Lepr<sup> Db</sup> Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
A diabetes tipo 2 é uma doença crónica que afecta 382 milhões de pessoas em 2013, e espera-se aumentar para 592 milhões até 2035 1. Durante as últimas duas décadas, o papel da disfunção da célula beta em diabetes tipo 2 tem sido claramente estabelecida 2. O progresso da pesquisa tem necessários métodos para o isolamento de ilhéus pancreáticos. O protocolo de isolamento de ilhotas apresentado aqui compartilha muitos passos comuns com protocolos de outros grupos, com algumas modificações para melhorar o rendimento e qualidade de ilhotas isoladas, tanto do tipo selvagem e db Lepr diabético (db / db) camundongos. Uma célula-vivo método de imagem 2-fótons é então apresentado que possa ser usado para investigar o controlo da secreção de insulina dentro de ilhotas.
Introduction
O papel da disfunção da célula beta em doenças tem sido amplamente reconhecida 3,4. As linhas celulares tais como o MIN6 e INS-1 são ferramentas úteis para compreender a biologia do comportamento das células beta. No entanto, o controlo fisiológico da secreção de insulina tem lugar dentro das ilhotas de Langerhans. Estas ilhotas conter milhares de células beta embaladas apertadamente, assim como os vasos sanguíneos e outros tipos de células endócrinas. Este ambiente dentro do ilhéu influencia a secreção de insulina e é provável que seja importante na diabetes. Portanto, para compreender o controlo fisiológico da secreção de insulina, e a patofisiologia da doença, que é essencial para estudar ilhotas intactas.
Isolamento de ilhotas
Ilhotas humanos vivos e, em particular, ilhotas humanas de pacientes com diabetes tipo 2 são difíceis de obter. Além disso, ilhotas humanos têm possibilidades limitadas de manipulação molecular experimental. Os investigadores têm, por conseguinte, é empreguepermite que a partir de animais e em modelos animais de diabetes do tipo 2. Um modelo de doença, tais é o rato db / db. Esta é uma mutação espontânea que os modelos de diabetes tipo 2 com uma progressão fenótipo que se aproxima bastante doença humana 5,6. O protocolo apresentado aqui para isolamento de ilhotas de ratos db / db diabéticos tem muitas etapas em comum com outros grupos com alguns refinamentos para melhor rendimento, purificação e aumento da sobrevida das ilhotas.
Imaging dois fótons
A célula de ensaio directo de 2-fótons descrito aqui permite aos investigadores para quantificar o número e avaliar as características de grânulos individuais contendo insulina a partir de células de muitos diabéticos do tipo selvagem e 7 ilhotas 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
O factor mais importante no isolamento de ilhotas é a perfusão inicial do pâncreas; sob um pâncreas perfundido resultados com um rendimento de ilhotas consideravelmente inferior. Outros factores também afectam a qualidade de isolamento, tais como o tempo de digestão e o nível de agitação que pode compensar parcialmente o nível de perfusão. Por exemplo, um pâncreas perfundido totalmente terá de ser incubadas a 37 ° C durante ~ 18 min 30 seg, agitando suavemente, em contraste sob uma digerido pâncreas pode …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
