Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Вывод из высокоочищенных кардиомиоцитов из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием малой молекулы-модулированный Дифференциация и последующих глюкозы Голод

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Клеток получают кардиомиоциты плюрипотентные стволовые вызванных деятельностью человека (hiPSC-CMS) стали важным источником клеток для решения проблемы нехватки первичных кардиомиоцитов, доступных для фундаментальных исследований и трансляционных приложений. Чтобы дифференцировать hiPSCs в кардиомиоциты, различные протоколы, включая эмбриоидном тела (EB) основе дифференциации и индукции фактора роста были разработаны. Тем не менее, эти протоколы неэффективны и сильно варьирует в их способности генерировать очищенные кардиомиоциты. В последнее время, малая молекула на основе протокола использованием модуляции сигналов Wnt / β-катенин было показано, чтобы способствовать сердечной дифференциации с высокой эффективностью. С помощью этого протокола, более чем на 50% -60% дифференцированных клеток были сердечный тропонин-положительных кардиомиоциты последовательно наблюдалось. Для дальнейшего повышения чистоты кардиомиоцитов, дифференцированные клетки подвергали голоданию в глюкозу, чтобы специально исключить некардиомиоциты на основе метаболического разностис между кардиомиоцитов и некардиомиоциты. Используя эту стратегию выбора, мы последовательно получили увеличение более чем на 30% в соотношении кардиомиоцитов в некардиомиоциты в популяции дифференцированных клеток. Эти особо чистые кардиомиоциты должны повысить надежность результатов человеческой IPSC основе в пробирке исследования моделирования заболеваний и скрининга лекарственных средств анализов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, (6), 150 (2013).
  2. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, (3), 407-414 (2001).
  3. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104, (4), e30-e41 (2009).
  4. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  5. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  6. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115, (6), 556-566 (2014).
  7. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (1), 162-175 (2013).
  8. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, (12), 127-137 (2013).
  9. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28, (6), 611-615 (2010).
  10. Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17, (6), 1079-1085 (2008).
  11. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11, (8), 855-860 (2014).
  12. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  13. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
Вывод из высокоочищенных кардиомиоцитов из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием малой молекулы-модулированный Дифференциация и последующих глюкозы Голод
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter