Abstract
Type 2 diabetes is een chronische ziekte die 382 miljoen mensen in 2013, en zal naar verwachting 592 miljoen stijgen met 2035 1. In de afgelopen 2 decennia, de rol van de beta-cel disfunctie bij type 2 diabetes is duidelijk vastgesteld 2. Onderzoek vooruitgang vereist voor de isolering van pancreaseilandjes. Het protocol van het eilandje isolatie gepresenteerde heeft veel gemeen stappen protocollen van andere groepen, met enkele wijzigingen om de opbrengst en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes van zowel het wildtype en diabetische db LepR (db / db) muizen. Een levende cel 2-photon beeldvormingsmethode Vervolgens krijgt die gebruikt kan worden om de besturing van insulineafscheiding in eilandjes onderzoeken.
Introduction
De rol van de beta-cel disfunctie bij de ziekte is algemeen erkend 3,4. Cellijnen zoals MIN6 en INS-1 zijn nuttige hulpmiddelen om de biologie van beta cel gedrag te begrijpen. De fysiologische sturing van insulinesecretie vindt plaats in de eilandjes van Langerhans. Deze eilandjes bevatten duizenden dicht opeengepakte beta-cellen, alsmede bloedvaten en andere endocrine celsoorten. Deze omgeving binnen het eilandje invloed insulinesecretie en kan waarschijnlijk bij diabetes zijn. Daarom, om de fysiologische controle van insulinesecretie en de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, is het essentieel intacte eilandjes bestuderen.
Isolatie Islet
Levende menselijke eilandjes en in het bijzonder menselijke eilandjes aan type 2 diabetes patiënten moeilijk te verkrijgen. Bovendien humane eilandjes hebben beperkte mogelijkheden voor experimentele moleculaire manipulatie. Onderzoekers hebben daarom in dienst istermijn van dieren en dierlijke modellen van type 2 diabetes. Een dergelijke ziekte model is de db / db muis. Dit is een mutatie die spontane modellen Type 2 diabetes met een fenotype progressie die parallel loopt met menselijke ziekten 5,6. De hier gepresenteerde voor eilandje isolatie van diabetische db / db-muizen protocol vele trappen evenals andere groepen met een aantal verfijningen voor betere opbrengst, reiniging en verbeterde eilandje overleving.
2 foton imaging
De live-cell 2-foton assay hier beschreven stelt onderzoekers in staat om het aantal te kwantificeren en evalueren van de kenmerken van de single-insuline met korrels van veel cellen van diabetische 7 en wild type eilandjes 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle huidige experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale dierethiek procedures van de Universiteit van Queensland (door de Universiteit van Queensland, Anatomical Biosciences ethische commissie goedgekeurd).
1. Islet Isolatie
- Reagens voorbereiding
- Mengsel van enzymen
- Voor de pancreas spijsvertering, gebruik maken van een mengsel van Liberase en collagenase type IV. Verdunnen Liberase TL (thermolysine laag) 1 flacon van 5 mg met 26 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
- Bereid collagenase type IV in Hank's buffer bij een concentratie van 0,5 mg / ml, aangevuld met 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNase en 1 mg / ml runderserumalbumine.
- Meng de Liberase TL en collagenase oplossingen in een verhouding van 4: 1 (volumeverhouding), dwz 4 ml Liberase TL + 1 ml collagenase. Aliquot het mengsel van enzymen aan elke 2,5 ml en bewaar bij -20 ° C.
LET OP: Het weefsel incubatietijden vari een beetje tussen batches van enzym (30 sec tot 1 min verschil). Daarom kan een ladingsgewijze test vereist.
- Isolation RPMI Media
- Los één flacon van RPMI 1640 poeder in 1 liter water bij RT en aan te vullen met 2 g NaHCO 3, 4,02 g HEPES.
- Combineer de RPMI isolatiemedia in een grote erlenmeyer mengen met een magnetische roerder op pH 7,4 met NaOH, filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
- RPMI Cultuur Media
- Met RPMI kweekmedium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica (bijvoorbeeld, penicilline 100 U / ml, streptomycine 100 ug / ml).
- Mengsel van enzymen
- Islet Isolatie en kweken
- Animal Sacrifice
- Offer muizen door cervicale dislocatie of CO 2 stikken volgens ethische procedures van de lokale instelling. Spray de muis lichaam grondig met 70% ethanol.
- Pancreas perfusie
- Use 2 langssneden zijdelings door de buikhuid en peritoneum van een V-vormige flap maken. Trek de flap van de huid tot het gehele buikholte ontdekken, opzij zetten de darm en houden de lever in plaats van een gevouwen tissue papier om de galbuis afgeleid (figuren 1 en 2). Zet het dier zodat de kop naar de chirurg en de staart weg van de chirurg.
- Breng een vasculaire klem op de ampulla van de twaalfvingerige darm muur om de geïnjecteerde enzymen blokkeren die in de twaalfvingerige darm (Figuur 1).
NB: Dit is een belangrijke stap omdat het bepaalt of de geïnjecteerde enzymen in de pancreas duct zal gaan en perfuseren de alvleesklier of reflux aan de injectieplaats (meer dan klem) of ga in de twaalfvingerige darm (onder klem). - Canule de galbuis met een 31 G naald vlakbij de kruising van de ductus hepaticus en cystic duct (figuur 1) en laat ruimte voor een tweede injectie of the alvleesklier niet in slaagt om de eerste keer perfuseren. Langzaam (meer dan ~ 10 sec) injecteer ongeveer 2 ml koude enzymmengsel in de muis galbuis.
OPMERKING: De pancreas wordt snel geperfundeerd wanneer de klem zich in de juiste positie. - Pas de klem positie als de naald is in de galweg, maar kan de alvleesklier niet perfuseren (dwz., Overgaan tot de klem een beetje weg van de lever, indien meer dan geklemd of verplaats het een beetje aan de lever als onder geklemd).
OPMERKING: De naald gaat soms in het omgevende capsule niet de lumen van de buis. Een nuttige teken om te controleren of de naald zich in de ductus choledochus wordt de uitzetting van de leiding bij het injecteren. Indien de alvleesklier geen perfuseren, alternatief is het enzymmengsel kan worden geïnjecteerd om meerdere sites van de pancreas met lagere opbrengst verwacht. De perfusie van de linkerkant van de pancreas (de milt kwab) van belang voor maximalisatie van het eilandje opbrengst. - Nadat de pancreas perfused, snel te verwijderen van de alvleesklier, zet het in een flesje (~ 20 ml, glas) en incubeer gedurende ~ 19 minuten in een 37 ° C waterbad.
OPMERKING: De incubatietijd kan iets variëren afhankelijk van de muizenstam en leeftijd. - Na de incubatietijd, stopt het verteringsproces door toevoeging ~ 20 ml koud isolatiemedia. Schud het flesje voorzichtig aan de alvleesklier verstoren en giet het door een normaal theezeef (poriediameter van 1 mm) in een steriele 50 ml buis. Vul de buis met isolatiemedia en centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld.
- Los het pellet in de isolatiemedia telkens over naar twee 15 ml buisjes, centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld. Afzuiging het supernatant, meng de twee pellets goed met 6 ml dichtheidsgradiënt cellen scheidingsmedium (Histopaque 1077 oplossing) per buisje vortexen of en neer te pipetteren. Voeg voorzichtig ~ 6 ml van de isolatiemedia aan de zijkant van de buis bovenopde dichtheidsgradiënt scheidingsmedium en centrifugeer bij 100 xg gedurende 15 min bij 4 ° C met de rem uitgeschakeld.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in de bovenste (isolatie media), middelste en onderste (dichtheid gradiënt celscheiding media) laag in 3 afzonderlijke gerechten. Handpick de eilandjes in deze 3 gerechten met een pipet onder een stereomicroscoop.
OPMERKING: De middelste laag bevat de meeste van de eilandjes. Eilandjes worden als compacte structuren van -50 tot 500 urn in grootte (figuur 3). We krijgen ~ 200 eilandjes in WT-muizen en 300- <100 eilandjes in db / db-muizen.
- Islet kweken
- Om de eilandjes herstellen van de enzymdigestie cultuur groepen 40 eilandjes in een 25 cm petrischaal met 6 ml RPMI kweekmedium (10 mM glucose) bij 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 gedurende 2 dagen vóór levende 2-cel-foton beeldvorming. Verander dagelijks het kweekmedium.
- Animal Sacrifice
2. Live Cell 2-Photon Imaging
- Reagens Voorbereiding
- Extracellulaire Buffer
- Bereid de natrium- rijke extracellulaire buffer voor 2-foton assay met 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 en 10 mM HEPES.
- Extracellulaire Dye
- Voor de 2-photon assay bereiden stock SRB 8 mM in extracellulaire buffer, aliquot in kleine buisjes en bewaar bij -20 ° C. Verdun de voorraad SRB 01:10 in verse extracellulaire buffer om een werkende concentratie van 0,8 mm te krijgen.
- Extracellulaire Buffer
- foton Imaging
- Ten eerste, pre-incubeer 2 dagen gekweekt eilandjes in 3 mM glucose extracellulaire buffer gedurende 30 min.
NOTA BENE: Wij gebruiken eilandjes tussen de 2 en 5 dagen in de cultuur. - Plaats dan een glasplaatje op de thermo-regelkamer geplaatst op de microscoop podium. Gebruik vet aan het lekken van de oplossing te voorkomen.
- Bedek de kamer met 500 ul van extracellular buffer die 0,8 mM SRB met verschillende glucoseconcentraties (3 mM, 6 mM, 15 mM en 20 mM glucose).
- Plaats vervolgens de gepre-incubeerd eilandje in het midden van de kamer en zich op 3-4 cellagen in het eilandje waar in knaagdieren eilandjes, immunokleuring insulinebehoefte blijkt dat de meeste cellen beta-cellen.
LET OP: De SRB zal al het celmembraan van het eilandje snel schetsen en het eilandje is klaar om de afbeelding. - Gebruik een 2-foton microscoop met een 60X olie-immersie objectief (NA 1,42) en imaging software (bijv., Scanimage 11). Figuur 4 illustreert een typisch microscopie regeling. Afbeelding exocytische gebeurtenissen met SRB als een membraan impermeant fluorescerende extracellulaire marker opgewonden door femtoseconde laserpulsen op 880 nm, met fluorescentie gedetecteerd bij 550-650 nm. Noteer het eilandje respons op stimulatie.
- Identificeren enkele exocytose gebeurtenissen door de plotselinge verschijning van een kleine fluorescerende spot (resolutie 10 pixels /1; m) en bevestig door de snel stijgende fase van het fluorescerende signaal over een regio van belang (~ 0,78 micrometer 2).
- Ten eerste, pre-incubeer 2 dagen gekweekt eilandjes in 3 mM glucose extracellulaire buffer gedurende 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Islet opbrengst en zuivering
Voor een normale wild type muis, worden ongeveer 200 eilandjes verwacht. Gezonde eilandjes kijken helder, ronde en hebben een gladde rand. Een over-gedigereerde isolatie batch is vaak klein en fuzzy eilandjes terwijl een onder gedigereerd batch heeft minder eilandjes en acinaire cellen gevoegd eilandjes (Figuur 3). Bij diabetische db / db muizen, het eilandje opbrengst en uiterlijk afhankelijk van de progressie van de ziekte beter glykemische muizen groter, helderder en eilandjes (maximaal 300 eilandjes) vergeleken met slechtere glykemische muizen die kleiner eilandjes met een doorschijnend uiterlijk hebben (onder 100 eilandjes)
2-photon assay
2-foton beeldvorming is een indirecte assay insuline secretie gemeten op het niveau van afzonderlijke insuline granule fusion. In reactie op prikkels zoals glucose of hoog kaliumgehalte, insuline granules fuseren met de plasmamembraan en de extracellulaire SRB kleurstof komt the granules waardoor het uiterlijk van een plotselinge fluorescerende spot ~ 400 nm in diameter (figuur 5). Verschillende experimenten zijn uitgevoerd om deze test als een meting van fusie van insuline bevattende granules zoals glucose dosisafhankelijke van steeds meer granule fusiegebeurtenissen met de verwachte hoeveelheid insulinesecretie, de consistente grootte van de cellen reageerden in de 2 valideren foton met die van een beta-cel, de soortgelijke korreldiameter gemeten door de 2 foton en de elektronenmicroscoop, de colokalisatie van de kleurstofopname en insuline kleuring 8.
Binnen het moment van registratie worden alle exocytose gebeurtenissen als reactie op de stimulus worden geïdentificeerd en de locatie van de gebeurtenissen het tijdstip van het optreden, de duur en de aard van het fusie evenementen zoals kiss-and-run of volledige fusie kenmerk ( Figuur 5, 6). Deze kenmerken van het fusieproces zijn waardevol voor het beoordelen een defect in de granule fusie in modellen van type 2 diabetes. Onze eerdere rapport met deze werkwijze blijkt dat het defect bij diabetische db / db eilandjes is het verlies van de volledige korrel fusie en niet een wijziging van de eigenschappen van de kinetiek van individuele granule fusion 7. Verder laten we zien dat de grootste factor in de verminderde insulinesecretie in ziekte een afname van het aantal reagerende cellen 7.
Figuur 1:. Een diagram van de plaatsen van klem- en injectie Injecteer de enzymen om de galbuis dichtbij de verbinding van de ductus hepaticus en cystic duct. Klem de ampulla van Valter met een vasculaire klem op de geïnjecteerde enzym om de ductus pancreaticus vergemakkelijken.
2632fig2.jpg "/>
Figuur 2: het injectieproces in de muizen. Top afbeelding illustreert de naald in de galweg met een vasculaire klem toegepast op het ampulla van Valter. Bottom figuur toont de-Liberase geperfuseerde alvleesklier na injectie.
Figuur 3: Typische beelden van Wild type en db / db geïsoleerde eilandjes (A) Wildtype geïsoleerde eilandjes.. (B) db / db geïsoleerde eilandjes. (C) Onder-verteerd eilandjes met aangehechte acinaire cellen (pijlen). (D) Over-verteerd eilandjes met kleine en fuzzy eilandjes (pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. De belangrijkste onderdelen van de op maat gemaakte 2 foton microscoop Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld van een insuline granule samensmelting zoals die met 2 foton microscopie linker cijfer het cel vóór (A) en na (B) het uiterlijk van een exocytose-event (pijl) in respons op 15 mM glucose stimulatie.. (C) toont de SRB labeling met het invoeren van de extracellulaire SRB kleurstof in de granule als het gen met de plasmamembraan. (D) toont de fluorescentie-intensiteit op een gebied van belang van een exocytose gebeurtenis en de sequential beelden van deze exocytische event (schaal bar 1 micrometer). Afbeelding gewijzigd van Do et al 2014 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Reacties van het wildtype en diabetische db / db eilandjes onder 2-foton microscoop met SRB als extracellulaire kleurstof In deze experimenten insuline granule fusiegebeurtenissen in respons op 15 mM glucose stimulatie geregistreerd. Gele cirkels zijn sites van de exocytische gebeurtenissen gedurende 20 min van de opname. Afbeelding gewijzigd van Do et al 2014 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste factor bij het eilandje isolement de initiële perfusie van de pancreas; Een onder pancreas perfusie resulteert in een aanzienlijk lagere opbrengst eilandje. Andere factoren beïnvloeden ook de isolatie kwaliteit zoals destructietijd en de mate van schudden die gedeeltelijk kan compenseren voor het niveau van perfusie. Bijvoorbeeld, een volledig pancreas perfusie moeten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ~ 18 min 30 sec onder zacht schudden daarentegen een onder gedigereerd pancreas ~ 20 minuten digestie vereisen harder schudden. Het mengsel van twee verteringsenzymen in handen geeft betere eilandje isolatie dan één alleen. Voor de collagenase enige methode, de spijsvertering tijd kritisch invloed op het eilandje opbrengst en tijdsverschillen van slechts 30 sec kan drastisch beïnvloeden kwaliteit. Voor Liberase alleen het rendement acceptabel maar onder-digestie soms gebeurt, geloven wij dat de toevoeging van collagenase helpt het bindweefsel beter verteerbaar.
