB1 (100 ng / ul) 100 ug em 1 ml de ácido cítrico frio a 10 mM, pH 3, loja 10 mL alíquotas a -20 ° C

Tabela 1. Composição da E8 Médio.

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Discussion

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A obtenção de uma grande quantidade de derivados de cardiomiócitos hiPSC altamente purificadas é crítica para a investigação básica cardíaca, bem como aplicações clínicas e translacionais. Protocolos de diferenciação cardíacos tenham sido submetidos a enormes melhorias nos últimos anos, a transição de métodos baseados em corpo embri�des utilizando crescimento cardiogênico fatores 2, a matriz métodos sanduíche 12 e, finalmente, para as pequenas métodos baseados monocamada modulada-molécula e 5. Dos protocolos já citados acima, o protocolo descrito aqui apresentou o maior eo mais reprodutível eficiência diferenciação cardíaca para diferentes linhagens celulares hiPSC por modulação sinalização de Wnt / β-catenina usando as pequenas moléculas CHIR e IWR 5,7. Especificamente, os hiPSCs indiferenciadas foram induzidas para sofrerem diferenciação da mesoderme com o inibidor da GSK3 CHIR-beta e diferenciação cardíaca subsequente com o inibidor da sinalização de Wnt IWR1. Essas etapas seqüenciais deModulação de sinalização de Wnt, auxiliado pela depleção de insulina durante a fase de indução da linhagem cardíaca, levou a diferenciação cardíaca altamente eficiente. CHIR é uma pequena molécula inibidora da GSK3-beta comum utilizado para a indução mesodérmica, mas outras moléculas pequenas para a inibição da GSK3-beta foram testados em protocolos de diferenciação de cardiomiócitos 11. Várias opções também são usados ​​para a posterior pequena molécula inibidora Wnt. Por exemplo, uma publicação recente sobre a diferenciação quimicamente definido de células estaminais pluripotentes para cardiomiócitos utiliza 2 uM de Wnt-C59 para inibição de Wnt mesoderme cardíaca e eficaz de indução 11.

Além disso, os cardiomiócitos diferenciados, com um método de inanição glicose foram mais purificados, o que toma vantagem do metabolismo de glicose distinto de fluxo existente entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos 8. É essencial notar que a eficácia do método de inanição glicose é d-dependente ensity (ie, as diferenciações que produziram as maiores porcentagens de cardiomiócitos são mais propensos a alcançar uma maior sobrevivência dos cardiomiócitos). No entanto, a transição para o médio-baixo de glicose é também uma condição estressante para os cardiomiócitos. É importante para alterar as células de volta para o normal RPMI / B27 com meio de insulina após 3 dias de jejum, a glicose. Neste protocolo, um sistema de crescimento sem alimentador foi utilizado, no qual as células-tronco pluripotentes não foram cultivadas no alimentador fibroblastos de rato embrionárias (MEFs). No entanto, os protocolos de diferenciação cardíaco prévio têm utilizado sistemas baseados em alimentação para produzir cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes 5. Da mesma forma, também protocolos anteriores têm usado mTeSR1 meio para a manutenção de células estaminais, mas o sistema de meio livre de alimentador e E8 utilizado aqui é superior, devido à sua simplicidade e falta de excesso de componentes xenogénicos, tais como albumina de soro de bovino e fibroblastos de rato embrionários.

Actualmente,diferenciação de células estaminais pluripotentes em direcção linhagens de cardiomiócitos é em grande parte robusta, mas ainda sofre de variabilidade hiPSC linha-a-linha, em termos de eficiência. Esta continua a ser uma questão importante no campo diferenciação cardíaca e vai exigir um estudo mais aprofundado. A eficiência é melhorada pela diferenciação manutenção adequada de linhas hiPSC, e em particular, a prevenção overconfluency hiPSC durante a manutenção. Variabilidade adicional resulta do sementeira celular durante o processo de passagem em, como uma monocamada uniformemente semeadas de hiPSCs tende a dar origem aos melhores diferenciações globais. Aqui, um derivado do rato, ECMS baseados em Matrigel para semeadura de células durante a cultura de células foi utilizado com sucesso, mas uma eventual transição ao xeno-livres substratos é recomendado. Em relação à semeadura de células na ECMS, seeding irregular muitas vezes resulta em distribuição desigual de cardiomiócitos dentro de um poço particular. Por exemplo, se hiPSCs são semeadas de forma irregular, as arestas de um poço de uma placa de seis cavidades, podem dar origem a higseus números de cardiomiócitos que não o centro do poço. Estas condições de semeadura irregulares podem dar origem a diferenciações baixa eficiência e um maior número de não-cardiomiócito, derivados mesodérmicos tais como os fibroblastos e células musculares lisas. Observamos, também, que a diferenciação de baixa eficiência (abaixo de 50%) são muito mais difíceis de purificar usando o processo de privação de glicose mencionado aqui. Outro efeito colateral de fome glicose a longo prazo é uma perda potencial de viabilidade de cardiomiócitos. Embora os cardiomiócitos são capazes de metabolizar lactato na ausência de glicose, descobrimos que esta mudança para um ambiente de baixa glicose é estressante para as células. As células podem parar espontaneamente bater, e alguma perda de células pode ser observado se a fome glucose é prolongada para além do tempo recomendado. Este aumento da sensibilidade à privação de glicose pode ser reflexo da imaturidade do desenvolvimento, funcional, e eletrofisiológica bem estabelecida de haste cardiomyocy derivado de célulastes em relação ao verdadeiro adulto cardiomiócito 13.

Em resumo, o protocolo aqui descrito combina a, hiPSC monocamada método de diferenciação cardíaca com base em pequena molécula com um método de glicose inanição de cardiomiócitos de purificação. Este protocolo permite a geração reprodutível de cardiomiócitos altamente purificados e deve facilitar a vários ensaios relevantes a jusante para modelar doenças cardiovasculares e o rastreio de drogas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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