Er zijn een aantal mogelijke experimenten kunnen worden uitgevoerd nadat de eilandjes werden geïsoleerd. Geïsoleerde eilandjes kunnen paraformaldehyde of methanol direct na isolatie worden vastgesteld en gebruikt immunofluorescentie kleuring om de locatie van de eiwitten van belang 10 te bepalen. Geïsoleerde eilandjes kunnen gedispergeerd worden in enkelvoudige cellen. Dit kan op dezelfde dag eilandje isolatie of na enkele dagen eilandcellen kweek. De enkelvoudige cellen worden daarna uitgeplaat en het is dit preparaat dat de steunpilaar van technieken zoals patch clamp en totale interne reflectie microscopie is. In experimenten die meteninsulinesecretie, alsmede voor levende cellen 2-photon imaging, hebben wij gevonden dat eilandjes nodig 2 dagen in kweek om reproduceerbare informatie kan geven. Wat gebeurt er in de cultuur is niet goed begrepen, maar wordt gedacht aan een periode van herstel van de isolatie en de spijsvertering proces.
De 2-foton techniek hier gepresenteerde stelt onderzoekers in staat om de afbeelding van de insuline secretie proces op het niveau van individuele korrel fusie van vele cellen in intacte eilandjes. Wij hebben gevonden dat het aantal granule fusiegebeurtenissen evenals het tijdstip overeenkomt met het bedrag en tijdsprofiel van insulinesecretie 8. Dit suggereert de werkwijze detecteert de meeste insuline granule fusiegebeurtenissen. Gezien het feit dat de kleurstof vermelding in om de fuser korrels is niet een specifieke methode voor het opsporen van insuline korrel fusie evenementen die we tot het uiterste zijn gegaan om de controle-experimenten uit te voeren om dat insuline korrel fusie in beta-cellen aan te tonen worden bestudeerd 7,8
Er zijn een aantal technische problemen de 2-foton microscoop die algemeen voor alle beeldvormingsbenaderingen zijn. Bijvoorbeeld, we zorgvuldig de balans van de tegengestelde factoren van het proberen om voldoende licht te krijgen om de eilandjes, zodat we de winst van de detectoren kan verminderen, en dus lawaai te verminderen, met het assembleren van zoveel licht in om de eilandjes die we veroorzaken celbeschadiging. In het systeem wordt een Pockels cel gebruikt om de gepulste laser (figuur 3) te verzwakken; alle commerciële systemen hebben mechanismen om de intensiteit van licht dat valt op het model te veranderen.
Samengevat, de combinatie van zorgvuldige isolatie van db / db eilandjes en hele-eilandje 2 foton microscopie aanwezig nieuwe mogelijkheden om de processen van de insuline secretie te bestuderen en bepalen de belangrijkste defecte elementen in type 2 diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
